呈遞融合多肽的氨基酸序列及其用途
【專利摘要】本發明中報道式(I)的融合多肽：NH2-S2-X1-S1-COOH(式I)，其中X1包含隨機的氨基酸序列，或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列；S2和S1是衍生自第二多肽的非重疊氨基酸序列；且-表示肽鍵；其中該第二多肽是具有肽基脯氨酰順／反異構酶活性(PPI酶活性)的多肽，或是衍生自FKBP折疊結構域家族的多肽，其中插入X1來取代該第二多肽的插入flap結構域。
【專利說明】呈遞融合多肽的氨基酸序列及其用途
[0001 ] 本文報道包含一種或多種肽基脯氨酰順/反異構酶或FKBP家族成員的一個或多個片段的融合多肽，及其在用于抗體篩選/選擇、用于表位定位的方法中的用途，以及其在產生特異性結合該融合多肽呈遞的免疫原性肽或二級結構的抗體中作為免疫原的用途。
【背景技術】
[0002]近年來，治療性抗體的產生穩定增長，治療性抗體可能將在不久的將來成為可用于治療多種疾病的療法中最大的一組。治療性抗體的影響源自其特異性，如特異性靶標識別和結合功能。
[0003]可以從用免疫原免疫的實驗動物獲得抗體。免疫原在大多數情況下是多肽或多肽的片段。為了以足夠的量和純度提供免疫原，可以利用重組產生的免疫原。
[0004]通常，原核和真核細胞可以用于重組產生多肽。重組多肽可以以可溶性形式或作為沉淀(包含體)獲得。在層析純化之前，必須增溶包含在包含體中的不溶性多肽。
[0005]通常，免疫原是合成的或肽類的或重組產生的或融合或嵌合的或支持物綴合的多肽。對于免疫，免疫原可以單獨施用或與佐劑(如弗氏佐劑)組合施用。
[0006]Knappe, T.A.等(J.Mol.Biol.368 (2007) 1458-1468)報道了可以用結構上相關的大腸桿菌(E.coli)蛋白伴侶SlyD的IF結構域來取代FKBP12的Flap區。與分離的多肽相比，嵌合的FKBP12-SlyD融合多肽具有提高200倍的肽基脯氨酰順/反異構酶活性。
[0007]大腸桿菌SlyD和FKBP12(野生型及突變體C23A和C23S)可以以可溶性形式在大腸桿菌中高產量重組產生(Standaert，R.F.等，Nature346 (1990) 671-674)。
[0008]衍生自嗜熱生物的FKBP和大腸桿菌SlyD可以在融合多肽在大腸桿菌中的重組表達中用作蛋白伴侶(Ideno, A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.64(2004)99-105)。大腸桿菌SlyD和FKBP12多肽是可逆折疊的多肽(Scholz，C.等，J.Biol.Chem.271 (1996) 12703-12707)。
[0009]FKBP12多肽的氨基酸序列在60位處包含單個色氨酸殘基。因此，可以簡單地通過分析色氨酸熒光來分析FKBP12突變體的結構完整性(DeCenzo，M.T.等，ProteinEng.9(1996) 173-180)。可以通過測定保留的旋轉異構酶活性來進行FKBP12突變體保留的催化活性的測試(Brecht, S.等，Neurosciencel20 (2003) 1037-1048 ；Schories, B.等，J.Pept.Sc1.13 (2007) 475-480 ；Timerman, A.P.等，J.Biol.Chem.270 (1995) 2451-2459)。還可能通過測定FK506或納巴霉素結合來測定FKBP12突變體的結構完整性(DeCenzo，M.T.等，Protein Eng.9 (1996) 173-180)。
[0010]McNamara, A.等(J.0rg.Chem.66 (2001) 4585-4594)報道了通過兩個 C(a)位間的脂肪族連接限制的肽:i，(i+4)_連接肽的設計、合成及意料之外的構象特性。
[0011]Suzuki 等(Suzuki, R.等，J.Mol.Biol.328 (2003) 1149-1160)報道了具有肽基脯氨酰順/反異構酶和蛋白伴侶樣活性的雙功能的古細菌(archaic)FKBP的三維溶液結構。EP1516928中報道了表達載體、宿主、融合多肽、用于產生融合多肽的方法和用于產生蛋白質的方法。Knappe，T.A.等報道了蛋白伴侶結構域的插入將FKBP12轉化為有力的蛋白質折疊催化劑(J.Mol.Biol.368 (2007) 1458-1468)。W02007 / 077008 中報道了具有優良的蛋白伴侶活性和折疊活性的嵌合融合多肽。在W003 / 000878中，報道了 FKBP蛋白伴侶作為表達工具的用途。在EP1621555中，報道了免疫原、用于免疫學用途的組合物及用其產生抗體的方法。Rebuzzini, G.(在Milano-Bicocca大學(意大利)的博士研究(2009))報道了應用于化學發光免疫測定的丙型肝炎病毒NS3解旋酶結構域的研究。[0012]在W02007 / 077008中，報道了具有優良的蛋白伴侶活性和折疊活性的嵌合融合蛋白質。Knappe 等(Knappe, T.A.等，J.Mol.Biol.368 (2007) 1458-1468)報道了通過插入蛋白伴侶結構域來將FKBP12轉化為有力的蛋白質折疊催化劑。
[0013]發明概述
[0014]本文中報道的融合多肽是這樣的融合多肽，其包含:i)衍生自具有PPI酶活性或隸屬于FKBP家族的一種(即相同)或不同多肽的一個或多個部分jPii)插入其間的免疫原性多肽。
[0015]本文中報道的融合多肽可以用于免疫動物來產生特異性結合插入衍生自具有PPI酶活性或隸屬于FKBP家族的一種或多種多肽的一個或多個部分的免疫原性多肽的抗體。
[0016]本文中報道的一個方面是式I的融合多肽
[0017]NH2-S2-X1-S1-COOH (式 I)
[0018]其中
[0019]X1包含隨機的氨基酸序列，或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列；
[0020]S2和S1是衍生自第二多肽的非重疊氨基酸序列；且
[0021]-表示肽鍵；
[0022]其中該第二多肽是具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性(PPI酶活性)的多肽，或是衍生自FKBP結構域家族的多肽。
[0023]已發現，可以用本文中報道的融合多肽來獲得特異性結合(天然存在的)氨基酸序列的內部(所謂的隱藏或埋藏)表位的抗體。內部表位在經典的免疫流程中不可接近，因為這些表位例如僅在抗原性多肽(如受體)活化和伴隨的構象變化時可接近。此外，可以獲得特異性結合免疫原性多肽的抗體，該免疫原性多肽衍生自否則將難以以足夠的量或質量提供的結構。
[0024]本文中報道的融合多肽是嵌合、重組多肽，其可以例如在用于抗體篩選/選擇或用于表位定位的方法中用于肽、二級和三級結構展示，以及用作用于產生特異性結合所呈遞的抗原性氨基酸序列或二級結構的抗體的免疫原。本文中報道的多肽可以重組產生，熱力學穩定，是單體，且在水溶液中可溶。
[0025]本文中報道的一個方面是式II的融合多肽
[0026]NH2-S4-X2-S3-S2-X1-S1-S0-COOH(式 II)
[0027]其中
[0028]X1包含隨機的氨基酸序列，或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列；
[0029]S2和S1是衍生自第二多肽的非重疊氨基酸序列；
[0030]S3和Stl缺乏，或是衍生自第三多肽的非重疊氨基酸序列；
[0031]S4缺乏，或是衍生自第四多肽的氨基酸序列；
[0032]X2缺乏，或是肽接頭序列；且[0033]-表不妝鍵；
[0034]其中該第二多肽和該第三多肽和該第四多肽相互不同，且是具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性(PPI酶活性)的多肽，或是衍生自FKBP結構域家族的多肽。
[0035]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性或衍生自FKBP結構域家族的第二多肽是SlyD。
[0036]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是來自嗜熱生物的多肽。
[0037]在一個實施方案中，該嗜熱生物是嗜熱菌。在一個實施方案中，該嗜熱菌來自棲熱菌科(Thermaceae)。在一個實施方案中，該嗜熱生物是嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)。
[0038]在一個實施方案中，該嗜熱生物是嗜熱古細菌(Archaea)。在一個實施方案中，該嗜熱古細菌是超嗜熱古細菌。在一個實施方案中，該嗜熱生物來自熱球菌綱(Thermococci)。在一個實施方案中，該嗜熱生物是 Thermococcus gammato lerans。
[0039]在一個實施方案中，該嗜熱生物具有至少60°C的最適生長溫度。
[0040]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該免疫原性序列包含在X1氨基酸序列中。在一個實施方案中，該X1氨基酸序列包含免疫原性序列，及衍生自具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性(PPI酶活性)的其他多肽的一個或多個部分或衍生自來自FKBP折疊結構域家族的其他多肽的一個或多個部分，該其他多肽由此不同于第二多肽。
[0041]插入X1的氨基酸序列來取代第二多肽的插入flap結構域(IF結構域)。因此，如果X1與IF結構域相同，即具有IF結構域的氨基酸序列，則融合多肽S2-X1-S1與天然存在的第二多肽的對應部分相同。
[0042]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，衍生自第二多肽的S2和S1氨基酸序列通過野生型(天然存在的)第二多肽中的IF結構域相互連接(直接)。
[0043]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，插入X1來取代第二多肽的插入flap結構域(IF結構域)。
[0044]本文中報道的一個方面是在排除X1測定時，與式I的多肽具有至少70%氨基酸序列同一性的多肽，或是在排除Xp X2和缺失的序列測定時，與式II的多肽具有至少70%氨基酸序列同一丨I"生的多肽。在一個實施方案中，該多肽具有至少80%氨基酸序列同一丨丨生。在一個實施方案中，該多肽具有至少90%氨基酸序列同一丨丨生。在一個實施方案中，該多肽具有至少95%氨基酸序列同一性。在一個實施方案中，該多肽具有至少98%氨基酸序列同一性。
[0045]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1包含對應于隱藏表位的氨基酸序列。
[0046]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1具有從4至約500個氨基酸殘基的氨基酸序列長度。在一個實施方案中，X1具有從5至約100個氨基酸殘基的氨基酸序列長度。在一個實施方案中，X1具有約7至約60個氨基酸殘基的氨基酸序列長度。
[0047]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1的至少一個氨基酸殘基包含翻譯后修飾。在一個實施方案中，X1的一個或兩個或三個或四個或五個或六個或七個或八個或九個或十個氨基酸殘基包含翻譯后修飾。[0048]在一個實施方案中，該融合多肽按照下式
[0049]NH2-S3-S2-X1-S1-S0-COOH
[0050]其中
[0051]X1包含隨機的氨基酸序列，或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列，
[0052]S2和S1是衍生自第二多肽的非重疊氨基酸序列，
[0053]S3和Stl缺失，或是衍生自第三多肽的非重疊氨基酸序列，且
[0054]-表示肽鍵，
[0055]其中該第二多肽和該第三多肽相互不同，且是具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性(PPI酶活性)的多肽，或是衍生自FKBP結構域家族的多肽。
[0056]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽和該第三多肽和該第四多肽來自不同的物種。
[0057]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是人多肽，或植物多肽，或細菌多肽，或古細菌多肽。
[0058]在本文中報 道的所有方面的一個實施方案中，該第三多肽是人多肽，或細菌多肽，或古細菌多肽。
[0059]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第四多肽是細菌多肽，或古細菌多肽。
[0060]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第四多肽是細菌多肽。在一個實施方案中，該細菌多肽是來自嗜熱菌的多肽。在一個實施方案中，該嗜熱生物來自棲熱菌科。在一個實施方案中，該嗜熱生物是嗜熱棲熱菌。
[0061]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第四多肽是古細菌多肽。在一個實施方案中，該古細菌多肽是來自超嗜熱古細菌的多肽。在一個實施方案中，該嗜熱生物來自熱球菌綱。在一個實施方案中，該古細菌生物是Thermococcus gammatoIeranS。
[0062]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該嗜熱生物具有至少60°C的最適生長溫度。
[0063]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第一多肽是人多肽。
[0064]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1是隨機氨基酸序列，或是衍生自第一多肽的氨基酸序列，其中在N端加上二肽GS，在C端加上三肽GSS。
[0065]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1是式III的多肽
[0066]XaXbXcXd-X0-XeXfXgXh(式 III)
[0067]其中Xtl是隨機氨基酸序列或第一多肽的氨基酸序列；且
[0068]其中Xa至Xh中的每一個表示(天然存在的)氨基酸殘基，且Xa_h中的任一個可以獨立地存在或缺乏。
[0069]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1是選自式IV至式XIII (見下)的多肽
[0070]GS-X0-GSS(式 IV);
[0071]AGS-X0-GSS(式 V);
[0072]CG-X0-GC(式 VI)；
[0073]C-X0-GC(式 VII);[0074]G-X0-G(式 VII I);
[0075]S-X0-GSS(式 IX);
[0076]GG-X0-GG(式 X);
[0077]G-X0-TGG(式 XI)；
[0078]GGGS-X0-GGGS(式 XII);
[0079]GGNP-X0-GPT(式 XII I); [0080]其中Xtl是隨機氨基酸序列，或是衍生自第一多肽的氨基酸序列。
[0081]在一個實施方案中，X。在其N端和C端由單個(單一)半胱氨酸殘基位于側翼。
[0082]在一個實施方案中，X1包含N端氨基酸殘基內的半胱氨酸殘基和C端氨基酸殘基內的半胱氨酸殘基。在一個實施方案中，該N端或C端氨基酸殘基是八個末端殘基。在一個實施方案中，X1在其N端包含一個半胱氨酸殘基，在其C端包含一個半胱氨酸殘基。
[0083]在一個實施方案中，X1是環狀受限的(circularly constrained)多肽。
[0084]在一個實施方案中，X1是環狀多肽。
[0085]在一個實施方案中，X1的半胱氨酸殘基具有4.3埃至6.5埃的a碳原子距離。在一個實施方案中，X1的半胱氨酸殘基具有4.5埃的a碳距離。在一個實施方案中，X1的半胱氨酸殘基具有5.6埃的平均a碳原子距離。
[0086]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1或Xtl具有從4至約500個氨基酸殘基的長度。
[0087]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X2是從約10至約30個氨基酸殘基的接頭氨基酸序列。
[0088]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥(Arabidopsisthaliana) FKBP13(SEQ ID NO:01)，或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S4、X2、SjP Stl缺乏。在一個實施方案中，S2具有氨基酸序列 SEQ ID NO:02 (DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S4,X2> S3和Stl缺乏。在一個實施方案中，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:04，S1具有氨基酸序列 SEQ ID NO:05, S4, X2, S3 和 S0 缺乏，X1 是式 IV(GS-X0-GSS)的多肽。
[0089]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是人FKBP12 (SEQ IDNO:06)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S4、X2、S# Stl缺乏。在一個實施方案中，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO =OTjS1具有氨基酸序列 SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE)，S4、X2、S3 和 S。缺乏，X1 是式 III (GS-X0-GSS)或式 VI ((P) CG-X0-GC)的多肽。
[0090]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是嗜熱棲熱菌SlyD(SEQID NO:09)，或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，S4, X2, S3和Stl缺乏。在一個實施方案中，S2具有氨基酸序列SEQ IDNO:10, S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:11，S4、X2、S3 和 S0 缺乏，X1 是式 V(AGS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
[0091]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第三多肽是人FKBP12 (SEQ ID NO:06)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S4和X2缺乏。在一個實施方案中，S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02 (DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S0 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE)，S4 和 X2 缺乏，X1 是式 IV (GS-X0-GSS)或式 VI ((P) CG-X0-GC)的多肽。
[0092]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第三多肽是嗜熱棲熱菌SlyD (SEQ ID NO:09)，或具有至少70 %，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S4和X2缺乏。在一個實施方案中，S3具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO: 02(DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S0 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:
11(LVFDVELLKLE)，S4 和 X2 缺乏，X1 是式 IV (GS-X0-GSS)或式 VI ((P) CG-X0-GC)的多肽。
[0093]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第三多肽是人FKBP12 (SEQ ID NO:06)，或具有至少70 %，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S4和X2缺乏。在一個實施方案中，S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:
02(DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S0 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE)，S4 和 X2 缺乏，X1 是式 IV (GS-X0-GSS)或式 VI ((P) CG-X0-GC)的多肽。
[0094]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第三多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是大腸桿菌SlyD (SEQ ID NO: 12)，或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12, X2具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13，S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02 (DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S0 具有氨基酸序列SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE)，X1 是式 IV(GS-Xc1-GSS)或式 VI ((P) CG-Xq-GC)的多肽。
[0095]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第三多肽是嗜熱棲熱菌SlyD(SEQ ID NO:09)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是大腸桿菌SlyD (SEQ ID NO: 12)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13, S3具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列 SEQ ID NO:02 (DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S0 具有氨基酸序列 SEQ ID NO Ji(LvfdvELLKLE)J1 是式 IV(GS-X0-GSS)或式 VI ((P)CG-Xtl-GC)的多肽。
[0096]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是嗜熱棲熱菌SlyD(SEQID NO:09)，或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是大腸桿菌SlyD(SEQ ID NO: 12)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S3和Stl缺乏。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12, X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:10, S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，S3和Stl缺乏，X1是式V (AGS-X0-GSS)或式 VI (⑵ CG-Xtl-GC)的多肽。
[0097]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是大腸桿菌SlyD(SEQ ID NO: 12)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，S3和Stl缺乏。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12, X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:04, S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:05，S3和Stl缺乏，X1是式IV (GS-X0-GSS)或式 VI (⑵ CG-Xtl-GC)的多肽。
[0098]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是Thermococcusgammato lerans SlyD (SEQ ID NO: 106),或具有至少 70%,或至少 80%,或至少 90%,或至少95%，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，S4、X2、SjP Stl缺乏。在一個實施方案中，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:107, S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:108，S4、X2、S3和S0缺乏，X1是選自式IV至式XIII的多肽。
[0099]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多妝，該第三多妝是 Thermococcus gammato lerans SlyD (SEQ ID NO: 106),或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，S4和X2缺乏。在一個實施方案中，S3具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列 SEQ ID NO:02 (DRGAGC)，S1 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:03 (CLIPPASV)，S0 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 108，S4和X2缺乏，X1是選自式IV至式XIII的多肽。
[0100]在本文中報道的所有 方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第三多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是Thermococcus gammato lerans SlyD (SEQ ID NO: 106),或具有至少 70%,或至少 80%,或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:106, X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13，S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO: 02 (DRGAGC)，S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:
03(CLIPPASV)，S。具有氨基酸序列 SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE), X1 是選自式 IV 至式 XIII的多肽。
[0101]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13 (SEQID NO:01),或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多妝，該第三多妝是 Thermococcus gammato lerans SlyD (SEQ ID NO:106),或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是大腸桿菌SlyD (SEQ ID NO: 12)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在具體實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12, X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13，S3具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列，S2具有氨基酸序列SEQ ID NO: 02 (DRGAGC)，S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:
03(CLIPPASV)，S。具有氨基酸序列SEQ ID NO: 108，X1是選自式IV至式XIII的多肽。
[0102]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是Thermococcusgammato lerans SlyD (SEQ ID NO: 106),或具有至少 70%,或至少 80%,或至少 90%,或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多肽，該第四多肽是大腸桿菌SlyD(SEQ ID NO:12)，或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，S3和Stl缺乏。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12，X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13, S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:107，S1具有氨基酸序列SEQ IDNO:108, S3和S。缺乏，X1是選自式IV至式XIII的多肽。
[0103]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，該第二多肽是擬南芥FKBP13(SEQID NO:01)，或具有至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%氨基酸序列同一性的多妝，該第四多妝是 Thermococcus gammato lerans SlyD (SEQ ID NO: 106),或具有至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至少95 %，或至少98 %氨基酸序列同一性的多肽，SJP Stl缺乏。在一個實施方案中，S4具有氨基酸序列SEQ ID NO: 107，X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13, S2具有氨基酸序列SEQ ID NO =OlS1具有氨基酸序列SEQ ID NO:05，S3和Stl缺乏，X1是選自式IV至式XIII的多肽。
[0104]本文中報道的 方面的融合多肽具有許多應用，因為它們可以例如在大腸桿菌中以良好的產量重組產生。例如，該融合多肽可以用于呈遞用于免疫的氨基酸序列、抗體產生、抗體篩選、抗體表位定位或免疫組織化學篩選。
[0105]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X2具有氨基酸序列GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SE Q ID NO: 14)。
[0106]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，X1具有氨基酸序列GGGSGGNPX0GPTGGGS (SEQ ID NO:32)，其中X。是從4至85個氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0107]在一個實施方案中，用包含大腸桿菌SlyD和人FKBP12氨基酸序列的融合多肽來呈遞非穩定構象的多肽。
[0108]在一個實施方案中，用包含人FKBP12和擬南芥FKBP13，或僅嗜熱棲熱菌SlyD，或嗜熱棲熱菌 SlyD 和擬南芥 FKBP13,或僅 Thermococcus gammato lerans SlyD,或Thermococcus gammato lerans SlyD和擬南芥FKBP13氨基酸序列的融合多肽來呈遞穩定的
二級結構。
[0109]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在在動物中引發針對X1或Xtl的免疫反應中的用途。
[0110]本文中報道的一個方面是用于在動物中引發針對多肽的免疫反應的方法，其包括對該動物施用本文中報道的融合多肽至少一次的步驟，X0由此是免疫原性氨基酸序列。
[0111]本文中報道的一個方面是用于獲得編碼特異性結合靶抗原的抗體的核酸的方法，其包括以下步驟:
[0112]a)對動物施用本文中報道的融合多肽至少一次，X1的氨基酸序列由此包含該靶抗原的氨基酸序列；
[0113]b)最后一次施用該多肽后三至十天從該動物回收產生特異性結合該靶抗原的抗體的B細胞；
[0114] c)從該B細胞獲得編碼特異性結合靶抗原的抗體的核酸。
[0115]本文中報道的一個方面是用于產生特異性結合靶抗原的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0116]a)對動物施用本文中報道的融合多肽至少一次，X1的氨基酸序列由此包含該靶抗原的氨基酸序列；
[0117]b)最后一次施用該多肽后三至十天從該動物回收產生特異性結合該靶抗原的抗體的B細胞；
[0118]c)可選地從該B細胞獲得編碼特異性結合該靶抗原的抗體的核酸；和
[0119]d)培養包含編碼特異性結合該靶抗原的抗體的核酸的細胞，并從該細胞或培養基回收該抗體，從而產生特異性結合靶抗原的抗體。
[0120]本文中報道的一個方面是用于產生特異性結合靶抗原的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0121]a)施用本文中報道的融合多肽后從實驗動物回收產生特異性結合具有Xtl的氨基酸序列的靶抗原的抗體的B細胞；和
[0122]b)培養包含編碼特異性結合Xtl的氨基酸序列的抗體的核酸的細胞，并從該細胞或培養基回收該抗體，從而產生特異性結合靶抗原的抗體。
[0123]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在表位定位中的用途，X1的氨基酸序列由此包含該表位。
[0124]本文中報道的一個方面是用于選擇特異性結合靶抗原的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0125]a)測定多種抗體與靶抗原的結合親和力，本文中報道的融合多肽的X1的氨基酸序列由此包含該靶抗原的氨基酸序列；
[0126]b)選擇具有高于預定閾值水平的表觀復合物穩定性的抗體。
[0127]本文中報道的一個方面是用于選擇適合用于靶多肽的免疫組織化學分析的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0128]a)測定多種抗體的結合動力學；
[0129]c)選擇具有高于預定閾值水平的表觀復合物穩定性的抗體。
[0130]本文中報道的一個方面是用于定位抗體與靶氨基酸序列的結合部位的方法，其包括以下步驟:
[0131]a)使固定了本文中報道的融合多肽的固體支持物與抗體接觸，X1的氨基酸序列由此包含該靶氨基酸序列；
[0132]b)測定該抗體與本文中報道的融合多肽的動力學特性；
[0133]c)選擇具有高于預定閾值水平的表觀復合物穩定性的抗體。
[0134]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在測定結構-功能關系中的用途，X1的氨基酸序列由此包含將測定其結構-功能關系的多肽。
[0135]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在以其正確的二級和/或三級結構呈遞多肽中的用途，X1的氨基酸序列由此包含該多肽。
[0136]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在篩選方法中的用途。[0137]在一個實施方案中，該篩選方法是用于鑒定或選擇特異性結合X1的分子的篩選方法。在一個實施方案中，該分子是小分子或多肽。在一個實施方案中，該多肽是抗體，或抗體片段，或抗體融合多肽。
[0138]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在核糖體展示中的用途。
[0139]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在噬菌體展示中的用途。
[0140]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在細胞表面展示中的用途。在一個實施方案中，該細胞是原核細胞。在一個實施方案中，該原核細胞是細菌細胞。在一個實施方案中，該細胞是真核細胞。在一個實施方案中，該真核細胞是CHO細胞，或HEK細胞，或BHK細胞，或Sp2 / 0細胞，或NSO細胞，或酵母細胞。
[0141]本文中報道的一個方面是通過本文中報道的方法產生的抗體。
[0142]本文中報道的一個方面是包含本文中報道的融合多肽和可藥用載體的藥物制劑。
[0143]本文中報道的一個方面是診斷制劑，其包含與可檢測標記綴合的本文中報道的融合多肽。
[0144]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在制備藥物中的用途。
[0145]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽在治療疾病中的用途。
[0146]本文中報道的一個方面是處理個體的方法，其包括對該個體施用有效量的本文中報道的融合多肽。
[0147]發明詳述
[0148]通常，插入例如包含在X1的氨基酸序列中的抗原或抗原性或免疫原性氨基酸序列來取代本文中報道的融合多肽中第二多肽的SlyD部分的插入flap結構域(IF結構域)。
[0149]在本文中報道的所有方面的一個實施方案中，Xtl選自天然存在的多肽的片段，或是隨機氨基酸序列。在一個實施方案中，該天然存在的多肽是人多肽。
[0150]包含X1氨基酸序列的融合多肽可以在一方面用于免疫動物來產生抗體，在另一方面用于篩選通過隨機化或在免疫后獲得的抗體文庫。還可以用任意篩選和展示方法來鑒定特異性結合劑，如核糖體展示、噬菌體展示、細胞表面展示、病毒展示及本文中報道的基于融合多肽的展示。
[0151]嗜熱棲熱菌SlyD以及Thermococcus gammadurans SlyD是甚至在用外源氨基酸插入Xl來取代其Flap結構域時也具有可逆折疊的能力的高度穩定的蛋白質。這些分子可以基本上按照 Mattheakis，L.C.等 Proc.Natl.Acad.Sci USA91 (1994) 9022-9026 的方法用于核糖體展示來在嗜熱棲熱菌SlyD或Thermococcus gammadurans SlyD的框架中展示多肽序列XI。所謂的三元復合物由附著于編碼(3)核糖體呈遞的融合多肽的遺傳信息的(2)mRNA的(I)核糖體亞基組成。
[0152]三元復合物可以用于針對特異性識別Xl氨基酸序列的抗體或抗體片段的淘選方法。
[0153]本文中報道的融合多肽可以用于篩選/選擇通過用本文中報道的融合多肽免疫動物獲得的抗體，其中該用于免疫動物的融合多肽和該用于篩選所獲得的抗體的融合多肽具有相同的X1氨基酸序列，而其余氨基酸序列不同。這允許去選擇特異性結合支架而不結合免疫原性肽X1的抗體。
[0154]在一個實施方案中，該用于免疫的融合多肽和該用于篩選的融合多肽具有小于20%的序列同一性。在一個實施方案中，該序列同一性小于10%。
[0155]本文中作為一個方面報道融合多肽，在其N端包含嗜熱棲熱菌SlyD多肽的N端片段(SEQ ID NO: 10)，即嗜熱棲熱菌SlyD多肽的殘基2至64(以M作為SEQ ID NO:09的殘基I開始編號)。然后，插入包含在X1中的免疫原性序列。該融合多肽的C端由嗜熱棲熱菌SlyD多肽的氨基酸殘基123至149 (SEQ ID NO:11)及具有氨基酸序列GSRKHHHHHHHH (SEQID NO: 16)的可選純化標記形成。
[0156]本文中作為一個方面報道融合多妝，在其N端包含Thermococcus gammatoIeransSlyD 多妝的 N 端片段(SEQ ID NO: 106)，即 Thermococcus gammatolerans SlyD 多妝的殘基2至85 (以M作為SEQ ID NO:107的殘基I開始編號)。然后，插入包含在X1中的免疫原性序列。該融合多肽的C端由Thermococcus gammato lerans SlyD多肽的氨基酸殘基137 至 156 (SEQ ID NO:108)及具有氨基酸序列 GSRKHHHHHHHH (SEQ ID NO:16)的純化標記形成。
[0157]本文中作為一個方面報道融合多肽，在其N端包含大腸桿菌SlyD多肽的N端片段，即大腸桿菌SlyD多肽的殘基I至165 (以M作為殘基I開始編號)。然后，插入接頭，該接頭將大腸桿菌SlyD片段的C端與人FKBP12多肽的N端的片段，即人FKBP12多肽的殘基2至84(以M作為殘基I開始編號)連接。可以然后，插入5至500個氨基酸殘基的氨基酸序列。該多肽的C端由人FKBP12多肽的氨基酸殘基97至108及具有氨基酸序列GSRKHHHHHHHH (SEQ ID NO: 16)的可選純化標記形成。
[0158]本文中報道的一個方面是本文中報道的融合多肽的變體，其就親本多肽而言具有至少70 %氨基酸序列同一性，且與親本多肽相比具有提高的熔點。在一個實施方案中，該熔點是至少55°C。在一個實 施方案中，該熔點是至少60°C。在一個實施方案中，該熔點是至少 65。。。
[0159]術語“衍生自多肽”指存在各多肽的全長氨基酸序列的片段，該片段由此與該全長多肽中的各序列具有至少70%氨基酸序列同一性。
[0160]X1和Xci氨基酸序列分別可以自由地選擇，只要它的長度至少為5個氨基酸殘基。例如，插入序列可以衍生自以下，即可以包含以下的片段:白細胞標記，⑶2，⑶3，⑶4，⑶5，CD6, CD7, CD8, CDlla、b、c，CD13、CD14，CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27 及其配體，CD28 及其配體B7.1、B7.2、B7.3，CD29及其配體，CD30及其配體，CD40及其配體gp39，CD44，CD45及同種型，CDw52 (Campath 抗原)，CD56，CD58，CD69，CD72，CTLA-4，LFA-1 和 TCR ;組織相容性抗原，MHC I 或 II 類、Lewis Y 抗原、SLex、SLey、SLea 和 SLeb ;整聯蛋白￥1^-1、￥1^-2、￥1^_3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、α Vβ 3、和 LFA-1、Mac-Ι、和 pl50，95、α Vβ 1、gpllbllla、aR33、α6β4、ανβ5、ανβ6和a V627 ;選擇蛋白，L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白，及其反受體 VCAM-1、ICAM-U ICAM-2 和 LFA-3 ;白細胞介素，IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14 和 IL-15 ;白細胞介素受體，選自IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-15R ;趨化因子，選自 PF4、RANTES、MIPl a、MCPl、NAP_2、Gro a、Gro3和 IL-8 ;生長因子，選自 TNFa、TGFP、TSH、VEGF / VPF,VEGFA,VEGFB,VEGF111,VEGF121,VEGF165,VEGF189,VEGF206,PTHrP,EGF 家族、FGF、PDGF 家族、內皮素、Fibrosin (FSF-1)、人層粘連蛋白和胃泌素釋放肽(GRP)、PLGF, HGH、HGHR ;生長因子受體，選自TNF a R、RGF β R,TSHR、VEGFR / VPFR、FGFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR 家族、EPO-R、GCSF-R 和其他造血受體；干擾素受體，選自IFNCaR、IFNPR和IFNXR;Ig及其配體，選自IgE、FcyRI和FcyRII ;腫瘤抗原，選自her2-neu、黏蛋白、CEA和內皮唾液酸蛋白；變應原，選自屋塵螨抗原、1l pi (草)抗原和漆兒茶酚；病毒多肽，選自CMV糖蛋白B、H和gCIII，HIV-1包膜糖蛋白，RSV包膜糖蛋白，HSV包膜糖蛋白，HPV包膜糖蛋白，肝炎病毒家族表面抗原；毒素，選自假單胞菌內毒素和骨橋蛋白/尿橋蛋白、蛇毒、蜘蛛毒和蜂毒食魚螺毒素；血液因子，選自補體C3b、補體C4a、補體C4b-9、Rh因子、纖維蛋白原、纖維蛋白和髓鞘相關生長抑制劑；及酶，選自膽固醇酯轉移多肽、膜結合基質金屬蛋白酶和谷氨酸脫羧酶(GAD)。
[0161]術語“肽接頭序列”指天然和/或合成來源的肽接頭。它們由線性氨基酸鏈組成，其中20種天然存在的氨基酸是單體構件。該鏈具有10至50個氨基酸，尤其是10至30個氨基酸的長度。該接頭可以包含重復氨基酸序列或天然存在的多肽(如具有鉸合功能的多肽)的序列。在一個實施方案中，該肽接頭氨基酸序列是設計為富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或絲氨酸殘基的“合成接頭氨基酸序列”。這些殘基例如以至多5個氨基酸的小重復單位排列，如GGGGS, QQQQG或SSSSG(SEQ ID NO:17、18或19)。這些小的重復單位可以重復兩次至六次來形成多聚單位。在多聚單位的氨基端和/或羧基端，可以加入至多六個附加的任意天然存在的氨基酸。其他合成肽接頭由重復10至20次的單種氨基酸組成，且可以在氨基端和/或羧基端包含至多六個附加的任意天然存在的氨基酸，例如接頭GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:20)中的絲氨酸。下表中顯示具體的接頭氨基酸序列。在一個實施方案中，該接頭氨基酸序列選自[GQ4J3GNN (SEQ ID NO: 21)、G3 [SGj2SG (SEQ ID NO:22)、G3[SGJ2SG2(SEQ ID NO:23)、(G3S)5GGG(SEQ ID NO:24)。所有肽接頭都可以由核酸分子編碼，因此可以重組表達。
[0162]表
【權利要求】
1.融合多肽，其包含式I的多肽 NH2-S2-X1-S1-COOH (式 I) 其中 X1包含隨機的氨基酸序列，或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列； S2和S1是衍生自第二多肽的非重疊氨基酸序列； -表示肽鍵； 其中所述第二多肽是具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性(PPI酶活性)的多肽，或是衍生自FKBP折疊結構域家族的多肽；和 其中插入X1來取代所述第二多肽的插入flap結構域(IF結構域)。
2.權利要求1的融合多肽，其特征在于所述融合多肽包含式II的多肽 NH2-S4-X2-S3-S2-X1-S1-S0-COOH(式 II) 其中 X1包含隨機的氨基酸序列，或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列； S2和S1或者是衍生自第二多肽的非重疊氨基酸序列； S3和Stl缺乏，或是衍生自第三多肽的非重疊氨基酸序列； S4缺乏，或是衍生自第四 多肽的氨基酸序列；和 X2缺乏，或是肽接頭序列； 其中所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽相互不同，且是具有肽基脯氨酰順/反異構酶活性(PPI酶活性)的多肽，和/或是衍生自FKBP折疊結構域家族的多肽；和其中插入X1來取代所述第二多肽的插入flap結構域(IF結構域)。
3.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于所述S2-X1-S1多肽是天然存在的多肽的片段，或如果X1是IF結構域，則所述S2-X1-S1多肽是天然存在的全長多肽。
4.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于所述第二多肽是SlyD。
5.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于所述第二多肽是來自嗜熱生物的多肽。
6.權利要求5的融合多肽，其特征在于所述嗜熱生物是嗜熱菌或嗜熱古細菌。
7.權利要求5至6中任一項的融合多肽，其特征在于所述嗜熱生物來自棲熱菌科。
8.權利要求5至7中任一項的融合多肽，其特征在于所述嗜熱生物是嗜熱棲熱菌。
9.權利要求5至6中任一項的融合多肽，其特征在于所述嗜熱古細菌是超嗜熱古細菌。
10.權利要求5至6和9中任一項的融合多肽，其特征在于所述嗜熱生物來自熱球菌綱。
11.權利要求5至6和9至10中任一項的融合多肽，其特征在于所述嗜熱生物是Thermococcus gammatoIerans0
12.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于X1包含對應于隱藏表位的氨基酸序列。
13.權利要求2至12中任一項的融合多肽，其特征在于所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽來自不同物種。
14.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于所述第二和/或第三多肽是來自具有至少60°C的最適生長溫度的嗜熱生物的多肽。
15.權利要求14的融合多肽,其特征在于所述嗜熱生物是嗜熱棲熱菌或Thermococcusgammatoleranso
16.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于X1是式III的多肽 XaXbXcXd-X0-XeXfXgXh(式 III) 其中Xtl是隨機氨基酸序列，或是衍生自第一多肽的氨基酸序列；和 其中Xa至Xh中的每一個表示氨基酸殘基，且xa_h中的每一個可以獨立地存在或缺乏。
17.前述權利要求中任一項的融合多肽，其特征在于X1是選自以下的多肽 GS-X0-GSS(式 VI)， AGS-X0-GSS(式 V)， CG-X0-GC(式 VI)， C-X0-GC(式 VII)， G-X0-G(式 VIII)， S-X0-GSS(式 IX)， GG-X0-GG(式 X)， G-X0-TGG(式 XI)， GGGS-X0-GGGS(式 XII)， GGNP-X0-GPT(式 XIII)， 其中Xtl是隨機氨基酸序列，或是衍生自第一多肽的氨基酸序列。
18.權利要求1至17中任一項的融合多肽的用途，用于在實驗動物中引發針對X1的免疫反應。
19.用于在實驗動物中引發針對多肽的免疫反應的方法，其包括對所述實驗動物施用權利要求1至17中任一項的融合多肽至少一次，X1由此是所述多肽的氨基酸序列。
20.用于產生特異性結合靶抗原的抗體的方法，其包括以下步驟: a)對實驗動物施用權利要求1至17中任一項的融合多肽至少一次，X1的氨基酸序列由此包含所述靶抗原的氨基酸序列； b)最后一次施用所述多肽后三至十天從所述實驗動物回收B細胞，所述B細胞產生特異性結合所述靶抗原的抗體； c)培養包含編碼特異性結合所述靶抗原的抗體的核酸的細胞，并從所述細胞或培養基回收所述抗體，從而產生特異性結合靶抗原的抗體。
21.用于產生特異性結合靶抗原的抗體的方法，其包括以下步驟: a)施用權利要求1至17中任一項的融合多肽后從實驗動物回收B細胞，所述B細胞產生特異性結合X1的氨基酸序列的抗體；和 b)培養包含編碼特異性結合X1的氨基酸序列的抗體的核酸的細胞，并從所述細胞或培養基回收所述抗體，從而產生特異性結合靶抗原的抗體。
22.權利要求1至17中任一項的融合多肽的用途，用于表位定位，X1的氨基酸序列由此包含所述表位。
23.用于選擇特異性結合靶抗原的抗體的方法，其包括以下步驟: a)測定多個抗體與固定的靶抗原的結合親和力，權利要求1至17中任一項的融合多肽的X1的氨基酸序列由此包含所述靶抗原的氨基酸序列；b)選擇具有高于預定閾值水平的表觀復合物穩定性的抗體。
24.用于選擇特異性結合靶抗原的抗體的方法，其中用包含嗜熱棲熱菌SlyD插入的融合多肽進行動物的免疫來產生抗體，用包含Thermococcus gammato lerans SlyD插入的融合多肽來選擇所述抗體。
25.用于選擇特異性結合靶抗原的抗體的方法，其中用包含嗜熱棲熱菌SlyD插入的融合多肽進行特異性結合抗原的抗體的選擇，用包含Thermococcus gammato lerans SlyD插入的融合多肽來產生抗體(免疫)。
26.抗體，其通過權利要求19至21和23至25中任一項的方法獲得。
【文檔編號】C12N9/90GK103620031SQ201280031921
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年5月4日 優先權日:2011年5月5日
【發明者】H·安德烈斯, D·卡薩戈爾達瓦爾里貝拉, H·迪費爾, M·耶格, C·舒爾茨, M·施拉伊姆爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司