編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的啟動子的變體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及具有啟動子活性的分離的多核苷酸(編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的啟動子的變體);以及涉及生產和/或分泌精細化學品的微生物，所述微生物包含具有啟動子活性的分離的多核苷酸，其能使各種基因與特定的起始菌株相比過表達;以及涉及使用本發明的微生物制備制備精細化學品的方法。
【專利說明】編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的GAP基因的啟動子的變體
[0001]本發明涉及使用遺傳修飾的微生物來制備精細化學品的方法，在所述微生物中編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的啟動子的變體使各種基因能夠過表達。
現有技術
[0002]精細化學品(特別是指氨基酸、有機酸、維生素、核苷和核苷酸)被用于人類醫學，用于藥物、化妝和食品工業以及用于動物營養。
[0003]許多這些化合物是通過發酵棒狀桿菌的菌株來制備的，特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。由于非常重要，一直有努力在改善其生產方法。所述方法可以針對發酵相關的手段來進行改善，如例如，攪拌和氧氣供應，或者針對營養培養基的組成如例如發酵期間的糖濃度，或者針對產物形式的建立例如通過離子交換層析的手段，或者針對微生物本身的內在性能特征。
[0004]通過利用誘變、突變體的選擇和挑選的方法來改善這些微生物的性能特征。以此方式獲得了對于抗代謝物具抗性并產生化合物的菌株，所述抗代謝物如例如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸或者纈氨酸類似物2-噻唑丙氨酸，所述化合物例如L-氨基酸如L-賴氨或L-纈氨酸。
[0005]多年來，重組DNA技術的方法已同樣被用于改善產L-氨基酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株，其中通過例如 增強或減弱個體氨基酸生物合成基因，以及研究對所述化合物生產的作用。
[0006]關于谷氨酸棒狀桿菌的生物學、遺傳學和生物技術的總結可以參見“Handbook ofCorynebacterium glutamicum，，(Eds.:L.Eggeling和M.Bott,CRC Press,Taylor&Francis,2005), Journal of Biotechnology 的特刊中(主編:A.PUhle;r)題目為"A New Era inCorynebacterium glutamicum Biotechnology^(Journal of Biotechnology104/1-3,(2003)),以及 T.Scheper(總編輯)的書"Microbial Production of L-aminoacids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology79, Springer Verlag,Berlin, Germany, 2003)中。
[0007]谷氨酸棒狀桿菌基因組的核苷酸序列在Ikeda和Nakagawa的(AppliedMicrobiology and Biotechnology62,99-109 (2003))中，以及在 EP1108790 和 Kalinowski等人(Journal of Biotechno logy 104/1-3, (2003))中有描述。
[0008]谷氨酸棒狀桿菌基因組的核苷酸序列從National Library of Medicine(Bethesda, MD, USA)的 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的數據庫、從 DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan)、或者從 European MolecularBiologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany,和 Cambridge, UK)的核苷酸序列數
據庫獲得。
[0009]Patek et al (Journal of Biotechnologyl04, 311-323 (2003))已描述和分析了谷氨酸棒狀桿菌編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的天然啟動子。
[0010]在US2008/0050786 中，SEQ ID NO: 20 示出了稱作 seqP_RBS_20 的 484bp 的 DNA 分子，其含有包括了核糖體結合位點的gap基因的啟動子。此啟動子可有利地用于表達各種基因，如例如編碼天冬氨酸激酶的lysC基因，。為清楚起見，該序列被列為SEQ ID N0:1。
[0011]發明目標
[0012]本發明的目標是提供編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gap基因的啟動子和/或表達單元的變體，在所述變體的控制下，各種基因，如例如編碼天冬氨酸激酶的lysC基因可有利地表達。
[0013]發明描述
[0014]在進行本發明期間，發現SEQ ID勵:2所示的谷氨酸棒狀桿菌八了0:130328&?基因啟動子的活性，在用核堿基腺嘌呤置換所述啟動子位置362處的核堿基鳥嘌呤之后得到了提聞。 [0015]在如下核堿基的置換后，發現了啟動子活性的進一步提高:在SEQ ID N0:2所示的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032gap基因啟動子中用胸腺嘧啶置換位置265處的胞嘧啶、用胞嘧啶置換位置269處的鳥嘌呤、用胸腺嘧啶置換位置290處的腺嘌呤、和用腺嘌呤置換位置292處的鳥嘌呤。
[0016]因此，本發明涉及具有啟動子活性的分離的多核苷酸，其包含具有SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 34所示核苷酸序列的多核苷酸。
[0017]本發明還涉及具有啟動子活性的分離的多核苷酸，其基本由具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:34所示核苷酸序列的多核苷酸組成。術語〃基本〃在此背景中是指，長度不超過(<)1000、不超過(()800、不超過(()700、不超過(()600、不超過(<)500或不超過(< )400個核苷酸的多核苷酸，和長度不超過(()15000、不超過(()10000、不超過(07500、不超過(<)5000、不超過(02500、不超過(<)1000、不超過(()800、不超過(<)700、不超過(()600、不超過(<)500或不超過(()400個核苷酸的多核苷酸被分別加至SEQIDN0:3或SEQIDN0:34的多核苷酸的5'端和3'端。
[0018]兩項列舉中特征的任意有用組合都符合本文的發明。“有用組合”意指，例如導致實現有效重組的特征的組合。在要置換的DNA區域旁側用相同長度添加會有助于該區域在實驗過程中通過同源重組轉移。相對長的旁側同源區域對于環狀DNA分子之間的有效重組是有利的，但是置換載體的克隆會隨著旁側長度的增加而變得更困難(Wang等人，Molecular Biotechnology32:43-53 (2006))。因此，優選在每種情況中添加600至不超過(()1000個核苷酸的特定組合，而特別優選在每種情況中添加750-850個核苷酸。
[0019]本發明還涉及具有啟動子活性的分離的多核苷酸，其由SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:34所示的序列組成。
[0020]關于多核苷酸存在于生命體(如例如微生物)中的生物化學和化學結構的細節，可參見 Berg et al 的教科書 “Biochemie” [生物化學](Spektrum Akademischer VerlagHeidelberg.Berlin, Germany,2003;ISBN3-8274-1303-6)。
[0021]由含有核堿基或堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的脫氧核糖核酸單體組成的多核苷酸稱作脫氧核糖多核苷酸或脫氧核糖核酸(DNA)。由含有核堿基或堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖核酸單體組成的多核苷酸稱作核糖多核苷酸或核糖核酸(RNA)。所述多核苷酸中的單體通過3' —5'-磷酸二酯鍵彼此共價連接。[0022]“具有啟動子活性的多核苷酸”或“啟動子”意指多核苷酸(優選脫氧核糖多核苷酸)或核酸(優選脫氧核糖核酸(DNA))，其功能性地連接至要轉錄的多核苷酸并確定所述多核苷酸轉錄起始的點和頻率，由此能夠影響所控制的多核苷酸的表達強度。
[0023]由于DNA的雙鏈結構，與序列表的SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:34中鏈互補的鏈也同樣是本發明的對象。
[0024]“轉錄”意指從DNA模板開始產生互補RNA分子的過程。此過程中涉及諸如RNA聚合酶、“σ因子”和轉錄調節蛋白的蛋白。所合成的RNA(信使RNA，m-RNA)繼而在隨后產生多肽或蛋白的翻譯過程中用作模板。
[0025]從化學角度來看，基因是多核苷酸。編碼蛋白/多肽的多核苷酸在本文中與術語“基因”同義使用。相應地，“基因”和“編碼區”這兩個術語，以及“蛋白”和“多肽”這兩個術語也同義使用。
[0026]“功能性連接”在此背景中意指本發明的具有啟動子活性的多核苷酸與另外的寡核苷酸或多核苷酸的順序排列，其導致所述另外的多核苷酸的轉錄。
[0027]如果所述另外的多核苷酸是編碼多肽/蛋白的多核苷酸(在下文中稱作第二多核苷酸)并且由多肽的編碼區所組成、始于起始密碼子、包括終止密碼子、適宜時包括轉錄終止序列，則“功能性連接”意指本發明的具有啟動子活性的多核苷酸與第二多核苷酸的順序排列，其導致所述第二多核苷酸的轉錄以及所合成的RNA的翻譯。
[0028]第二多核苷酸編碼一或多個多肽。編碼蛋白/多肽的多核苷酸基本上由起始密碼子(選自ATG、GTG和TTG，優選ATG或GTG，特別優選ATG)、蛋白編碼序列和一或多個終止密碼子(選自TAA、TAG和TGA)組成。
[0029]如果第二多核苷酸編碼多個蛋白/多肽，每個基因之前可以有核糖體結合位點。在適宜的時候，終止序列位于最后一個基因的下游。
[0030]第二多核苷酸優選編碼精細化學品(優選選自成蛋白氨基酸、非成蛋白氨基酸、維生素、核苷、核苷酸和有機酸)生物合成途徑中的一或多種多肽或蛋白。特別優選成蛋白氨基酸、非成蛋白氨基酸和有機酸。
[0031]第二多核苷酸優選由EP1108790A2的表1中所列的一或多種多核苷酸所組成，該文獻援引加入本文。
[0032]第二多核苷酸優選由編碼磷酸戊糖途徑的酶的一或多種基因或多核苷酸所組成，所述酶選自:
[0033]a)編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的Zwf亞基(Zwf, EC N0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(zwf基因),
[0034]b)編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的OpcA亞基(0pcA，EC N0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(opcA基因)，
[0035]c)編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶(DevB,EC N0.:3.1.1.31)的多核苷酸(devB基因)，
[0036]d)編碼轉酮醇酶(Tkt, EC N0.:2.2.1.1)的多核苷酸(tkt基因)，
[0037]e)編碼轉醛醇酶(Tal, EC N0.:2.2.1.2)的多核苷酸(tal基因)，
[0038]f)編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(Gnd，EC N0.: 1.1.1.44)的多核苷酸(gnd基因)，
[0039]g)編碼核酮糖磷酸3-差向異構酶(Rpe, EC N0.:5.1.3.1)的多核苷酸(rpe基因)，和[0040]h)編碼核糖-5-磷酸異構酶B (Rpi，EC N0.:5.3.1.6)的多核苷酸(rpi基因)，[0041 ] 特別優選zwf和opcA基因。
[0042]第二多核苷酸優選由編碼糖回補和糖異生的酶的一或多種基因或多核苷酸所組成，所述酶選自:
[0043]i)編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc, EC N0.:4.1.1.31)的多核苷酸(ppc基因)，
[0044]j)編碼果糖1，6- 二磷酸酶(Fbp, EC N0.:3.1.3.11)的多核苷酸(fbp基因)，和
[0045]k)編碼丙酮酸羧化酶(Pyc,EC N0.:6.4.1.1)的多核苷酸(pyc基因)，特別優選pyc基因。
[0046]涉及L-賴氨酸的制備，第二多核苷酸優選由編碼L-賴氨酸生物合成的酶的一或多種基因或多核苷酸所組成，所述酶選自:
[0047]1)編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DapA，EC N0.:4.2.1.52)的多核苷酸(dapA基因)，
[0048]m)編碼天冬氨酸-半醒脫氫酶(Asd, EC N0.:1.2.1.11)的多核苷酸(asd基因)，
[0049]η)編碼內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(Ddh, EC N0.: 1.4.1.16)的多核苷酸(ddh基因)，
[0050]ο)編碼二 氨基庚酸脫羧酶(LysA，EC N0.:4.1.1.20)的多核苷酸(lysA基因)，
[0051]p)編碼天冬氨酸氨基轉移酶(Aat，EC N0.:2.6.1.1)的多核苷酸(aat基因)，
[0052]q)編碼具有L-賴氨酸輸出活性的多肽(LysE，賴氨酸流出通透酶)的多核苷酸(lysE 基因)，
[0053]r)編碼二氫吡啶二羧酸還原酶(DapB, EC N0.: 1.3.1.26)的多核苷酸(dapB基因)，
[0054]s)編碼天冬氨酸激酶(LysC，EC N0.: 2.7.2.4)的多核苷酸(lysC基因)，
[0055]t)編碼琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉移酶，AT I類(DapC, EC N0.:2.6.1.17)的多核苷酸(dapC基因)，
[0056]u)編碼四氫吡唳二羧酸玻拍酸酶(tetrahydrodipicolinate succinylase)(DapD, EC N0.:2.3.1.117)的多核苷酸(dapD 基因),
[0057]v)編碼琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰酶(DapE，EC N0.:3.5.1.18)的多核苷酸(dapE基因)，和
[0058]w)編碼二氨基庚二酸差向異構酶(DapF，EC N0.:5.1.1.7)的多核苷酸(dapF基因)，
[0059]特別優選dapA、asd、ddh、lysA、lysE、dapB 和 lysC 基因。更特別優選 asd 和 lysC基因，因為特別使用此兩個基因實現了 L-賴氨酸生產特別額外的增強。
[0060]涉及L-纈氨酸、L-異亮氨酸、α-酮異戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或α-酮異己酸的制備，所述第二多核苷酸優選由編碼L-纈氨酸、L-異亮氨酸、α -酮異戊酸、α-酮-β_甲基戊酸或α-酮異己酸生物合成的酶的一或多種基因或多核苷酸所組成，所述酶選自:
[0061]X)編碼乙酰乳酸合酶的亞基(IlvBN，EC N0.:4.1.3.18)的多核苷酸(ilvB基因和ilvN基因)，
[0062]y)編碼還原異構酶(IlvC，EC N0.: 1.1.1.86)的多核苷酸(ilvC基因)，
[0063]z)編碼二羥酸脫水酶(IlvD, EC N0.:4.2.1.9)的多核苷酸(ilvD基因)，[0064]aa)編碼轉氨酶(IlvE, EC N0.:2.6.1.42)的多核苷酸(ilvE 基因)，
[0065]bb)編碼蘇氨酸脫水酶(IlvA，EC N0.:4.3.1.19)的多核苷酸(ilvA基因)，
[0066]cc)編碼高絲氨酸脫氫酶(Horn, EC-N0.: 1.2.1.11)的多核苷酸(hom基因),
[0067]dd)編碼高絲氨酸激酶(ThrB, EC-N0.: 2.7.1.39)的多核苷酸(thrB基因)，
[0068]ee)編碼蘇氨酸合酶(ThrC, EC-N0.:4.2.3.1)的多核苷酸(thrC基因)，
[0069]ff)編碼異丙基蘋果酸合酶(LeuA，EC-N0.:2.3.3.13)的多核苷酸(leuA基因)，
[0070]gg)編碼異丙基蘋果酸脫氫酶(LeuB，EC-N0.:1.1.1.85)的多核苷酸(leuB基因)，
[0071]hh)編碼異丙基蘋果酸異構酶的大亞基(LeuC，EC-N0.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuC 基因)，
[0072]ii)編碼異丙基蘋果酸異構酶的小亞基(LeuD，EC-N0.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuD 基因)，
[0073]對于異亮氨酸和纟顏氨酸，特別優選ilvBN、hom、ilvA、ilvC、ilvD和ilvE基因；對于α-酮戊酸(KIV)和0-酮-^ -甲基戊酸(KMV)，特別優選ilvBN、ilvC和ilvD基因；而對于 α -酮異己酸(KIC)，特別優選 ilvBN、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC 和 leuD 基因。
[0074]涉及L_鳥氨酸的制備，第二多核苷酸優選由編碼L-鳥氨酸生物合成的酶的一或多種基因或多核苷酸所組成，所述酶選自:
[0075]jj)編碼賴氨酸/鳥氨酸轉運蛋白(DE申請號102010003419.3)的多核苷酸(lysE基因)，
[0076]kk)編碼N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB，EC-N0.: 2.7.2.8)的多核苷酸(argB基因)，
[0077]11)編碼谷氨酸脫氫酶(Gdh, EC-N0.: 1.4.1.3)的多核苷酸(gdh基因)，
[0078]mm)編碼谷氨酸 N-乙酰基轉移酶(Argj, EC-N0.:2.3.1.35 和 EC_N0.:2.3.1.1)的多核苷酸(argj基因)，
[0079]nn)編碼N-乙酰基-y-谷氨酰磷酸還原酶(ArgC, EC-N0.: 1.2.1.38)的多核苷酸(argC基因)，和
[0080]oo)編碼乙酰鳥氨酸氨基轉移酶(ArgD，EC-N0.:2.6.1.11)的多核苷酸(argD基因)，
[0081]特別優選lysE和argB基因。
[0082]本發明的啟動子因而在每種情況中可用于在谷氨酸棒狀桿菌中(過)表達所述第
二多核苷酸。
[0083]第二多核苷酸的位置在本發明的啟動子的下游，也即在其3’端，從而兩個多核苷酸功能性地彼此相連，其中所述連接是直接連接或者通過接頭寡核苷酸或接頭多核苷酸的方式連接。優選兩個多核苷酸通過接頭寡核苷酸或接頭多核苷酸的方式功能性地彼此相連。
[0084]所述接頭寡核苷酸或接頭多核苷酸由脫氧核糖核苷酸組成。
[0085]在此背景中，表述“直接功能性地彼此連接”意指核苷酸以在SEQ ID NO: 3或SEQID N0:34的3’端位置461處的腺苷核苷酸，直接連接至編碼區起始密碼子的第一個核苷酸。這導致了“無前端(leaderless)”的mRNA，其以5’-端AUG起始密碼子為起點因而不具有任何其它翻譯起始信號。[0086]在此背景中，表述“通過接頭寡核苷酸的方式功能性地彼此連接”意指核苷酸以在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的3’端位置461處的腺苷核苷酸，由長度1、2、3、4、或5個核苷酸的寡核苷酸連接至編碼區起始密碼子的第一個核苷酸。
[0087]在此背景中，表述“通過接頭寡核苷酸的方式功能性地彼此連接”意指核苷酸以在SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 34的3’端位置461處的腺苷核苷酸，由長度6至不超過(≤)600個核苷酸的多核苷酸連接至編碼區起始密碼子的第一個核苷酸。[0088]在此背景中，表述“功能性地彼此連接”意指，第二多核苷酸以這樣的方式連接至本發明的具有啟動子活性的多核苷酸，其中所述方式確保第二多核苷酸的轉錄和所合成的RNA的翻譯。
[0089]根據技術需要，所述接頭多核苷酸的長度是:
[0090]6-600、6-500、6-400、6-300、6-200、6-180、6-160、6-140、6-120、6-100、6-80、6-60、6-50、6-40、6-30、6-28、6-27、6-26、6-25 或者
[0091]8-600、8-500、8-400、8-300、8-200、8-180、8-160、8-140、8-120、8-100、8-80、8-60、8-50、8-40、8-30、8-28、8-27、8-26、8-25 或者
[0092]10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-180、10-160、10-140、10-120、10-100、10-80、10-60、10-50、10-40、10-30、10-28、10-27、10-26、10-25 或者
[0093]12-600、12-500、12-400、12-300、12-200、12-180、12-160、12-140、12-120、12-100、12-80、12-60、12-50、12-40、12-30、12-28、12-27、12-26、12-25 或者
[0094]14-600、14-500、14-400、14-300、14-200、14-180、14-160、14-140、14-120、14-100、14-80、14-60、14-50、14-40、14-30、14-28、14-27、14-26、14-25 或者
[0095]16-600、16-500、16-400、16-300、16-200、16-180、16-160、16-140、16-120、16-100、16-80、16-60、16-50、16-40、16-30、16-28、16-27、16-26、16-25 或者
[0096]18-600、18-500、18-400、18-300、18-200、18-180、18-160、18-140、18-120、18-100、18-80、18-60、18-50、18-40、18-30、18-28、18-27、18-26、18-25 或者
[0097]20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-180、20-160、20-140、20-120、20-100、20-80、20-60、20-50、20-40、20-30、20-28、20-27、20-26、20-25 個核苷酸。
[0098]在特別優選的實施方案中，所述接頭多核苷酸長度是20、21、22、23、24或25個核苷酸，因為這優選產生功能性構建體，如實施例3-5中所述。
[0099]所述接頭多核苷酸優選為包含確保所合成RNA翻譯的核苷酸序列的多核苷酸。此序列在本領域中也稱作核糖體結合位點(RBS)或者Shine Dalgarno序列。
[0100]本發明因為還涉及基本由SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸組成的分離的多核苷酸，其以在其3’端位置461處的腺苷核苷酸，直接或者通過確保RNA翻譯的接頭多核苷酸的方式，功能性地連接至第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在其5’端含有ATG或GTG起始密碼子并編碼一或多個多肽。優選兩個多核苷酸通過接頭多核苷酸的方式功能性地彼此相連。
[0101]本發明因為還涉及基本由SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸組成的分離的多核苷酸，其經SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 34的3’端位置461處的腺苷核苷酸功能性地接頭寡核苷酸。
[0102]另外，本發明還涉及基本由SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 34的多核苷酸組成的分離的多核苷酸，其經在其3’端位置461處的腺苷核苷酸功能性地連接至確保RNA翻譯的接頭多核苷酸。
[0103]在此背景中，術語“基本”意指，長度不超過(<)1000、不超過)800、不超過(< )700、不超過(()600、不超過(<)500或不超過(()400個核苷酸的多核苷酸被加至SEQIDN0:3或SEQIDN0:34的多核苷酸的5'端并且長度不超過(≤)1000、不超過(()800、不超過(<)700、不超過(()600、不超過(0500或不超過(()400個核苷酸的多核苷酸被加至第二多核苷酸的3’端，或者長度不超過(O 15000、不超過(<)10000、不超過(<)7500、不超過(<)5000、不超過(<)2500、不超過(<)1000、不超過(()800、不超過(()700、不超過(()600、不超過(<)500或不超過(<)400個核苷酸的多核苷酸被加至接頭寡核苷酸或多核苷酸的3,端。
[0104]兩項列舉中特征的任意有用組合都符合本文的發明。“有用組合”意指，例如導致實現有效重組的特征的組合。在要置換的DNA區域旁側用相同長度添加會有助于該區域在實驗過程中通過同源重組轉移。相對長的旁側同源區域對于環狀DNA分子之間的有效重組是有利的，但是置換載體的克隆會隨著旁側長度的增加而變得更困難(Wang等人，Molecular Biotechnology 32:43-53(2006))。
[0105]因此，優選在每種情況中添加600至不超過(()1000個核苷酸的特定組合，而特別優選在每種情況中添加750-850個核苷酸。另外，當接頭寡核苷酸或接頭多核苷酸的3'功能性地連接至第二多核苷酸(其在5'端含有ATG或GTG起始密碼子并編碼一或多個多肽)時，接頭寡核苷酸或接頭多核苷酸的3'處的旁側序列長度可增加至不超過(^ ) 15000個核苷酸。
[0106]棒狀桿菌屬(優選谷氨酸棒狀桿菌)的核糖體結合位點已有很好的描述。VonAmador 等人(Microbiology, 145,915-924(1999))已經確定了谷氛酸棒狀桿菌 16S rRNA的反-Shine Dalgarno 序列，其在 SEQ ID N0:4 中不出。Martin 等人(Journal ofBiotechnologyl04，41-53 (2003))所報道的序列在 SEQ ID N0:5 中示出。
[0107]適宜的核糖體結合位點的其它例子還有:
[0108]谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum) ATCC13032的ppc基因的核糖體結合位點(0，Regan 等人，基因 77，237-251 (1989))，在 SEQ ID NO: 6 中示出;
[0109]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的aceA基因的核糖體結合位點(Reinscheid等人，Journal of Bacteriologyl76 (12)，3474-3483 (1994))，在 SEQ ID NO: 7 中示出;
[0110]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的thiX基因的核糖體結合位點(Reinscheid等人，Journal of Bacteriologyl76 (12)，3474-3483 (1994))，在 SEQ ID NO: 8 中示出;
[0111]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的sod基因的核糖體結合位點(W02005/059144)，在SEQ ID NO:9 中示出;
[0112]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的tuf基因的核糖體結合位點(W02005/059093)，在SEQ ID NO: 10 中示出;
[0113]EP1918378中SEQ ID NO:44的核糖體結合位點，在SEQ IDN0:11中示出;
[0114]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的fbp基因的核糖體結合位點，在SEQ ID N0:12中示出；
[0115]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的gap基因的核糖體結合位點(Eikmanns, Journal ofBacteriologyl74(19) ,6076-6086(1992))，在 SEQ ID NO: 13 中示出。
[0116]優選所述接頭多核苷酸含有gap基因的核糖體結合位點(在SEQ IDN0:13中示出)，或fbp基因的的核糖體結合位點(在SEQ ID NO: 12中示出)。
[0117]所述接頭多核苷酸特別優選的實施方案(其含有gap基因的核糖體結合位點)在SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17 中示出。
[0118]所述接頭多核苷酸特別優選的實施方案(其含有fbp基因的核糖體結合位點)在SEQ ID NO: 18 中示出。
[0119]所述接頭多核苷酸的這些特別優選的實施方案確保RNA的翻譯以有利的方式進行。
[0120]為了促進具有SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:34的核苷酸序列的本發明多核苷酸、確保RNA的翻譯的所述接頭多核苷酸、以及編碼一或多個多肽的第二多核苷酸(在其5'端具有ATG或GTG起始密碼子)之間的化學連接，可以在所述多核苷酸的5'和3'端處摻入克隆所需的功能性核苷酸序列并且即使在所述克隆之后也至少部分保留。
[0121]術語“克隆所需的功能性核苷酸序列”在本文中表示任何存在的REII(II型限制性內切酶)切割位點，其序列通常由4-8個核苷酸組成。
[0122]另外 ，需要在此提到的是，通過誘變引物或從頭基因合成(例如通過GENEARTAG (Regensburg, Germany))的手段而對核苷酸序列進行的位點特異性誘變以去除限制性內切酶的切割位點，可以在序列中引入沉默突變以使所述切割位點可有利地用于隨后的克隆步驟。
[0123]通過將本發明的啟動子功能性地連接至所述確保RNA翻譯的接頭多核苷酸而得到的多核苷酸在下文中也稱作表達單元。
[0124]本發明還涉及本發明的啟動子或本發明的表達單元用于在微生物中表達所期望的基因或多核苷酸的用途。本發明的啟動子或本發明的表達單元確保轉錄和所合成的RNA (優選mRNA)翻譯成多肽。
[0125]優選在棒狀桿菌屬的微生物中進行表達。優選基于棒狀桿菌屬中如下物種的菌株:Corynebacterium eff iciens (保藏的典型菌株有DSM44549),谷氨酸棒狀桿菌(保藏的典型菌株有ATCC13032),和產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)(保藏的典型菌株有ATCC6871)。特別優選谷氨酸棒狀桿菌物種。
[0126]以此方式可以表達具有相應宿主中不存在或檢測不到的特性(優選酶活性)的多肽。因而，例如，Yukawa等人描述了在組成型Ptrc啟動子的控制下于谷氨酸棒狀桿菌R中表達用于利用D-木糖的大腸桿菌(Escherichiacoli)基因(Applied Microbiology andBiotechnology81,691-699(2008))。
[0127]本發明的啟動子或本發明的表達單元還用于在微生物中過表達所期望的基因或多核苷酸(過表達)。
[0128]過表達通常意指，與起始菌株(親本菌株)或野生型菌株(如果后者是起始菌株)相比，核糖核酸、蛋白質(多肽)或酶的細胞內濃度或活性的增加。起始菌株(親本菌株)意指已經經歷過導致過表達的措施的菌株。
[0129]對于過表達，優選重組過表達的方法。這包括使用體外提供的DNA分子制備微生物的所有方法。此類DNA分子的包括例如啟動子、表達盒、基因、等位基因、編碼區等。通過轉化、接合、轉導或類似方法將其引入所期望的微生物中。
[0130] 在本發明的情況中，啟動子優選是SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:34的多核苷酸，且表達盒優選是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 34的多核苷酸(經在其3’端位置461處的腺苷核苷酸功能性地連接至確保RNA翻譯的接頭多核苷酸)。
[0131]使用本發明的啟動子或本發明的表達單元的過表達的措施增加相應多肽的活性或濃度，通常以所述措施導致過表達前的菌株中的所述多肽的活性或濃度水平為基礎增加至少 10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400% 或 500%，優選不超過 1000%、2000%、4000%、10000% 或 20000%。
[0132]表達或過表達的程度可以通過測量從基因轉錄的mRNA的量或濃度來確定，通過測定多肽的量或濃度和通過測定酶活性的水平來確定。
[0133]mRNA的量尤其可以通過使用“Northern印跡”和定量RT-PCR的方法確定。定量RT-PCR涉及在聚合酶鏈式反應之前逆轉錄。來自Roche Diagnostics的LightCycler?系統(Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,Germany)可以用于此目的，例如在 Jungwirth 等人中(FEMS Microbiology Letters281,190-197(2008))所描述的。通過1維和2維蛋白凝膠分級和隨后的使用合適的評估軟件的對凝膠中蛋白質濃度的光學鑒定可以測定所述蛋白質的濃度。為棒狀細菌制備蛋白質凝膠和鑒定蛋白質的常用方法是由Her_an等人描述的程序(Electrophoresis,22:1712-23(2001))。通過使用對被檢測的蛋白質特異性的抗體的蛋白印跡(Sambrook等人，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition，，，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)和隨后的使用合適的濃度測定軟件的光學評估(Lohaus 和 Meyer (1998) Biospektrum5:32-39 ；Lottspeich, AngewandteChemie321:2630-2647 (1999))同樣可以測定蛋白質的濃度。所收集數據的統計學顯著性通過 T 檢驗的手段來確定(Gosset, Biometrika6 (1): 1-25 (1908))。
[0134]使用本發明的啟動子過表達所期望基因的措施可以適宜的方式與其它過表達措施組合。
[0135]通過在現有技術中可獲得的多種方法來實現過表達。這些包括增加拷貝數以及修飾指導或控制所述基因表達的核苷酸序列。
[0136]可以通過在細菌細胞質中復制的質粒的手段來增加拷貝數。為此，用于具有很大差異的微生物組的質粒在現有技術中有大量描述，所述質粒可以用于設置基因拷貝數所期望的提高。適合于棒狀桿菌屬的質粒在例如Tauch等人(Journal ofBiotechnologyl04 (1-3), 27-40, (2003))或在 Stansen 等人的文獻中(Applied andEnvironmental Microbiology71, 5920-5928 (2005))有所描述。
[0137]通過引入更多的拷貝進入微生物染色體可以使拷貝數進一步增加至少一個(1)拷貝。適合于棒狀桿菌屬的方法在例如專利W003/014330、W003/040373和W004/069996中
有描述。
[0138]還可以在所期望基因的上游放置多個啟動子或將其功能性地連接至所要表達的基因并以這種方式實現表達的提高。這在例如W02006/069711中有描述。
[0139]在適宜的情況中，可通過抑制(阻抑蛋白)或促進(激活蛋白)轉錄的蛋白質來控制基因的轉錄。相應地，通過增加激活蛋白的表達或通過減少或關閉阻抑蛋白的表達同樣可以實現過表達。
[0140]延伸的速率受密碼子使用的影響。可以通過使用起始菌株中常用的t (轉運)RNA密碼子來增強翻譯。另外，將起始密碼子替換為許多微生物中(大腸桿菌中為77%)更常用的ATG起始密碼子能夠可觀地敢刪梵音，因為在RNA水平，AUG密碼子比GUG和UUG 密碼子有效兩至三倍，例如(Khudyakov 等人，FEBS Letters232 (2): 369-71 (1988)；Reddy 等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUSA82(17):5656-60 (1985))。還可以優化起始密碼子周圍的序列，因為起始密碼子與旁側區之間的協同效應已有描述(Stenstrom等人，基因273(2):259-65(2001) ;Hui等人，ΕΜΒ0Journal3(3):623-9(1984))。 [0141]對操作DNA、消化和連接DNA、轉化和選擇轉化體的操作說明尤其可以參見Sambrook 等人的已知的手冊“Molecular Cloning:A Laboratory Manual, SecondEdition，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
[0142]本發明還涉及包含本發明多核苷酸的載體。
[0143]Kirchner 和 Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003))描述了用于谷氨酸棒狀桿菌的載體的選擇。
[0144]使用本發明的載體進行的同源重組使得通過載體轉運至細胞內的本發明多核苷酸所能夠置換染色體上的DNA區段。為了載體的環狀DNA分子和染色體上靶DNA之間的有效重組，在要用本發明的多核苷酸置換的DNA區域的末端提供同源于靶位點的核苷酸序列(其確定載體整合的位點以及DNA置換的位點)。
[0145]因而，本發明具有啟動子活性的多核苷酸可以:1)在染色體中已經與第二多核苷酸的天然基因座處的天然啟動子置換，或者2)已經與第二多核苷酸在后者的天然基因座處或者在另一基因座處整合。“第二多核苷酸的天然基因座處的天然啟動子”意指基因天然發生的啟動子被置換，天然發生的啟動子通常以單一拷貝的方式在相應野生型或相應起始生物體的基因座處以其核苷酸序列的形式天然存在。
[0146]“另一基因座”意指其核苷酸序列與第二多核苷酸的序列不同的基因座。所述其它基因座或所述其它基因座處的核苷酸序列優選位于染色體內，并且通常不是生長和產生所期望的化合物所必需的。還可以在染色體內使用基因間區域，即，無編碼功能的核苷酸序列。
[0147]優選在棒狀桿菌屬的微生物中進行表達或過表達。在棒狀桿菌屬內，優選基于如下物種的菌株:Corynebacterium eff iciens (保藏的典型菌株有DSM44549),谷氨酸棒狀桿菌(保藏的典型菌株有ATCC13032)，和產氨棒狀桿菌(保藏的典型菌株有ATCC6871)。特別優選谷氨酸棒狀桿菌物種。
[0148]某些代表性谷氨酸棒狀桿菌物種在現有技術中也以其它名稱為人所知。這些包括例如:菌株ATCC13870,被稱為嗜醋酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)；菌株DSM20137,被稱為百合棒狀桿菌(Corynebacterium lilium);菌株ATCC17965,被稱為棲糖蜜棒狀桿菌(Corynebacterium melassecola);菌株ATCC14067,被稱為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum);菌株 ATCC13869,被稱為乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum);和菌株 ATCC14020,被稱為散枝短桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)。[0149]術語“產谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus) ”也用于谷氨酸棒狀桿菌。某些代表性Corynebacterium efficiens物種在現有技術中也已稱為熱產氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes),如例如菌株 FERMBP-1539。
[0150]用于本發明的表達或過表達措施的微生物或菌株(起始菌株)優選已經具有將所期望的精細化學品分泌至周圍營養培養基中并在該處積累的能力。在下文中，對此也使用“產生”這一表述。更具體地，用于過表達措施的菌株具有在< (不超過)120小時、<96小時、< 48小時、< 36小時、< 24小時或< 12小時內于細胞中或于營養培養基中將所期望的精細化學品積累至濃度≥(至少)≥0.10g/l、0.25g/l≥0.5g/l、≥ l.0g/1、≥1.5g/1、≥2.0g/l、≥ 4g/l或≥ 10g/l的能力。起始菌株優選通過誘變和選擇、通過重組DNA技術或通過這兩種方法的組合來制備。
[0151]本領域技術人員理解，適用于本發明的措施的微生物也可通過如下方法獲得:首先利用SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:34的本發明的啟動子在野生型菌株(谷氨酸棒狀桿菌典型菌株ATCC13032或菌株ATCC14067)中過表達所期望的基因，繼而，通過另外的現有技術中所述的遺傳學措施來使所述微生物產生所期望的精細化學品。
[0152]對于本發明的措施而言，術語“精細化學品”意指氨基酸、有機酸、維生素、核苷和核苷酸。特別優選成蛋白氨基酸、非成蛋白氨基酸和有機酸。
[0153]“成蛋白氨基酸”是指天然蛋白中出現的氨基酸，也即在微生物、植物、動物和人類的蛋白質中出現的氨基酸。它們作為蛋白質的結構單元，其中它們經肽鍵彼此相連。
[0154]術語蛋白和多肽可互換。
[0155]下文提到的成蛋白L-氨基酸是指選自如下的氨基酸(包括其鹽):L_天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸，以及適宜的情況下L-硒代半胱氨酸和L-吡咯賴氨酸。特別優選L-氨基酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸。更特別優選L-賴氨酸和L-纈氨酸。
[0156]下文提到L-賴氨酸或賴氨酸不僅是指堿基，還指鹽，如例如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
[0157]非成蛋白氨基酸尤其包括L-鳥氨酸和L-高絲氨酸。
[0158]有機酸尤其包括α-酮酸，特別優選α-酮異己酸(KIC)、α -酮戊酸(KIV)和α_酮-β_甲基戊酸(_。
[0159]谷氨酸棒狀桿菌物種分泌L-賴氨酸或產L-賴氨酸的菌株的實例有:
[0160]谷氨酸棒狀桿菌MH20-22B(=DSM16835)；
[0161]在Menkel 等人(Applied and Environmental Microbiology55 (3),684-688(1989))中有描述并且保藏為DSM16835 ；
[0162]Georgi 等人(Metabolic Engineering?, 291-301 (2005))和 EP1717616A2 中所描述的谷氨酸棒狀桿菌DM1729，并保藏為DSM17576 ；
[0163]US6, 783，967所述的谷氨酸棒狀桿菌DSM13994 ；以及
[0164]Blombach等人(Appl Environ Microbiol.2009Jan; 75 (2):419-27)中所描述的谷氨酸棒狀桿菌DM1933。[0165]Corynebacterium efficiensis物種分泌L_賴氨酸或產L_賴氨酸的菌株的實例:
[0166]US5, 250, 423 所述的熱產氨棒狀桿菌 AJ12521 (=FERM BP-3304)。
[0167]產L-賴氨酸微生物通常具有“反饋抗性的或密集化的(densensitized)天冬氨酸激酶。“反饋抗性天冬氨酸激酶是指，與野生形式(野生型)相比，該天冬氨酸激酶(LysC)對于由賴氨酸和蘇氨酸混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)和蘇氨酸混合物或者單獨賴氨酸或者單獨AEC帶來的抑制敏感性較低。編碼這些(與野生型相比)密集化的天冬氨酸激酶的基因或等位基因也稱作lysCFBK等位基因。谷氨酸棒狀桿菌物種適宜于所述天冬氨酸激酶的情況的野生型是菌株ATCC13032。現有技術描述了許多編碼天冬氨酸激酶變體(與野生型蛋白相比具有氨基酸取代)的lysCFBK等位基因。棒狀桿菌屬細菌中的lysC基因也稱作ask基因。腸桿菌(Enterobacteriaceae)中的lysC基因所編碼的天冬氨酸激酶也稱作天冬氨酸激酶III。
[0168]關于導致密集化的谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸取代的詳細信息尤其在W02009141330A1 (第10頁21行至第13頁17行)中有描述，其援引加入本文。優選攜有選自如下的氨基酸取代的天冬氨酸激酶變體:L-異亮氨酸取代氨基酸序列的位置380處的L-蘇氨酸和任選存在的L-苯丙氨酸取代位置381處的L-絲氨酸，L-異亮氨酸取代位置311處的L-蘇氨酸和L-蘇氨酸取代位置279處的L-丙氨酸。
[0169]谷氨酸棒狀桿菌物種分泌L-甲硫氨酸或產L-甲硫氨酸的菌株的實例:
[0170]W02007/011939 所述的谷氨酸棒狀桿菌 M1179 (=DSM17322)。
[0171]棒狀桿菌分泌L- 色氨酸或產L-色氨酸的菌株的已知代表性實例有:
[0172]US5, 563，052 所述的谷氨酸棒狀桿菌 K76 (=Ferm BP-1847)；
[0173]US5, 605, 818 所述的谷氨酸棒狀桿菌 BPS13(=Ferm BP-1777);和
[0174]US5, 235，940所述的谷氨酸棒狀桿菌Ferm BP-3055。
[0175]棒桿狀細菌分泌L-纈氨酸或產L-纈氨酸的菌株的實例有:
[0176]US5, 188，948 所述的乳發酵短桿菌 FERM BP-1763 ；
[0177]US5, 521，074 所述的乳發酵短桿菌 FERM BP-3007 ；
[0178]US5, 521，074所述的谷氨酸棒狀桿菌FERM BP-3006 ;和
[0179]US5, 188，948所述的谷氨酸棒狀桿菌FERM BP-1764。
[0180]產L-纈氨酸的微生物通常具有“反饋抗性的或密集化的乙酰乳酸合酶(AHAS，EC4.1.3.18)，其是合成異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸的平行途徑中的第一個酶(Umbarger, Η.Ε.1987.Biosynthesis of the branched-chain amino acids,p.352-367。 在 F.C.Neidhardt, J.L.1ngraham, Κ.B.Low, B.Magasanik, M.Schaechter,和 Η.E.Umbarger(ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular andMolecular Biology 中。American Society for Microbiology,Washington,D.C.)。該全酶總是由兩個大亞基和兩個小亞基組成。大的AHAS亞基形成催化結構域并且由ilvB所編碼，而小的亞基作為調節結構域并由ilvN所編碼。“反饋抗性乙酰乳酸合酶是指，與野生形式(野生型)相比，該乙酰乳酸合酶對于由支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸或其混合物所帶來的抑制敏感性較低。谷氨酸棒狀桿菌物種適宜于所述乙酰乳酸合酶的情況的野生型是菌株ATCC13032，而黃色短桿菌物種中適宜的野生型是菌株ATCC14067。
[0181]谷氨酸棒狀桿菌中編碼乙酰乳酸合酶的ilvBN已在例如Keilhauer等人(Journalof Bacteriologyl75 (17): 5595-603 (1993))或 EP1108790 中有描述。登錄號 L09232 描述了所述基因的序列。
[0182]不受支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)反饋抑制的AHAS變體酶例如在 Mendel 等人(Journal of Molecular Biology325, 275-284 (2003)、Elisakova 等人(Applied and Environmental Microbiology71, 207-213 (2005))、Wada 等人(BioscienceBiotechnology&Biochemistry, 72 (11), 2959-2965, (2008))和在 EP1491634 中有描述。優選在ilvN-編碼的小亞基中攜有一或多個如下氨基酸取代的“反饋抗性乙酰乳酸合酶的變體，所述氨基酸取代選自:L-天冬氨酸取代氨基酸序列位置20處的甘氨酸，L-天冬氨酸取代氨基酸序列位置21處的L-異亮氨酸，L-苯丙氨酸取代氨基酸序列位置22處的L-異亮氨酸，除了 L-丙氨酸之外的任意成蛋白氨基酸、優選L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸、特別優選L-纈氨酸在位置42處取代以及任選存在的L-亮氨酸在位置47處取代L-組氨酸。
[0183]棒狀桿菌分泌L-異亮氨酸或產L-異亮氨酸菌株的已知代表性實例有:
[0184]US4, 656，135 所述的黃色短桿菌 FERM BP-760 ；
[0185]US5, 294，547 所述的黃色短桿菌 FERM BP-2215 ;和
[0186]US4, 656，135所述的谷氨酸棒狀桿菌FERM BP-758。
[0187]棒桿狀細菌分泌L-高絲氨酸或產L-高絲氨酸菌株的已知代表實例有:
[0188]US3, 189，526所述的產谷氨酸小球菌ATCC14296 ;和
[0189]US3, 189，526所述的產谷氨酸小球菌ATCC14297。
[0190]谷氨酸棒狀桿菌分泌L-鳥氨酸或產L-鳥氨酸菌株的已知代表實例有:
[0191]US5, 188，947 所述的乳發酵短桿菌 FERM-BP2344 ；
[0192]US5, 188，947所述的谷氨酸棒狀桿菌FERM-BP2345。
[0193]分泌α -酮酸或產α -酮酸的菌株基于例如:
[0194]谷氨酸棒狀桿菌，菌株ATCC13032，
[0195]黃色短桿菌，菌株ATCC14067和
[0196]乳發酵短桿菌，菌株ATCC13869。
[0197]本發明提供了生產精細化學品的微生物，所述微生物通過使用SEQ IDN0:3或SEQID NO:34的本發明的啟動子而具有與特定起始菌株相比一或多個基因提高了的表達。
[0198]本發明還提供了用于發酵制備精細化學品的方法，其包括步驟:a)在適宜培養基中培養上文所述的本發明的微生物，得到發酵液，以及b)濃縮a)的發酵液和/或微生物細胞中的精細化學品。
[0199]本文優選從含有精細化學品的發酵液獲取所述精細化學品或者液態或固態的含精細化學品的產物。
[0200]所產生的微生物可以連續地培養(例如在W005/021772中所描述的)，或者以用于產生所期望的有機化合物的分批方法(batch process)(分批培養)或分批加料(fed-batch)或重復分批加料(repeated fed-batch)的方法不連續地培養。關于已知培養方法的一般性質的概述可得自Chmiel的教科書中(Bioprozesstecknik[生物過程技術]1.Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik[生物過程工程簡介](Gustav FischerVerlag, Stuttgart, 1991))或在 Storhas 的教科書中(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen [生物反應器及周邊設備](Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, Germany1994))。[0201]要使用的培養基或發酵培養基必須以適合的方式滿足各個菌株的需求。AmericanSociety for Bacteriology(Washington D.C., USA,1981)的“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”中有對各種微生物的培養基的描述。術語培養培養基和發酵培養基或培養基是可以互換的。[0202]作為碳源，可以使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖漿、來自甜菜或甘蔗加工的含有蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纖維素；可以使用油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂肪；可以使用脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；可以使用醇，例如甘油、甲醇與乙醇；可以使用有機酸，例如醋酸或乳酸。[0203]作為氮源，可以使用有機的含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉類提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉和尿素；或使用無機化合物，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。所述氮源可以單獨或以混合物的方式使用。[0204]作為磷源，可以使用磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或相應的含有鈉鹽類。[0205]所述培養基還必須包含生長所必需的鹽，例如以金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣和鐵)的氯化物或硫酸鹽的形式，例如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質，可以使用基本的生長因子，例如氨基酸(例如高絲氨酸)和維生素(例如硫胺素、生物素或泛酸)。[0206]所述起始材料可以單批次添加至所述培養物，或在培養過程中以適合的方式補料。[0207]培養物的pH可以通過以適當的方式使用堿性化合物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)來控制。通常調整pH至6.0-8.5，優選6.5-8。為了控制起泡，可以使用止泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了保持質粒的穩定性，可以向培養基添加適合的選擇性物質，例如抗生素。優選在有氧條件下進行發酵。為了保持這些條件，向培養物中導入氧氣或含氧氣體混合物，例如空氣。同樣可以使用富含過氧化氫的液體。適當時，在升高的壓力進行發酵，例如在0.03-0.2MPa的升高的壓力下。培養溫度通常在20°C -45°C且優選25°C -40°C，特別優選30°C -37°C。在分批或分批加料方法中，優選連續培養直至形成足夠回收的量的所需的有機化合物。這通常可在10小時-160小時內實現。在連續方法中，可能有更長的培養時間。所述微生物的活性導致發酵培養基和/或所述微生物細胞中有機化合物的集中(積累)。[0208]適合的發酵培養基的實例尤其可以在專利US5，770, 409、US5, 990, 350、US5, 275，940、W02007/012078、US5，827，698、W02009/043803、US5，756，345 和 US7, 138，266中找到。[0209]為了測定在發酵過程中的一或多個時間點的濃度，可以通過用離子交換層析的方式分離L-氨基酸來分析L-氨基酸，優選陽離子交換層析及隨后使用茚三酮的柱后衍生化，如 Spackman 等人(Analytical Chemistry30:1190-1206 (1958))中所述。也可使用鄰苯二甲醛而非茚三酮用于柱后衍生化。離子交換層析的綜述文章可參見PickeringOX.GC(Magazine of Chromatographic Science)7 (6),484-487 (1989))。[0210]同樣可以使用例如鄰苯二甲醛或苯基異硫氰酸酯進行柱前衍生化，并通過反相層析(RP)優選地以高效液相色譜(HPLC)的形式來分餾所得的氨基酸衍生物。此類方法在例如 Lindroth 等人(Analytical Chemistry51:1167-1174 (1979))中有描述。
[0211]進行光度學檢測(吸光度、熒光)。
[0212]有關氨基酸分析的綜述可以尤其參見Lottspeich和Zorbas的“Bioanalytik”教科書(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998)。
[0213]可以通過用離子交換層析的方式分離酮酸和其它分泌產物，來進行測定發酵過程中一或多個時間點酮酸濃度的分析，優選使用在磺酸化的苯乙烯-二乙烯苯聚合物上Η+形式的陽離子交換 層析，例如通過0.025Μ硫酸及隨后于215nm(或者也可在230或275nm)以UV檢測的方式。優選可以利用REZEK RFQ _ Fast Fruit H+柱(Phenomenex),而分離相的其它供應商(例如來自BioRad的Aminex)也是可行的。類似的分離在供應商相應的應用實例中有描述。
[0214]基于使用不含有本發明啟動子變體的微生物進行的方法或發酵方法，對于一或多種選自如下的參數:濃度(每單位體積形成的化合物)、產率(每單位消耗碳源所形成的化合物)、形成(每單位體積和時間形成的化合物)和比形成(每單位干細胞物質或干生物質和時間所形成的化合物、或者每單位細胞蛋白和時間所形成的化合物)或其他方法參數以及其組合，本發明的方法或發酵方法的性能增加了至少0.5%、至少1%、至少1.5%或至少2%。這在大規模產業工藝中被認為是非常值得努力的。
[0215]發酵措施導致了含有所期望的精細化學品(優選氨基酸或有機酸)的發酵液。
[0216]繼而以液態或固態的形式提供或產生或回收含有精細化學品的產物。
[0217]發酵液是指其中已在一定溫度下培養微生物一定時間的發酵培養基或營養培養基。所述發酵培養基或在發酵過程中所采用的培養基包含所有確保產生所期望化合物以及通常確保增殖和活力的物質或組分。
[0218]當發酵完成，獲得的發酵液因而包含:
[0219]a)微生物的生物質(細胞團)，所述生物質因所述微生物細胞的增殖而產生，
[0220]b)在所述發酵過程中形成的精細化學品，
[0221]c)在所述發酵過程中可能形成的有機副產物，和
[0222]d)在所述發酵中未消耗完的所用的發酵培養基或起始原料的成分，例如維生素如生物素，或鹽如硫酸鎂。
[0223]有機副產物包括所述發酵物中使用的微生物所產生的除了特定的所期望的化合物之外任選地分泌的物質。
[0224]從培養容器或發酵罐中移除發酵液，在適宜的情況下收集并用于以液態或固態形式提供含有精細化學品的產物。對此，也使用表述“回收含精細化學品的產物”。在最簡單的情況中，從發酵罐中移除的含有精細化學品的發酵液本身構成了回收的產物。
[0225]選自以下的一或多種措施實現了所期望的有機化合物的濃縮或純化，所述措施為從發酵液中
[0226]a)部分(>0%至〈80%)至完全(100%)或實質上完全(≥80%、≥90%、≥95%、96%、97%、≥98%、≥99%)去除水，
[0227]b)部分(>0%至〈80%)至完全(100%)或實質上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、97%、≥98%、≥99%)去除生物質，所述生物質在去除前任選經滅活，
[0228]c)部分(>0%至〈80%)至完全(100%)或實質上完全≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥ 99.3%、≥99.7%)去除在發酵過程中形成的有機副產物，和
[0229]d)部分(>0%至〈80%)至完全(100%)或實質上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%、≥99.7%至〈100%)去除所用的發酵培養基或起始材料中在發酵中未消耗完的成分。以這種方式分離具有期望的所述化合物含量的產物。
[0230]部分(>0%至〈80%)至完全(100%)或實質上完全(≥80%至〈100%)去除水(措施a))也稱作干燥。
[0231]在所述方法的變體中，完全或實質上完全去除水、生物質、有機副產物和所用的發酵培養基的未消耗完組分導致獲得純的(> 80%重量或> 90%重量)或高度純的(> 95%重量、^ 97%重量、^ 99%重量)所期望有機化合物(優選L-氨基酸)的產物形式。大量的對a)、b)、c)或d)的措施的技術說明在現有技術中可獲得。
[0232]對于氨基酸L-賴氨酸或其鹽的情況，現有技術中基本上已知四種不同的產物。
[0233]一組含L-賴氨酸包括純化的L-賴氨酸濃縮的水成堿性溶液(EP-B-0534865)。另一組，例如如US6，340，486和US6，465，025中所述，包括含有L-賴氨酸發酵液的水成酸性含生物質濃縮物。最熟知的一組固態產物包括粉狀或晶狀形式的純化的或純的L-賴氨酸，其通常是鹽的形式，如例如，L-賴氨酸單鹽酸鹽。另一組固態產物形式在例如EP-B-0533039中有描述。其中所描述的產物形式包括除L-賴氨酸之外大部分的在發酵生產期間使用的且未消耗完的起始材料，以及適宜的情況下，比例為>0%-100%的所使用的微生物的生物質。 [0234]適宜于各種產物形式的多種多樣的方法已知可用于從發酵液產生含有L-賴氨酸的產物或者純化的L-賴氨酸。
[0235]基本上用于產生純的固態L-賴氨酸的方法是離子交換層析的那些方法(在適宜的情況下其中使用活性炭)，以及結晶的方法。以此方式獲得了相應的堿或相應的鹽，如例如單鹽酸鹽(Lys-HCl)或者賴氨酸硫酸鹽(Lys2-H2S04)。
[0236]EP-B-0534865描述了用于從發酵液產生水成堿性含L-賴氨酸溶液的方法。在其中所描述的該方法中，將生物質從發酵液中分離并棄去。使用堿如例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化銨來設定9至11之間的pH。通過濃縮和冷卻之后結晶而從該液中去除無機成分(無機鹽)并用作肥料或棄去。
[0237]在使用棒狀桿菌屬細菌產生賴氨酸的方法中，優選那些導致含有發酵液成分的產物的方法。這些特別用作動物飼料添加劑。
[0238]根據需要，可以通過如例如離心、過濾、傾析、或其組合的分離方法來完全或部分地從發酵液中去除生物質，或者將生物質完全留在其中。在適宜的情況下，在適合的加工步驟中將生物質或含生物質發酵液失活，例如通過熱處理(加熱)或者通過加入酸。
[0239]在一種過程中，生物質被完全或實質上完全去除，從而沒有(0%)生物質或者最多30%、最多20%、最多10%、最多5%、最多1%或最多0.1%的生物質留在所制備的產物中。在另一過程中，生物質未被去除或者僅僅去除了小部分，從而所有的(100%)生物質或者超過70%、80%、90%、95%、99%或99.9%的生物質留在所制備的產物中。因而，在本發明的一個方法中，生物質以從≥0%到≥100%的比例被去除。
[0240]最后，在完全或部分去除生物質之前或之后，可以用無機酸(如例如鹽酸、硫酸、或磷酸)或有機酸(如例如丙酸)調節發酵后所獲得的發酵液至酸性PH，從而改善終產物的操控特性(GB1，439，728或EP1331220。同樣可以將具有全部生物質含量的發酵液酸化。最后，也可以通過加入亞硫酸氫鈉(NaHS03，GB1, 439, 728)或另外的鹽來使發酵液穩定，例如加入亞硫酸的銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽。
[0241]在去除生物質期間，發酵液中存在的任何有機或無機的固體被部分地或完全地去除。至少部分(>0%)、優選達至少25%程度的、特別優選達至少50%程度的以及更特別優選達至少75%程度溶于發酵液的有機副產物、及溶解的未消耗完的發酵培養基成分(起始材料)保留在產物中。在適宜的情況下，它們也完全(100%)或實質上完全(意指>95%或>98%或者超過99%)保留在產物中。如果產物就此而言包含至少部分的發酵液成分，則其也由術語“基于發酵液的產物”來描述。 [0242]隨后，通過已知的方法從發酵液中去除水，或者將所述發酵液增稠或濃縮，所述方法如例如，使用旋轉蒸發器、薄膜蒸發器、降膜蒸發器、通過反滲透或通過納米過濾。可繼而通過凍干、噴干、噴射成粒(spray granulation)的方法或者通過其它方法如循環流化床將此濃縮的發酵液加工成自由流動的產物，特別是細粉或者優選的粗粒顆粒，如例如根據PCT/EP2004/006655中所述。在適宜的情況下，通過篩選或除塵從所獲得的顆粒中分離所期望的產物。
[0243]同樣可以直接干燥發酵液，也即沒有之前通過噴干或噴射成粒的濃縮。
[0244]“自由流動”意指粉末，在一系列口大小不同的玻璃口容器中，能夠至少無阻礙地
流出具 5mm(毫米)口的容器(Klein: Seifen, Ole? Fette, ffachse 94,12(1968))。
[0245]“精細”是指粉末主要(>50%)具有直徑20-200 μ m的顆粒大小。
[0246]“粗粒”是指主要(>50%)為直徑200-2000 μ m顆粒大小的產物。
[0247]可以通過激光衍射光譜的方法來確定顆粒大小。相應的方法在R.H.Muller 和 R.Schuhmann 的教科書 “TeilchengroBenmessurig in der
Laborpraxis^ ffissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)中或者在 M.Rhodes, published 的教科書“Introduction to ParticleTechnolog” Wiley&Sons (1998)中有描述。
[0248]繼而可以通過適宜的壓縮和成粒方法將自由流動的精細粉末轉化成粗粒的、非常自由流動的、可儲存和基本無塵的產物。
[0249]術語“無塵”指產物僅含有顆粒大小低于直徑100 μ m的小部分(〈5%)。
[0250]本發明含義中的“可儲存的”是指，產物在干燥陰涼的環境中可以儲存至少一(1)年或更長、優選至少1.5年或更長、特別優選兩(2)年或更長，而未實質上損失存在的各種氨基酸。“實質上損失”是指>5%的損失。
[0251]本發明還涉及W02007/042363A1中所述的原理。就此而言，進行了其中使用根據本發明所獲得的發酵液(在適宜的情況下，其中生物質被完全或部分去除)的方法，其包括如下步驟:
[0252]a)通過加入硫酸將pH降低至4.0-5.2、特別是4.9-5.1,以及通過在適宜的情況下加入一或多種另外的含硫酸鹽化合物而在發酵液中建立了 0.85-1.2、優選0.9-1.0、特別優選>0.9至〈0.95的摩爾硫酸鹽/L-賴氨酸比，和
[0253]b)通過去除水分將以此方式獲得的混合物濃縮，并在適應的情況下成粒，[0254]其中在適宜的情況下在步驟a)之前進行如下的一種或兩種措施:
[0255]c)測量摩爾硫酸鹽/L-賴氨酸比以確定所需的含硫酸鹽化合物的量
[0256]d)加入選自如下組的含硫酸鹽化合物:硫酸銨、適當比例的亞硫酸氫銨和硫酸。
[0257]在適宜的情況下，在步驟b)之前，還以基于發酵液0.01-0.5%重量、優選0.1-0.3%重量、特別優選0.1-0.2%重量的濃度加入亞硫酸鹽、優選堿金屬亞硫酸鹽、特別優選亞硫酸氫鈉。
[0258]在上述方法步驟的背景中可提及的優選含硫酸鹽化合物特別有硫酸銨和/或硫酸氫銨或者氨水和硫酸的適宜混合物以及硫酸本身。
[0259]摩爾硫酸鹽/L-賴氨酸比V以如下公式計算:V=2x[S042_]/[L-賴氨酸]。此公式慮及了 so42_陰離子和硫酸是二價的這一事實。V=1的比例意味著存在理想化學計量配比的Lys2-(H2S04)，而發現V=0.9的比例是10%的硫酸鹽短缺以及V=l.1的比例是10%的硫酸鹽過量。
[0260]在成粒或壓縮期間，使用如下是有利的:通常的有機或無機輔助物或者載體如淀粉、明膠、纖維素衍生物或者類似的物質，如通常用于加工食品或飼料作為粘合劑、膠凝劑或增稠劑，或者其它的物質如例如，硅石、硅酸鹽(EP0743016A)和硬脂酸鹽。
[0261]用油或者脂處理所得的顆粒表面也是有利的，如W004/054381中所述。可用的油有礦物油、植物油或者植物油的混合物。此類油的實例有大豆油、橄欖油、大豆油/卵磷脂混合物。以相同的方式，硅油、聚乙烯二醇或羥乙基纖維素也是適宜的。用所述油處理表面可實現產物提高的耐磨性和降低含塵量。基于總飼料添加劑的量，產物中的油含量是0.02-2.0%重量、優選0.0-1.0%重量、及特別優選0.2-1.0%重量。
[0262]優選的產物具有≥97%重量的比例為100-1800 μ m的顆粒大小或者≥95%重量的比例為直徑300-1800 μ m的顆粒大小。塵(也即顆粒大小〈100 μ m的顆粒)的比例優選>0-1%重量，特別優選不超過0.5%重量。
[0263]然而，作為選擇，產物還可被吸附至已知的并常用于飼料加工的有機或無機載體上，如例如，硅石、硅酸鹽、膳食、糠、面粉、淀粉、糖或者其它，和/或產物還可用常用的增稠劑或粘合劑來混合和穩定。此用途和方法的實例在文獻中有描述(Die Muhle+Mischfuttertechnikl32(1995)49,817 頁)。
[0264]最后，還可通過包被過程給產物帶來薄膜形成物，如例如，金屬碳酸鹽、硅石、硅酸鹽、藻酸鹽、硬脂酸鹽、淀粉、樹膠、和纖維素醚，如DE-C-4100920中所述，使其成為對動物胃部消化穩定的狀態，特別是反芻動物的胃部。
[0265]為在產物中建立所期望的L-賴氨酸濃度，根據需要，可以在加工期間以濃縮物的形式加入L-賴氨酸，或者在適宜的情況下，以液態或固態形式加入基本上純的物質或其鹽。這些可單獨加入或者作為混合物加入至所得的或濃縮的發酵液，或者在干燥或成粒過程中加入。
[0266]本發明還涉及與制備固態含賴氨酸產物的方法的組合，該方法的原理在US20050220933中有描述。這涉及進行期中使用根據本發明獲得的發酵液的方法，且所述方法包括如下步驟:
[0267]a)過濾發酵液，優選用膜過濾器，以得到含生物質的漿料和濾出物，
[0268]b)濃縮所述濾出物，從而優選得到含量為48-52%重量的固體，[0269]c)將步驟b)中獲得的濃縮物成粒，優選在50 V -62 V的溫度，和
[0270]d)用一或多種包被物質將步驟c)所獲得的顆粒包被。
[0271]優選用于步驟d)的包被物質選自:
[0272]dl)步驟a)所獲得的生物質，
[0273]d2)含L-賴氨酸的化合物，優選選自L-賴氨酸鹽酸鹽或L-賴氨酸硫酸鹽，
[0274]d3)基本無L-賴氨酸的物質，其L-賴氨酸含量〈1%重量、優選〈0.5%重量,優選選自淀粉、角叉菜膠、瓊脂、硅石、硅酸鹽、膳食、糠和面粉，和
[0275]d4)放水物質，優選選自油、聚乙烯二醇和液態石蠟。
[0276]通過相應于步驟dl)-d4)、特別是dl)-d3)的措施，將L-賴氨酸的含量調節至所期望的值。
[0277]在含L-賴氨酸產物的生產中，優選對離子的比例進行調節，從而使對應于下式:2X[S042-] + [Cr]-[NH4+]-[Na+]-[K+]-2X[Mg2+]-2X[Ca2+]/[L-Lys]的摩爾離子比為0.68-0.95、優選 0.68-0.90、特別優選 0.68-0.86，如 Kushiki 等人在 US20030152633 中所述。
[0278]對于L-賴氨酸的情 況，以此方式產生的固態產物具有(基于發酵液的)如下的賴氨酸含量(賴氨酸堿基):10%重量-70%重量或20%重量-70%重量、優選30%重量-70%重量及特別優選40%重量-70%重量(基于產物的干物質)。71%重量、72%重量、73%重量的最大賴氨酸堿基含量同樣是可能的。
[0279]含L-賴氨酸固態產物中的含水量達5%重量、優選達4%重量、及特別優選低于3%重量。
[0280]實施例1
[0281]DM1547gap基因的啟動子區的測序
[0282]通過多次的非定向誘變、選擇和突變體挑選從谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032制備了谷氨酸棒狀桿菌菌株DM1547。該菌株對賴氨酸類似物S- (2-氨乙基)-L-半胱氨酸具抗性。
[0283]根據布達佩斯條約，于2001年1月16日將DM1547菌株的純培養物作為DSM13994 保藏在 Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,Braunschweig, Germany)。所述菌株 DSM13994 在 EP1239040 中列出。
[0284]谷氨酸棒狀桿菌基因組ATCC13032的核苷酸序列在Iked和Nakagawa (AppliedMicrobiology and Biotechnology62,99-109 (2003))中、在 EP1108790 中以及在Kalinowski 等人(Journal of Biotechnologyl04(1-3), (2003))中有描述。谷氨酸棒狀桿菌R基因組的的核苷酸序列在Yukawa等人(Microbiologyl53 (4): 1042-1058 (2007))中有描述。
[0285]Corynebacterium efficiens 基因組的核苷酸序列在 Nishio 等人(GenomeResearch.13 (7)，1572-1579 (2003))中有描述。
[0286]谷氨酸棒狀桿菌和Corynebacterium efficiens基因組的核苷酸序列同樣可得自 National Library of Medicine(Bethesda, MD, USA)的 National Center forBiotechnology Information(NCBI)、DNA Data Bank of Japan(DDBJ, Mishima, Japan)、或者 European Molecular Biologies Laboratories(EMBL, Heidelberg, Germany,和Cambridge, UK)的核苷酸序列數據庫。[0287]通過Eikmanns 等人(Microbiologyl40:1817 - 1828 (1994))所述的方法從菌株DM1547分離染色體DNA。借助于聚合酶鏈反應來擴增含有gap基因上游區域的DNA區段。鑒于谷氨酸棒狀桿菌的gap基因的已知序列，下述寡核苷酸被用作引物:
[0288]Pgap3-1 (SEQ ID N0:31):
[0289]5 cgtttggggtcaatgtccat3
[0290]Pgap3-2 (SEQ ID NO:32):
[0291]5 cccagtccaggttctttg3
[0292]所不的引物由MWG Biotech(Ebersberg, Germany)合成。它們使得能擴增529bp的DNA區段。所述Pgap3-2引物結合對應于與SEQ ID N0:30(和SEQ ID NO:33)互補的鏈中位置742-759的區域。所述Pgap3-1引物結合對應于SEQ ID N0:30(和SEQ ID NO:33)的鏈中位置231-250的區域。 [0293]使用Phusion High Fidelity DNA 聚合酶(New England Biolabs, Frankfurt,Germany)來進行PCR反應。反應混合物依照廠商信息制備，并且在總共50 μ 1的體積中含有:10 μ 1的供應的5 XPhusion HF緩沖液，每種濃度200 μ m的脫氧核苷三磷酸，濃度0.5 μ m的引物，大約50ng的模板DNA和兩個單位的Phusion聚合酶。通過加入H20而將體積調節至50 μ 1。
[0294]所述PCR混合物首先在98°C經歷了 30秒的起始變性。這之后是35個循環的:于98°C的表型步驟20秒、引物結合DNA的步驟在60°C進行20秒、和延伸步驟在72°C延伸引物60秒。在最后于72°C的延伸步驟5分鐘之后，對PCR混合物進行瓊脂糖凝膠電泳(0.8%瓊脂糖)。鑒別出了長度大約0.53kb的DNA片段，用來自Qiagen (Hilden, Germany)的QIAquick Gel Extraction試劑盒將該片段從所述凝膠分離并純化。
[0295]由Agowa (Berlin, Germany)確定了經擴增的PCR產物的DNA片段的核苷酸序列。
[0296]菌株DM1547的gap基因啟動子區的核苷酸序列在位置379含有核堿基腺嘌呤(參見SEQ ID N0:33)。野生型的啟動子區(參見SEQ ID NO:30)在此位置含有核堿基鳥嘌呤。此突變在下文中稱作Pgap3。
[0297]實施例2
[0298]載體pK18mobsacB_IBcg0054 的構建
[0299]為表征本發明的突變體，將包含啟動子的gap基因的上游區域用于增強合成的操縱子。所述合成的操縱子由lysC基因的等位基因編碼的密集化的谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸激酶(其中在所編碼的天冬氨酸激酶蛋白中的位置311處的野生型核堿基蘇氨酸已被置換為核堿基異亮氨酸(參見W000/63388和US6，893，848))、和asd基因編碼的谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸-半醛脫氫酶所組成。所述合成的操縱子經同源重組被整合至谷氨酸棒狀桿菌染色體內的基因間區域中，以致所述插入導致了 lysC和asd基因拷貝數的增加。使得所述合成的操縱子能夠摻入的同源DNA序列由Geneart AG (Regensburg, Germany)合成。此DNA序列示于SEQ ID NO: 35并標注為IBcg0054。所述DNA序列含有383bp的基因間區域，其旁側有595bp的區域(編碼推定的膜蛋白的cg0055基因和編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的cg0057基因的部分)以及663bp的區域(編碼鐵攝取蛋白的cg0054基因的部分)。
[0300]在酶Avrll和Nsil的限制性切割位點之外，在用于插入各種DNA序列的基因間區域內的中心位置，為了亞克隆整個片段的程序而產生了限制性內切酶Muni和Hindlll的旁側切割位點。
[0301]用限制性內切酶Muni和 Hindlll 消化 1660bp 的 Geneart 片段(SEQ IDN0:35)，并繼而將其亞克隆至SchSfer等人(Gene, 145,69-73(1994))所述的可移動載體pK18mobsacB中。為此，用限制性內切酶EcoRI和Hindlll消化pK18mobsacB。將以此方式制備的載體與 IBcg0054 片段混合，并用 Ready-To-Go T4DNA Ligase 試劑盒(Amersham-Pharmacia,Freiburg, Germany)來處理該混合物。
[0302]隨后，用連接混合物轉化大腸桿菌菌株S17-1 (Simon等人，Bio/Technologiel:784-791,1993) (Hanahan, in DNA cloning.A practical approach.Vol.1.1LR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。通過將轉化混合物在補加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上鋪板來選擇攜有質粒的細胞(Sambrock等人，MolecularCloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor, New York,1989)。 [0303]借助Qiagen QIAprep Spin Miniprep試劑盒來從轉化體中分離質粒DNA,并用酶EcoRI和Hindlll的限制性切割和隨后的瓊脂糖凝膠電泳來查驗。該質粒具有名稱pK18mobsacB_IBcg0054。
[0304]實施例3
[0305]置換載體pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、
[0306]pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd和
[0307]pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT3111_asd 的構建
[0308]在含有于各自啟動子PgapWT、Pgap3和Pg3N3控制下的lysC和asd基因的合成操縱子的DNA盒(已插入實施例2所述的基因間區域)的基礎上對gap基因上游區域中的突變進行表征。所述合成操縱子由Geneart AG (Regensburg, Germany)合成并被分別命名為PgapffT_lysCT3111_asd,Pgap3_lysCT3111_asd 和 Pg3N3_lysCT311I_asd。DNA 序列分別在Seq ID No: 36 (PgapWT_lysCT311I_as)、Seq ID No: 37 (Pgap3_lysCT311I_asd)、和 Seq IDNo: 38 (Pg3N3_lysCT3111_asd)中示出。
[0309]所述gap基因的啟動子區域包含位置9-469，在此區域中的構建體的序列在每種情況對應于 Seq ID No: 2 (PgapWT)、Seq ID No: 3 (Pgap3)或 Seq ID No: 34 (Pg3N3)中所示的序列。其下游跟隨有lysC基因的等位基因所編碼的敏感性降低的谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸激酶的編碼序列，所述等位基因中在所編碼的天冬氨酸激酶的位置311處的野生型核堿基蘇氨酸已經被置換為核堿基異亮氨酸(參見W000/63388和US6，893，848)。另外，lysC起始密碼子內的核堿基鳥嘌呤已經被置換為核堿基腺嘌呤。其下游又跟隨有asd基因所編碼的谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸-半醛脫氫酶的編碼序列。所述gap基因的核糖體結合位點在每種情況中均位于所述兩個基因lysC和asd的上游(以Seq ID No: 16的形式在lysC上游，以Seq ID No:26的形式在asd上游)，并且gap基因的終止序列位于asd的下游。
[0310]為了亞克隆程序而產生了在合成操縱子旁側的酶Avrll和Nsil的限制性切割位點。
[0311]用限制性內切酶Avrll和Nsil消化所述片段，并繼而將其亞克隆至實施例2中所述的可移動載體pK18mobsacB_IBcg0054中。為此，用限制性內切酶Avrll和Nsil消化 pK18mobsacB_IBcg0054。將以此方式制備的載體與 PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd 或 Pg3N3_lysCT311I_asd 片段混合，并用 Ready-To-Go T4DNA Ligase 試劑盒(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)來處理該混合物。
[0312] 隨后，用連接混合物轉化大腸桿菌菌株S17-1 (Simon等人，Bio/Technologiel:784-791,1993) (Hanahan, in DNA cloning.A practical approach.Vol.1.1LR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。通過將轉化混合物在補加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上鋪板來選擇攜有質粒的細胞(Sambrock等人，MolecularCloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor, New York,1989)。
[0313]借助Qiagen QIAprep Spin Miniprep試劑盒來從轉化體中分離質粒DNA,并用酶Avrll和Nsil的限制性切割和隨后的瓊脂糖凝膠電泳來查驗。基于gap-啟動子等位基因，所述質粒分別被命名為 pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK 18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd 和 pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd。 pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd以示例的方式在圖1中示出。
[0314]實施例4
[0315]谷氨酸棒狀桿菌菌株DM1729_PgapWT_lysCT311I_asd、DM1729_Pgap3_lysCT311I_asd 和 DM1729_Pg3N3_lysCT311I_asd 的制備
[0316]要將突變PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd 和 Pg3N3_lysCT311I_asd引入到菌株谷氨酸棒狀桿菌DM1729中。所述菌株DM1729是谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的氨乙基半胱氨酸-抗性突變體，并且在專利申請EP1717616A2以及在Georgi等人的(Metabolic Engineering7，291 - 301 (2005))中有描述。其已經以名稱 DSM17576 保藏在 Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, Braunschweig,Germany)。
[0317]根據Schdfer 等人的方案(Journal of Microbio logy 172:1663-1666 (1990)),通過接合將實施例 3 中所述的載體，pK18mobsacB_PgapffT_lysCT3111_asd> pK18mobsacB_Pgap3_lysCT3111_asd 和 pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd 轉移至谷氛酸棒狀桿菌菌株DM1729中。所述載體在DM1729中不能自我復制，并且僅在其被整合至染色體(重組事件的結果)之后才保留在細胞中。通過將接合混合物在補加有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的LB瓊脂上鋪板來選擇轉接合子，也即具有整合的pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT3111_asd 或 pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd 的克隆。繼而將卡那霉素抗性轉接合子在補加了卡那霉素(25mg/l)的LB瓊脂平板上劃線并在33°C溫育24小時。通過在非選擇性LB液體培養基中將克隆培養30小時，隨后再將它們在補加有10%蔗糖的LB瓊脂上劃線并在33°C溫育24小時，由此選擇其中質粒由于第二次重組而被切除的突變體。
[0318]與起始質粒pK18mobsacB — 樣，質粒 pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT31ll_asd 和 pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd 在卡那霉素抗性基因之外，還包括編碼枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)的sacB基因的拷貝。所述sacB基因鹿糖誘導的表達導致形成果聚糖蔗糖酶，其催化對谷氨酸棒狀桿菌有毒的產物果聚糖的合成。因此，只有其中整合的 pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT31 ll_asd 或pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT3111_asd由于第二次重組而被切除的克隆能在補加了鹿糖的LB瓊脂上生長。根據第二次重組相對于突變位點的位置，切除包括有等位基因置換或突變的摻入、或原始拷貝保留在宿主的染色體中。
[0319]在每種情況中對其中已發生所期望置換的克隆進行篩選，也即盒PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd 或 Pg3N3_lysCT311I_asd 已摻入到基因間區域內。
[0320]為此，在每種情況中，對具有表型“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的20個克隆，用聚合酶鏈反應(PCR)檢查其中盒PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd 或 Pg3N3_lysCT311I_asd 的整合。
[0321]為此，使用了如下的合成的寡核苷酸(引物):
[0322]引物cg0054_9.p (SEQ ID N0.39):
[0323]5，CCACCCATCACCCTCACTTC3，
[0324]引物cg0054_10.p(SEQ ID N0.40):
[0325]5’ GCACTCTCGTTTGGCAGTTC3’
[0326]引物QlysC_WT_P2 (SEQ ID N0.41):
[0327]5，aagtgccgggatcattacta3，
[0328]所不的引物由MWG Biotech (Ebersberg, Germany)合成。引物 cg0054_9.p 和cg0054_10.p使得1032bp的 DNA片段能夠被擴增(如果在基因間區域存在野生型排列)。在同一反應混合物中使用能夠退火至lysC基因的另外的引物(QlysC_WT_P2)，使得1330bp的DNA片段能夠被擴增，由此特異性地檢測到合成操縱子PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd或Pg3N3_lysCT311I_asd整合至基因間區域IBcg0054。在所選擇的用于PCR的條件下，引物cg0054_9.p和cg0054_10.p的組合在整合至基因間區域的情況中不會導致產生擴增子。另外，借助于所述的檢測反應鑒別出由于技術原因而未產生擴增子的PCR反應。
[0329]使用來自Qiagen (Hilden, Germany)的Taq PCR Core試劑盒，其含有棲熱水生菌(Thermus aquaticus)的 Taq DNA聚合酶,在來自 Eppendorf (Hamburg, Germany)的熱循環儀中進行PCR反應。根據廠商的信息條件反應混合物的條件。該PCR混合物首先在94°C經歷2分鐘的初始變性。隨后是35個循環的:于94°C變性30秒的步驟、于57°C將引物結合至DNA的步驟30秒、和于72°C延伸引物60s的延伸步驟。在最后于72°C的延伸步驟5分鐘之后，通過在瓊脂糖凝膠中電泳來查驗以此方式獲得的擴增產物。
[0330]以此方式，鑒別出了其中盒 PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd 或Pg3N3_lysCT311I_asd已被整合的突變體，且在每種情況中獲得的谷氨酸棒狀桿菌菌株之一被命名為 DM1729_PgapWT_lysCT311I_asd、DM1729_Pgap3_lysCT311I_asd 和 DM1729—Pg3N3_lysCT311I_asd。
[0331]實施例5
[0332]L-賴氨酸的制備
[0333]在適宜于產生賴氨酸的營養培養基中培養實施例4中所獲得的谷氨酸棒狀桿菌菌株，DM1729_PgapffT_lysCT311I_asd, DM1729_Pgap3_lysCT311I_asd 和 DM1729_Pg3N3_lysCT311I_asd，以及起始菌株DM1729，并確定培養物上清中的賴氨酸含量。
[0334]對于此目的，首先在腦心瓊脂平板(Merck, Darmstadt, Germany)上于33°C將克隆傳代24小時。始自這些瓊脂平板的培養物，在每種情況中都接種了預培養(100ml錐形瓶中10ml培養基)。用于預培養的培養基是MM培養基。將預培養于33°C在搖床上以240rpm溫育24小時。從此預培養接種主要培養，從而使主要培養的起始0W660nm)達到0.10D。MM培養基也用于主要培養。
[0335]
【權利要求】
1.具有啟動子活性的分離的多核苷酸，其包含具有SEQID N0:3*SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的多核苷酸。
2.權利要求1的多核苷酸，特征在于其基本由具有SEQID N0:3或SEQ ID N0:34所示核苷酸序列的多核苷酸組成。
3.權利要求1或2的多核苷酸，特征在于其由SEQID NO: 3或SEQ ID NO: 34所示的序列組成。
4.權利要求3的多核苷酸，特征在于其在其3,端功能性地連接至第二多核苷酸，其中所述連接是直接連接或者通過接頭寡核苷酸的方式連接、或者通過接頭多核苷酸的方式連接，優選通過接頭多核苷酸的方式連接，其中所述第二多核苷酸在其5,端含有ATG或GTG起始密碼子并且編碼疑惑多個多肽。
5.權利要求4的多核苷酸，特征在于所述SEQID N0:3或SEQ ID N0:34的多核苷酸，經在其3’端位置461處的腺苷核苷酸，由長度1、2、3、4、或5個核苷酸的接頭寡核苷酸連接至所述第二多核苷酸起始密碼子的第一個核苷酸。
6.權利要求4的多核苷酸，特征在于所述SEQID N0:3或SEQ ID N0:34的多核苷酸，經在其3’端的腺苷核苷酸，由長度從6至不超過(<)600個核苷酸、優選長度20、21、22、23、24、或25個核苷酸的接頭多核苷酸，連接至所述第二多核苷酸起始密碼子的第一個核苷酸。
7.權利要求6的多核苷酸，特征在于所述接頭多核苷酸包含確保所合成的RNA的翻譯的核苷酸序列。
8.權利要求6-7的多核苷酸，特征在于所述接頭多核苷酸的序列基本上由SEQIDNO: 12或SEQ ID NO: 13中所示的核苷酸序列組成。
9.權利要求6-8的多核苷酸，特征在于所述接頭多核苷酸的序列由SEQID NO: 14,SEQID NO: 15、SEQ ID NO: 16、S`EQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中所示的任何核苷酸序列組成。
10.權利要求3的多核苷酸，特征在于其經過在SEQID NO: 3或SEQ ID NO:34的3’端位置461處的腺苷核苷酸，功能性地連接至接頭寡核苷酸、或連接至接頭多核苷酸，優選連接至確保RNA的翻譯的接頭多核苷酸。
11.權利要求4-9的多核苷酸，特征在于編碼一或多個多肽的第二多核苷酸由一或多個選自下列的多核苷酸組成:a)編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的Zwf亞基(Zwf，ECN0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(zwf基因)，b)編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的OpcA亞基(OpcA,ECN0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(opcA 基因),c)編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶(DevB,EC N0.:3.1.1.31)的多核苷酸(devB基因)，d)編碼轉酮醇酶(Tkt，ECN0.:2.2.1.1)的多核苷酸(tkt基因)，e)編碼轉醛醇酶(Tal，ECN0.:2.2.1.2)的多核苷酸(tal基因)，f)編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(Gnd，ECN0.: 1.1.1.44)的多核苷酸(gnd基因)，g)編碼核酮糖磷酸3-差向異構酶(Rpe，ECN0.:5.1.3.1)的多核苷酸(rpe基因)，h)編碼核糖-5-磷酸異構酶B(Rpi，ECN0.:5.3.1.6)的多核苷酸(rpi基因)，i)編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc，ECN0.:4.1.1.31)的多核苷酸(ppc基因)，j)編碼果糖1，6- 二磷酸酶(Fbp, EC N0.:3.1.3.11)的多核苷酸(fbp基因)，k)編碼丙酮酸羧化酶(Pyc，EC N0.:6.4.1.1)的多核苷酸(pyc基因)，I)編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DapA，ECN0.:4.2.1.52)的多核苷酸(dapA基因)，m)編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶(Asd，EC N0.:1.2.1.11)的多核苷酸(asd基因)，η)編碼內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(Ddh，EC N0.:1.4.1.16)的多核苷酸(ddh基因)，ο)編碼二氨基庚酸脫羧酶(LysA，EC N0.:4.1.1.20)的多核苷酸(lysA基因)，P)編碼天冬氨酸氨基轉移酶(Aat，EC N0.:2.6.1.1)的多核苷酸(aat基因)，q)編碼具有L-賴氨酸輸出活性的多肽(LysE，賴氨酸流出通透酶)的多核苷酸(lysE基因)，r)編碼二氫吡啶二羧酸還原酶(DapB, EC N0.:1.3.1.26)的多核苷酸(dapB基因)，s)編碼天冬氨酸激酶(LysC，EC N0.:2.7.2.4)的多核苷酸(lysC基因)，t)編碼琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉移酶，AT I類(DapC，EC N0.:2.6.1.17)的多核苷酸(dapC基因)，u)編碼四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶(DapD，EC N0.:2.3.1.117)的多核苷酸(dapD基因)，v)編碼琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰酶 (DapE，EC N0.:3.5.1.18)的多核苷酸(dapE基因)，w)編碼二氨基庚二酸差向異構酶(DapF，EC N0.:5.1.1.7)的多核苷酸(dapF基因)，X)編碼乙酰乳酸合酶的亞基(IlvBN，EC N0.:4.1.3.18)的多核苷酸(ilvB基因和ilvN基因)，y)編碼還原異構酶(IlvC,EC N0.:1.1.1.86)的多核苷酸(ilvC基因)，z)編碼二羥酸脫水酶(IlvD，EC N0.:4.2.1.9)的多核苷酸(ilvD基因)，aa)編碼轉氨酶(IlvE,EC N0.:2.6.1.42)的多核苷酸(ilvE基因)，bb)編碼蘇氨酸脫水酶(IlvA，EC N0.:4.3.1.19)的多核苷酸(ilvA基因)，cc)編碼高絲氨酸脫氫酶(Horn, EC-N0.:1.2.1.11)的多核苷酸(hom基因)，dd)編碼高絲氨酸激酶(ThrB, EC-N0.:2.7.1.39)的多核苷酸(thrB基因)，ee)編碼蘇氨酸合酶(ThrC，EC-N0.:4.2.3.1)的多核苷酸(thrC基因)，ff)編碼異丙基蘋果酸合酶(LeuA，EC-N0.:2.3.3.13)的多核苷酸(leuA基因)，gg)編碼異丙基蘋果酸脫氫酶(LeuB, EC-N0.:1.1.1.85)的多核苷酸(leuB基因)，hh)編碼異丙基蘋果酸異構酶的大亞基(LeuC，EC-N0.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuC基因)，?)編碼異丙基蘋果酸異構酶的小亞基(LeuD，EC-N0.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuD基因)，jj)編碼賴氨酸/鳥氨酸轉運蛋白(DE申請號102010003419.3)的多核苷酸(lysE基因)，kk)編碼N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB，EC-N0.:2.7.2.8)的多核苷酸(argB基因)，II)編碼谷氨酸脫氫酶(Gdh，EC-N0.: 1.4.1.3)的多核苷酸(gdh基因)，mm)編碼谷氨酸N-乙酰基轉移酶(ArgJ，EC-N0.:2.3.1.35和EC_N0.:2.3.1.1)的多核苷酸(argj基因)，nn)編碼N-乙酰基-y-谷氨酰磷酸還原酶(ArgC，EC-N0.:1.2.1.38)的多核苷酸(argC基因)，和00)編碼乙酰鳥氨酸氨基轉移酶(ArgD，EC-N0.:2.6.1.11)的多核苷酸(argD基因).
12.包含權利要求1-11中任意項的多核苷酸的載體。
13.包含權利要求1-11中任意項的多核苷酸的微生物。
14.包含權利要求12的載體的微生物。
15.權利要求13的微生物，特征在于所述多核苷酸整合至染色體中。
16.權利要求13-15中任意項的微生物，特征在于其是棒狀桿菌(Corynebacterium)屬的細菌，優選是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
17.權利要求16的微生物，特征在于權利要求1-11中任意項的具有啟動子活性的分離的多核苷酸在染色體中.1)已經與第二多核苷酸的天然基因座處的天然啟動子置換，或者2)已經與第二多核苷酸在后者的基因座處或者在另一基因座處整合，其中編碼一或多個多肽的第二多核苷酸由一或多個選自下列的多核苷酸組成:a)編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的Zwf亞基(Zwf，ECN0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(zwf基因)， b)編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的OpcA亞基(OpcA,EC N0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(opcA 基因),c)編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶(DevB,EC N0.:3.1.1.31)的多核苷酸(devB基因)，d)編碼轉酮醇酶(Tkt,EC N0.:2.2.1.1)的多核苷酸(tkt基因)，e)編碼轉醛醇酶(Tal,EC N0.:2.2.1.2)的多核苷酸(tal基因)，f)編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(Gnd，ECN0.: 1.1.1.44)的多核苷酸(gnd基因)，g)編碼核酮糖磷酸3-差向異構酶(Rpe，ECN0.:5.1.3.1)的多核苷酸(rpe基因)，h)編碼核糖-5-磷酸異構酶B(Rpi，EC N0.:5.3.1.6)的多核苷酸(rpi基因)，i)編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc，ECN0.:4.1.1.31)的多核苷酸(ppc基因)，j)編碼果糖1，6- 二磷酸酶(Fbp, EC N0.:3.1.3.11)的多核苷酸(fbp基因)，k)編碼丙酮酸羧化酶(Pyc，EC N0.:6.4.1.1)的多核苷酸(pyc基因)，1)編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DapA，EC N0.:4.2.1.52)的多核苷酸(dapA基因)，m)編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶(Asd，EC N0.:1.2.1.11)的多核苷酸(asd基因)，η)編碼內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(Ddh，EC N0.:1.4.1.16)的多核苷酸(ddh基因)，ο)編碼二氨基庚酸脫羧酶(LysA，EC N0.:4.1.1.20)的多核苷酸(lysA基因)，P)編碼天冬氨酸氨基轉移酶(Aat，EC N0.:2.6.1.1)的多核苷酸(aat基因)，q)編碼具有L-賴氨酸輸出活性的多肽(LysE，賴氨酸流出通透酶)的多核苷酸(lysE基因)，r)編碼二氫吡啶二羧酸還原酶(DapB, EC N0.:1.3.1.26)的多核苷酸(dapB基因)，s)編碼天冬氨酸激酶(LysC，EC N0.:2.7.2.4)的多核苷酸(lysC基因)，t)編碼琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉移酶，AT I類(DapC，EC N0.:2.6.1.17)的多核苷酸(dapC基因)，u)編碼四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶（DapD，EC NO. :2. 3. 1. 117)的多核苷酸（dapD基因）， v)編碼琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰酶（DapE，EC NO. :3. 5. 1. 18)的多核苷酸（dapE 基因），w)編碼二氨基庚二酸差向異構酶（DapF，EC NO. :5. 1. 1. 7)的多核苷酸（dapF基因）， x)編碼乙酰乳酸合酶的亞基（IlvBN，EC No. :4. 1. 3. 18)的多核苷酸（ilvB基因和ilvN 基因），y)編碼還原異構酶(IlvC,EC No. :1. 1. 1.86)的多核苷酸（ilvC基因），z)編碼二羥酸脫水酶（IlvD，EC No. :4. 2. 1. 9)的多核苷酸（ilvD基因），aa)編碼轉氨酶(IlvE,EC No. :2. 6. 1.42)的多核苷酸（ilvE基因），bb)編碼蘇氨酸脫水酶（IlvA，EC No. :4. 3. 1. 19)的多核苷酸（ilvA基因），cc)編碼高絲氨酸脫氫酶(Horn, EC-No. : 1. 2. 1. 11)的多核苷酸（hom基因），dd)編碼高絲氨酸激酶(ThrB, EC-No. :2. 7. 1. 39)的多核苷酸（thrB基因），ee)編碼蘇氨酸合酶（ThrC，EC-No. :4. 2. 3. 1)的多核苷酸（thrC基因），ff)編碼異丙基蘋果酸合酶（LeuA，EC-No. :2. 3. 3. 13)的多核苷酸（leuA基因），gg)編碼異丙基蘋果酸脫氫酶(LeuB, EC-No. : 1. 1. 1. 85)的多核苷酸（leuB基因），hh)編碼異丙基蘋果酸異構酶的大亞基（LeuC，EC-No. :4. 2. 1. 33)的多核苷酸（leuC基因），ii)編碼異丙基蘋果酸異構酶的小亞基（LeuD，EC-No. :4. 2. 1. 33)的多核苷酸（leuD基因），jj)編碼賴氨酸/鳥氨酸轉運蛋白（DE申請號102010003419.3)的多核苷酸（lysE基因），kk)編碼N-乙酰谷氨酸激酶（ArgB，EC-NO. :2. 7. 2. 8)的多核苷酸（argB基因），11)編碼谷氨酸脫氫酶（Gdh，EC-No. : 1. 4. 1. 3)的多核苷酸(gdh基因）， mm)編碼谷氨酸N-乙酰基轉移酶（ArgJ，EC-No. :2. 3. 1. 35和EC_No. :2. 3. 1. 1)的多 核苷酸（argj基因），nn)編碼N-乙酰基-Y-谷氨酰磷酸還原酶（ArgC，EC-No. : 1. 2. 1.38)的多核苷酸 (argC基因），和oo)編碼乙酰鳥氨酸氨基轉移酶（ArgD，EC-No. :2. 6. 1. 11)的多核苷酸(argD基因)。
18.權利要求13-17中任意項的微生物，特征在于所述微生物能夠產生精細化學品。
19.權利要求18的微生物，特征在于所述精細化學品是：L-氨基酸，優選選自L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、L-纈 氨酸、和L-色氨酸,或者有機酸，優選a-酮酸，特別是選自a-酮異己酸、a-酮戊酸、和酮-0 -甲基戍 酸的a-酮酸.
20.制備精細化學品的方法，特征在于其包括步驟：a)在發酵培養基中發酵權利要求13-19任意項所定義的微生物以形成發酵液b)在a)的發酵液中和/或在微生物的細胞中積累精細化學品。
21.權利要求20的制備精細化學品的方法，特征在于所述方法選自分批方法、分批加 料方法、重復分批加料方法、和連續方法。
22. 權利要求20-21的制備精細化學品的方法，特征在于從含有所述精細化學品的發酵液中回收所述精細化學品或者液態或固態的含精細化學品的產物。
【文檔編號】C12R1/15GK103635578SQ201280031927
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年6月22日 優先權日:2011年6月28日
【發明者】A·雷特, B·巴特, S·漢斯, W·克萊斯 申請人:贏創德固賽有限公司