利用編碼具有硫解酶、hmg-coa合酶和hmg-coa還原酶酶活性的多肽的基因產生甲羥戊酸 ...的制作方法
【專利摘要】本發明描述了通過異源表達來自生物體格氏李斯特菌DSM20601、屎腸球菌、鶉雞腸球菌EG2和鉛黃腸球菌的mvaE和mvaS基因增加微生物中甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的產量的組合物和方法。
【專利說明】利用編碼具有硫解酶、HMG-COA合酶和HMG-COA還原酶酶活性的多肽的基因產生甲羥戊酸、異戊二烯和類異戊二烯
[0001]相關專利申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2011年4月29日提交的美國臨時專利申請N0.61/481，098的優先權，特此將該專利的公開內容以引用的方式全文并入本文。
【技術領域】
[0003]本公開涉及用于在微生物中增加甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯和類異戊二烯前體分子的產量的組合物和方法以及制備甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯和類異戊二烯前體分子的方法。
[0004]發明背景
[0005]R-甲羥戊酸是甲羥戊酸依賴性生物合成途徑的中間體，該途徑將乙酰輔酶A轉化成異戊烯二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。乙酰輔酶A向甲羥戊酸的轉化可由上游甲羥戊酸依賴性生物合成途徑(MVA途徑)的硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶活性催化。根據葡萄糖經由糖酵解向乙酰輔酶A的摩爾轉化率，利用MVA上游途徑酶硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶產生甲羥戊酸的理論質量產率為54.8%。
[0006]商業上，甲羥戊酸已被用作化妝品中的添加劑、用于生產可生物降解的聚合物，并且可具有用于合成 其他化學品的手性構造塊。
[0007]甲羥戊酸依賴性途徑的產物是異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是異戊二烯以及類異戊二烯的前體。異戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是天然橡膠的單體并且還是各式各樣的其他天然存在的化合物(統稱為類異戊二烯)的共同結構基序(structural motif)異戍二烯此外還是多種合成聚合物(最值得注意的是合成橡膠)的關鍵原料。
[0008]類異戊二烯是衍生自類異戊二烯前體分子IPP和DMAPP的化合物。已鑒定了超過29，000種類異戊二烯化合物并且每年都發現新的類異戊二烯。類異戊二烯可分離自天然產物，例如將類異戊二烯前體分子用作基礎構造塊以形成類異戊二烯的相對復雜結構的微生物和植物物種。類異戊二烯對大多數活生物體和細胞是至關重要的，為維持細胞膜流動性和電子傳遞提供了手段。在自然界，類異戊二烯發揮的作用多種多樣，從作為植物中的天然殺蟲劑到促成與肉桂、丁香和生姜相關的香味。此外，制藥和化學界將類異戊二烯用作藥品、保健營養品、調味劑和農業害蟲防治劑。鑒于它們在生物系統中的重要性以及在廣泛應用中的有用性，類異戊二烯已成為倍受科學家重視的焦點。
[0009]獲得甲羥戊酸和類異戊二烯的常規手段包括從生物材料(如植物、微生物和動物)提取以及在實驗室中部分有機合成或全有機合成。然而，這類手段通常已證明差強人意。尤其對于類異戊二烯，鑒于通常其分子結構的復雜性，考慮到通常需要若干步驟來獲得所需產物，因而有機合成是不切實際的。另外，這些化學合成步驟可涉及使用毒性溶劑，同樣從生物材料提取類異戊二烯也可涉及使用毒性溶劑。此外，這些提取和純化方法通常導致所需類異戊二烯產率相對較低，因為生物材料通常僅含有微量的這些分子。不幸的是，獲得相對大量的類異戊二烯所涉及的困難已限制了它們的實際應用。
[0010]已公開了以一定速率、滴度和純度產生異戊二烯和類異戊二烯的方法(參見例如國際專利申請公開N0.W02009/076676A2和美國專利N0.7,915, 026)。然而，仍需要增加異戊二烯和類異戊二烯的產量以及增加異戊二烯和類異戊二烯的產率的改進。
[0011]本發明通過公開組合物和方法以增加作為甲羥戊酸依賴性生物合成途徑的中間體的甲羥戊酸的產量以及增加衍生自甲羥戊酸的分子如異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產量而提供了這類改進。
[0012]在整篇本說明書中，參考了多個專利、專利申請以及其他類型的出版物(如雜志文章)。特此將本文引用的所有專利、專利申請和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
【發明內容】
[0013]本文提供的發明尤其公開了增加重組細胞的異戊二烯產量的組合物和方法。本發明還提供通過表達(如異源表達)來自生物體格氏李斯特菌(Listeria grayi)DSM20601、屎腸球菌(^Enterococcus faecium)、鵓雞腸球菌(^Enterococcus gal I inarum) EG2 和鉛黃腸球菌(Enterococcus casselif Iavus)的mvaE和mvaS基因增加微生物中甲輕戍酸、類異戍二烯前體分子和/或類異戊二烯的產量的組合物和方法。
[0014]因此，本發 明提供的是能夠增加異戊二烯的產量的重組細胞，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因，其中所述mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含:一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的核酸；和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞相比，該細胞產生增加量的異戊二烯。在一些方面，編碼MVA下游途徑的多肽的核酸包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。在任何本文所公開方面的一些方面中，將甲羥戍酸磷酸化為甲輕戍酸5-磷酸的酶選自馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)甲輕戍酸激酶、布氏擬甲燒球菌(Methanococcoides burtonii)甲輕戍酸激酶多肽、乳桿菌(Lactobacillus)甲輕戍酸激酶多肽、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)甲輕戍酸激酶多肽、酵母甲輕戍酸激酶多肽、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲輕戍酸激酶多肽、鏈球菌(Streptococcus)甲輕戍酸激酶多妝、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)甲輕戍酸激酶多肽、鏈霉菌(Streptomyces)甲輕戍酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲輕戍酸激酶多肽。在一些方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。在任何本文所公開方面的一些方面中，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬(Pueraria)或楊屬(Populus)或雜種銀白楊(Populus alba)x歐洲山楊(Populus tremula)的多肽或其變體。在一些方面，該異戍二烯合酶多肽選自山葛(Pueraria montana)、野葛(Pueraria1bata)、美洲山楊(Populus tremuloides)、銀白楊、黑楊(Populus nigra)、毛果楊(Populus trichocarpa)。在一些方面,植物異戍二烯合酶多肽為銀白楊異戍二烯合酶多肽。在任何本文所公開方面的一些方面中，該細胞還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S -異構酶(IDI)多肽的核酸。在一些方面，其中編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，IDI多肽為酵母IDI多肽。在一些方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的內源核酸拷貝。在任何本文所公開方面的一些方面中，將該一種或多種核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。在任何本文所公開方面的一些方面中，將該一種或多種核酸克隆進多拷貝質粒中。在任何本文所公開方面的一些方面中，將該一種或多種核酸整合進細胞的染色體中。在任何本文所公開方面的一些方面中，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞、埃希桿菌(Escherichia)細胞、泛菌(Pantoea)細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、木霉(Trichoderma)細胞、曲霉(Aspergillus)細胞或酵母細胞。在一些方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在一些方面，該細胞為大腸桿菌。
[0015]在另一方面，本發明提供的是產生異戊二烯的方法，包括:在適于產生異戊二烯的培養條件下培養任何本文所提供方面中所公開的宿主細胞；以及產生異戊二烯。在一個方面，該方法還包括回收異戊二烯。
[0016]在另外的方面，本發明提供的是能夠增加類異戊二烯前體的產量的重組細胞，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合 酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產類異戊二烯前體細胞相比該細胞產生增加量的類異戊二烯前體。在一些方面，將一種或多種核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。在任何本文所公開方面的一些方面中，將一種或多種核酸克隆進多拷貝質粒中。在任何本文所公開方面的一些方面中，將一種或多種核酸整合進細胞的染色體中。在任何本文所公開方面的一些方面中，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、埃希桿菌細胞、泛菌細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、木霉細胞、曲霉細胞或酵母細胞。在一些方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在一些方面，該細胞為大腸桿菌。在任何本文所公開方面的一些方面中，類異戊二烯前體是甲羥戊酸(MVA)。
[0017]在另一方面，本發明提供的是產生類異戊二烯前體的方法，包括:在適于產生類異戊二烯前體的培養條件下培養任何本文所公開方面中所描述的宿主細胞；以及產生類異戊二烯前體。在一個方面，該方法還包括回收類異戊二烯前體。
[0018]在另外的方面，本發明提供的是能夠增加類異戊二烯的產量的重組細胞，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因，其中所述mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含:一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的核酸；和一種或多種編碼聚丙烯焦磷酸合酶的核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產類異戊二烯細胞相比，該細胞產生增加量的類異戊二烯。在一些方面，編碼MVA下游途徑的多肽的核酸包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。在任何本文所公開方面的一些方面中，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、布氏擬甲烷球菌甲羥戊酸激酶多肽、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。在一些方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。在任何本文所公開方面的一些方面中，將一種或多種核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。在任何本文所公開方面的一些方面中，將一種或多種核酸克隆進多拷貝質粒中。在任何本文所公開方面的一些方面中，將一種或多種核酸整合進細胞的染色體中。在任何本文所公開方面的一些方面中，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、埃希桿菌細胞、泛菌細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、木霉細胞、曲霉細胞或酵母細胞。在一些方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在一些方面，該細胞為大腸桿菌。在任何本文所公開方面的一些方面中，類異戊二烯選自單萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在一些方面，類異戊二烯為倍半萜。在任何本文所公開方面的一些方面中，類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、a-金合歡烯、3 -金合歡烯、金合歡醇、香葉醇、香葉基香葉醇、芳樟醇、檸檬烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、廣藿香醇、3 -菔烯、檜烯、Y-萜品烯、異松香烯和瓦倫西亞桔烯。
[0019]在另一方面，提供用 于產生類異戊二烯的方法，包括:在適于產生類異戊二烯前體的培養條件下培養任何本文所公開方面中所描述的宿主細胞；以及產生類異戊二烯。在一個方面，該方法還包括回收類異戊二烯。
[0020]在一個方面，本發明提供能夠增加甲羥戊酸的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中與不包含來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因的細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較高質量產率的甲羥戊酸。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID NO: 3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQID N0:5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:8的核酸。在一個方面，可將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子的控制下或置于組成型啟動子的控制下。在一個方面，將該一種或多種異源核酸進行密碼子優化。在一些方面，將該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，將該一種或多種異源核酸整合進細胞(例如細菌細胞)的染色體中。在一個方面，該細胞是為革蘭氏陽性細胞或革蘭氏陰性細胞的細菌細胞。在另一方面，該細胞是細菌細胞，該細菌細胞選自大腸桿菌、朽1檬泛菌(Pantoea citrea)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophi lus)、嗜喊芽抱桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、耐鹽芽抱桿菌(Bacillus halodurans)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、凝結芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、環狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)、白色鏈霉菌(Streptomyces albus)、變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)和產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)細胞。在另一方面，該細菌細胞為大腸桿菌細胞。
[0021]在另一方面，本發明提供能夠增加甲羥戊酸的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫`解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中與不包含來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因的細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較高峰值滴度(peak titer)的甲羥戊酸。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID NO:5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:8的核酸。在一個方面，可將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子的控制下或置于組成型啟動子的控制下。在一個方面，該一種或多種異源核酸是經密碼子優化的。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞(例如細菌細胞)的染色體中。在一個方面，該細胞是為革蘭氏陽性細胞或革蘭氏陰性細胞的細菌細胞。在另一方面，該細胞是細菌細胞，該細菌細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細菌細胞為大腸桿菌細胞。
[0022]在另一方面，本發明提供能夠增加甲羥戊酸的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中與不包含來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因的細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞具有較高細胞生產力指數(cell productivityindex) (CPI)。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO: 4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:8的核酸。在一個方面，可將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子的控制下或置于組成型啟動子的控制下。在一個方面，該一種或多種異源核 酸經密碼子優化。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞(例如細菌細胞)的染色體中。在一個方面，該細胞是為革蘭氏陽性細胞或革蘭氏陰性細胞的細菌細胞。在另一方面，該細胞是細菌細胞，該細菌細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細菌細胞為大腸桿菌細胞。
[0023]在另一方面，本發明提供能夠增加甲羥戊酸的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中與不包含來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因的細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較高質量產率的甲羥戊酸。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO: 2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID NO: 5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:8的核酸。在一個方面，可將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子的控制下或置于組成型啟動子的控制下。在一個方面，該一種或多種異源核酸經密碼子優化。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞(例如細菌細胞)的染色體中。在一個方面，該細胞是為革蘭氏陽性細胞或革蘭氏陰性細胞的細菌細胞。在另一方面，該細胞是細菌細胞，該細菌細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細菌細胞為大腸桿菌細胞。
[0024]在另一方面，本發明提供增加甲羥戊酸的產量的方法，該方法包括:(a)培養包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸的細胞:(i)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(ii)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(iv)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽；以及(b)產生甲羥戊酸。在一些方面，該方法還包括回收甲羥戊酸的步驟。在一些方面，在34°C下培養該細胞。在一些方面，在低至中等拷貝質粒上表達一種或多種異源核酸。在一些方面，該一種或多種異源核酸處于強啟動子的控制下。
[0025]在另一方面，本發明提供能夠增加異戊二烯的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含(i) 一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸；和(ii)編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較大量的異戊二烯。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:1的核酸。在`另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO: 6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO:8的核酸。在一個方面，該一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸經密碼子優化:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(c)來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因。在一個方面，該MVA下游途徑的多肽包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。在另一方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。在一個方面，該異戍二烯合酶多肽為來自葛屬(Pueraria)或楊屬(Populus)或雜種銀白楊(Populusalba)x歐洲山楊(Populus tremula)的多肽。在另一方面，該異戍二烯合酶多肽選自山葛(Pueraria montana)或野葛(Pueraria 1bata)、美洲山楊(Populus tremuloides)、銀白楊、黑楊(Populus nigra)和毛果楊(Populus trichocarpa)。在另一方面,植物異戍二烯合酶多肽為葛(kudzu)異戊二烯合酶多肽。在一個方面該細胞(例如細菌細胞)還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S-異構酶(IDI)多肽的核酸。在另一方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的異源核酸。在另一方面，IDI多肽為酵母IDI多肽。在一個方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的內源核酸拷貝。在另一方面，將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子的控制下。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞的染色體中。在又一個方面，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。在其他方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細胞為大腸桿菌。
[0026]在另一方面，本發明提供能夠增加異戊二烯的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含(i) 一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸；(ii)編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸；和(iii) 一種或多種編碼DXP途徑的多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較大量的異戊二烯。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQID NO: 5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID NO:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:8的核酸。在一個方面，該一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸經密碼子優化:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因。在一個方面該MVA下游途徑的多肽包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。在另一方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。在一個方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽。在另一方面，該異戊二烯合酶多肽選自山葛或野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊和毛果楊。在另一方面，植物異戊二烯合酶多肽為葛異戊二烯合酶多肽。在一個方面該細胞(例如細菌細胞)還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S-異構酶(IDI)多肽的核酸。在另一方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的異源核酸。在另一方面，IDI多肽為酵母IDI多肽。在一個方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的內源核酸拷貝。在一個方面該DXP途徑的多肽包含選自如下的酶:(a)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化為1-脫氧-d- 木酮糖-5-磷酸(DXP)的酶；(b)將1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)的酶；(c)將2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)轉化為4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)的酶；⑷將4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(OTP-ME)轉化為2- 二磷酸-4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(OTP-MEP)的酶；(e)將2-磷酸-4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(CDP-MEP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸(ME-CPP或cMEPP)的酶。(f)將2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸轉化為(E)-4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)的酶。和(g)將(E) -4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸轉化為異戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的酶。在另一方面，將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子的控制下。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞的染色體中。在又一個方面，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。在其他方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細胞為大腸桿菌。
[0027]在另一方面，本發明提供增加異戊二烯的產量的方法，該方法包括:(a)培養包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸的細胞(例如細菌細胞):(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含(i) 一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸；和(ii)編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較大量的異戍二烯。在一些方面，該細胞還包含一種或多種編碼DXP途徑的多肽的異源核酸。在一些方面，該方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面，在34°C下培養該細胞。在一些方面，在染色體外質粒上表達該一種或多種異源核酸。在一些方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞的染色體(例如細菌細胞染色體)中。
[0028]在另一方面，本發明提供能夠增加類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(c)來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含(i) 一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸；和(ii)編碼聚丙烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生至少較大量的類異戊二烯和/或類異戊二烯前體。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID NO:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQID N0:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:8的核酸。在一個方面，該一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸經密碼子優化:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因。在另一方面，將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子的控制下。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞的染色體中。在又一個方面，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。在其他方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細胞為大腸桿菌。在一個方面，該MVA下游途徑的多肽包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。在另一方面，該聚丙烯焦磷酸合酶多肽包含法尼基焦磷酸(FPP)合酶。在另一方面，類異戊二烯選自單萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在其他方面，類異戊二烯為倍半萜。在一些方面，類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯(amorphadiene)、蒈烯、α-金合歡烯、β -金合歡烯、金合歡醇、香葉醇、香葉基香葉醇、芳樟醇、檸檬烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、廣藿香醇、(6-菔烯、檜烯、Y-萜品烯、異松香烯(terpindene)和瓦倫西亞桔烯(valencene)。
[0029]在另一方面，本發明提供能夠增加類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產量的重組細胞(例如細菌細胞)，該細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(c)來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含(i) 一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸；(ii)編碼聚丙烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸；和(iii) 一種或多種編碼DXP途徑的多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較大量的異戊二烯。在一個方面，來自格氏李斯特菌的mvaE基因包含對應SEQ ID NO:1的核酸。在另一方面，來自格氏李斯特菌的mvaS基因包含對應SEQID N0:2的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:3的核酸。在另一方面，來自屎腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID N0:4的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:5的核酸。在另一方面，來自鶉雞腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO:6的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaE基因包含對應SEQ ID N0:7的核酸。在另一方面，來自鉛黃腸球菌的mvaS基因包含對應SEQ ID NO:8的核酸。在一個方面，該一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸經密碼子優化:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(c)來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因。在一個方面該MVA下游途徑的多肽包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸
5-磷酸的酶選自馬氏甲烷八`疊球菌甲羥戊酸激酶、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。在另一方面，該聚丙烯焦磷酸合酶多肽包含法尼基焦磷酸(FPP)合酶。在一個方面該細胞(例如細菌細胞)還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S-異構酶(IDI)多肽的核酸。在另一方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的異源核酸。在另一方面，IDI多肽為酵母IDI多肽。在一個方面，編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的內源核酸拷貝。在一個方面該DXP途徑的多肽包含選自如下的酶:(a)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化為1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)的酶；(b)將1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)的酶；(c)將2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)轉化為4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)的酶；⑷將4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(OTP-ME)轉化為2- 二磷酸-4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(OTP-MEP)的酶；(e)將2-磷酸-4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(CDP-MEP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸(ME-CPP或cMEPP)的酶。(f)將2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸轉化為(E) -4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)的酶。和(g)將(E) -4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸轉化為異戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的酶。在另一方面，將一種或多種異源核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子的控制下。在一些方面，該一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在另一方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞的染色體中。在又一個方面，該細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。在其他方面，該細胞選自大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、假單胞菌屬物種和產堿假單胞菌細胞。在另一方面，該細胞為大腸桿菌。
[0030]在另一方面，本發明提供增加類異戊二烯和/或類異戊二烯前體分子的產量的方法，該方法包括:(a)培養包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸的細胞:(a)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；(c)來自鶉雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中該mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中該細胞還包含(i) 一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸；和(ii)編碼聚丙烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸，其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產類異戊二烯和/或類異戊二烯前體分子的細胞(例如細菌細胞)相比，該細胞產生較大量的類異戊二烯和/或類異戊二烯前體分子。在一些方面，該細胞還包含一種或多種編碼DXP途徑的多肽的異源核酸。在一些方面，該方法還包括回收類異戊二烯和/或類異戊二烯前體分子的步驟。在一些方面，在34°C下培養該細胞。在一些方面，在染色體外質粒上表達該一種或多種異源核酸。在一些方面，該一種或多種異源核酸整合進細胞染色體(例如細菌細胞染色體)中。
[0031]在另一方面，本發明提供能夠增加甲羥戊酸的產量的重組宿主(如細菌)細胞，其中該細胞包含來自如下生物體中的一者的降解抗性mvaE基因產物:鶉雞腸球菌、屎腸球菌、鉛黃腸球菌或格氏李斯特菌。
[0032]在另一方面，本發明提供能夠增加異戊二烯的產量的重組宿主(如細菌)細胞，其中該細胞包含來自如下生物體中的一者`的降解抗性mvaE基因產物:產生異戊二烯的鶉雞腸球菌、屎腸球菌、鉛黃腸球菌或格氏李斯特菌。
[0033]在另一方面，本發明提供能夠增加類異戊二烯的產量的重組宿主(如細菌)細胞，其中該細胞包含來自如下生物體中的一者的降解抗性mvaE基因產物:產生類異戊二烯的鶉雞腸球菌、屎腸球菌、鉛黃腸球菌或格氏李斯特菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1繪出了自葡萄糖產生甲羥戊酸的質量產率。誤差條代表兩次重復的標準偏差。
[0035]圖2繪出了 pDW34的質粒圖譜。
[0036]圖3繪出了在40小時時糞腸球菌(^Enterococcus faecalis)、鵓雞腸球菌和鉛黃腸球菌中的MVP濃度。[0037]圖4繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的自葡萄糖產生異戊二烯的產率。使用鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌進行的所有運行(分別是三角形和正方形)均比使用糞腸球菌上游途徑酶的兩個運行(空心菱形和實心菱形)實現更高的自葡萄糖產生異戊二烯的％產率。從葡萄糖產生的％重量產率計算為異戊二烯總量(t)/[(料Wt(O)-料Wt(t)+83.5)*0.59)]，其中0.59為葡萄糖料液中葡萄糖的重量百分比，83.5為在t=0時分批供料進發酵罐中的該進料的克數。獨立地對每次進料測量其重量％。
[0038]圖5繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的體積生產率(volumetricproductivity)。使用鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌進行的所有運行(分別是三角形和正方形)均比使用糞腸球菌上游途徑酶的兩個運行(空心菱形和實心菱形)實現更高的總體積生產率。使用下式計算體積生產率:體積生產率(g/L/hr) = [2 (HGER(t)/1000*68.117)]/[t-tj ,其中求和是從h到t。未納入罐的周轉時間。
[0039]圖6繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的比生產率(specificproductivity)。使用鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌進行的所有運行(分別是三角形和正方形)均比使用糞腸球菌上游途徑酶的兩個運行(空心菱形和實心菱形)實現更高的峰值比生產率。使用下式計算比生產率:比生產率(mg/L/hr/OD) =HgER*68.117g/mol/0D。HgER為異戊二烯放出速率，單位為(mmol/L/hr)。OD=光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀釋因子。
[0040]圖7繪出了以小規模進行的工程化大腸桿菌菌株的生長和異戊二烯生產率，該菌株表達大腸桿菌染色體上的布氏擬甲烷球菌甲羥戊酸激酶或馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
[0041]圖8繪出了大腸桿菌15L發酵物中馬氏甲烷八疊球菌和布氏擬甲烷球菌甲羥戊酸激酶的表達。
[0042]圖9繪出了蛋白質印跡，其中顯現了來自菌株DW326的MvaE。泳道I _基準標記；泳道2-0.4ug的純化MvaE ;泳道3_7，來自用0,25,50,100,200 u M IPTG誘導的菌株DW326的溶胞產物樣品。
[0043]圖10繪出了用Safestain染色的SDS-PAGE凝膠，其含有:泳道1_基準標記；泳道
2-15-從鎳柱洗脫的MvaE蛋白級分的His標簽介導的純化。
【具體實施方式】
[0044]微生物細胞例如細菌細胞是廣泛使用的用于產生重組蛋白的宿主。它們還可用于產生其他產物，例如甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體分子和類異戊二烯。本發明尤其提供利用異源表達由來自微生物格氏李斯特菌DSM20601、屎腸球菌、鶉雞腸球菌EG2和/或鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因編碼的多肽的細胞(例如細菌細胞)，產生增加產率和滴度的甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體分子和類異戊二烯的組合物和方法。
[0045]甲羥戊酸依賴性生物合成途徑對于類異戊二烯前體分子甲羥戊酸(MVA)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)和異戊烯焦磷酸(IPP)的產生特別重要。甲羥戊酸上游途徑的酶經由三個酶促反應將從葡萄糖產生的乙酰輔酶A轉化成甲羥戊酸。來自上述細菌物種的mvaE基因和mvaS基因一起編碼具有甲羥戊酸上游途徑的酶活性的多肽。不受理論的束縛，據信增加上游甲羥戊酸依賴性生物合成途徑中的這三種酶活性的效率和生產率將大幅度增加甲羥戊酸的細胞內濃度，并因此增加下游類異戊二烯前體分子例如DMAPP和IPP的細胞內濃度。這些菌株產生的甲羥戊酸的產率增加因此對于商業應用是有利的。
[0046]此前已將一不同細菌物種即糞腸球菌的mvaE和mvaS基因整合進大腸桿菌菌株中以產生甲羥戊酸(參見美國專利申請公開N0.2005/0287655A1 ；Tabata, K.和Hashimoto, S.-1.Biotechnology Letters(《生物技術快訊》)26:1487 - 1491, 2004)。然而，本發明人已觀察到在表達來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌的mvaE和mvaS基因的細胞(例如細菌細胞)中所產生的甲羥戊酸的質量產率大于含有來自糞腸球菌的mvaE和mvaS基因的大腸桿菌菌株所產生的甲羥戊酸的質量產率。本申請的組合物和方法因而較于此前已在本領域中實踐的組合物和方法體現了在可用于增加甲羥戊酸的產量的微生物菌株的數目以及在由這些細胞(例如細菌細胞)產生的甲羥戊酸的量這兩個方面的改善。
[0047]通用技術
[0048]除非另外指明，否則對本發明的實施將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學領域的常規技術，這些技術均為本領域的現有技術。這些技術在以下文獻中有完整解釋:“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:實驗室手冊》)”，第二版(Sambrook 等人，1989) ,Oligonucleotide Synthesis (《《寡核苷酸合成》》)”(M.J.Gait編輯，1984) ;“Animal Cell Culture (《動物細胞培養》)”(R.1.Freshney編輯，1987) ,Methods in Enzymology (《酶學方法》)”(美國學術出版社(Academic Press, Inc.) ) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology (《現代分子生物學實驗技術》)”(F.M.Ausubel等人編輯，1987,以及定期更新版本)；“PCR: The PolymeraseChain Reaction (《PCR:聚合酶鏈反應》)”，(Mullis 等人編輯，1994)。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology2nd ed.(《微生物學和分子生物學詞典第二版》)，約翰威立父子出版公司(J.Wiley&Sons)(紐約1994)以及March, AdvancedOrganic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure4th ed.(〈〈高級有機化學反應、機理和結構，第四版》)，約翰威立父子出版公司(紐約1992)，為本領域技術人員提供了關于本申請中所用的許多術語的一般 性指導。
[0049]定義
[0050]術語“異戍二稀”是指2-甲基-1，3- 丁二稀(CAS#78-79-5)。其可以是由3，3- _.甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)消除焦磷酸所得的直接和最終的揮發性C5烴產物。其可能不涉及IPP分子與DMAPP分子的連接或聚合。除非本文中另外指明，否則術語“異戊二烯”通常不旨在受其產生方法的限制。
[0051]如本文所用，術語“多肽”包括多肽、蛋白質、肽、多肽片段和融合多肽。
[0052]如本文所用，“分離的多肽”不是多肽文庫(如2種、5種、10種、20種、50種或更多種不同多肽的文庫)的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼該多肽的重組核酸的表達來獲得。
[0053]所謂“異源多肽”意指由衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細胞的核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，異源多肽不同于存在于自然界中相同宿主細胞內的野生型多肽。
[0054]如本文所使用，“核酸”是指單股或雙股形式的共價連接在一起的兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。[0055]所謂“重組核酸”意指這樣的所關注核酸，其缺少在該所關注核酸旁側的、所關注核酸所源自的有機體的天然存在的基因組中的一種或多種核酸(例如基因)。因此，該術語包括(例如)摻入載體中、摻入自主復制型質粒或病毒中或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA中，或者獨立于其他序列作為單獨的分子(例如，cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性核酸內切酶消化產生的cDNA片段)存在的重組DNA。
[0056]所謂“異源核酸”意指衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細胞的核酸序列。在一些實施例中，異源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主細胞內存在的野生型核酸。例如，轉化或整合進大腸桿菌的染色體中的由來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌的mvaE和mvaS基因編碼的核酸是異源核酸。
[0057]如本文所用，“表達控制序列”意指引導所關注核酸轉錄的核酸序列。表達控制序列可以為啟動子(例如組成型或誘導型啟動子)或增強子。表達控制序列可以是“天然的”或異源的。天然的表達控制序列衍生自與所表達基因相同的生物體、物種或株系。異源表達控制序列衍生自與所表達基因不同的生物體、物種或株系。“誘導型啟動子”是在環境或發育調節下具有活 性的啟動子。
[0058]所謂“有效連接的”意指核酸表達控制序列(例如啟動子)與第二核酸序列之間的功能性連接，其中該表達控制序列引導對應于該第二序列的核酸的轉錄。
[0059]如本文所用，術語“基礎培養基”是指含有細胞生長所需的可能的最少營養物、通常不存在氨基酸的培養基。基本培養基通常含有:(I)用于細胞(例如細菌細胞)生長的碳源；(2)各種鹽，其可因細胞物種(例如細菌細胞物種)和生長條件而變動；和(3)水。從簡單的糖如葡萄糖到其他生物質的較復雜水解產物如酵母提取物，碳源可以有很大變化，如下文更詳細論述的。鹽通常提供必需元素如鎂、氮、磷和硫以允許細胞合成蛋白質和核酸。基本培養基還可補充有選擇劑，例如抗生素，以針對某些質粒的維持等進行選擇。例如，如果微生物對某一抗生素例如氨芐青霉素或四環素具有抗性，則可將該抗生素添加至培養基以便防止缺乏該抗性的細胞生長。培養基可在必要時補充有其他化合物以選擇所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0060]如本文所用，術語“類異戊二烯”是指數量大且多樣的一類天然存在的一類有機化合物，其由兩個或更多個烴單元構成，每個單元由以特定模式排列的五個碳原子組成。如本文所用，明確地將“異戊二烯”從“類異戊二烯”的定義中排除。
[0061]如本文所用，術語“萜類化合物”是指數量大且多樣的一類有機分子，該分子衍生自以多種方式組裝和修飾并且根據組成員中所用的類異戊二烯單元的數目分組的五碳類異戊二烯單元。半萜類化合物具有一個類異戊二烯單元。單萜類化合物具有兩個類異戊二烯單元。倍半萜類化合物具有三個類異戊二烯單元。二萜類化合物具有四個異戊二烯單元。二倍半萜類具有五個異戊二烯單元。三萜類化合物具有六個類異戊二烯單元。四萜類化合物具有八個類異戊二烯單元。多萜類化合物具有超過八個類異戊二烯單元。
[0062]如本文所用，“類異戊二烯前體”是指生物體用于萜類化合物或類異戊二烯的生物合成的任何分子。類異戊二烯前體分子的非限制性例子包括例如甲羥戊酸(MVA)、異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
[0063]如本文所用，術語“質量產率”是指細胞(例如細菌細胞)所產生的產物的質量除以細胞(例如細菌細胞)所耗費的葡萄糖的質量乘以100。[0064]所謂“比生產率”，其意指細胞(例如細菌細胞)所產生的產物的質量除以產生產物的時間、細胞密度和培養物體積。
[0065]所謂“滴度”，其意指細胞(例如細菌細胞)所產生的產物的質量除以培養物的體積。
[0066]如本文所用，術語“細胞生產力指數(CPI) ”是指細胞(例如細菌細胞)所產生的產物的質量除以培養物中產生的細胞(例如細菌細胞)的質量。
[0067]除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域普通技術人員所一般理解的含義相同的含義。
[0068]如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數“一個”、“一種”和“該”包括復數指代。
[0069]在本說明書通篇中給出的每一最大數值限度旨在包括每一更低數值限度，就如同此類更低數值限度在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一最小數值限度將包括每一更高數值限度，就如同此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數值范圍將包括落入此類較寬數值范圍內的每一個較窄數值范圍，就如同此類較窄數值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。
[0070]能夠增加類異戊二烯前體(如甲羥戊酸)的產暈的重組細胞(例如細菌細胞)
[0071]甲羥戊酸依賴性生物合成途徑(MVA途徑)是所有高等真核生物和某些細菌中存在的關鍵代謝途徑。除 了對蛋白質異戊二烯化、細胞膜維持、蛋白質錨定和N-糖基化等各種各樣的過程中所用的分子的產生是重要的外，甲羥戊酸途徑還提供類異戊二烯前體分子MVA、DMAPP和IPP的主要來源，這些分子充當萜烯、萜類化合物、類異戊二烯和異戊二烯的生物合成的基礎。
[0072]在MVA途徑的上游部分中，分子代謝期間所產生的乙酰輔酶A經由具有硫解酶、HMG-CoA還原酶和HMG-CoA合酶酶活性的多肽的作用轉化為甲羥戊酸。首先，乙酰輔酶A經由硫解酶的作用轉化為乙酰乙酰輔酶A。接著，乙酰乙酰輔酶A通過HMG-CoA合酶的酶促作用轉化為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)。該輔酶A衍生物通過HMG-CoA還原酶還原成甲羥戊酸，這是產生類異戊二烯的甲羥戊酸途徑的限速步驟。甲羥戊酸然后經由甲羥戊酸激酶的作用轉化為甲羥戊酸-5-磷酸，其隨后通過磷酸甲羥戊酸激酶的酶活性轉化為甲羥戊酸-5-焦磷酸。最后，通過酶甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶的活性由甲羥戊酸-5-焦磷酸形成IPP。
[0073]編碼mvaE和mvaS多狀的某閔
[0074]在格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌中，mvaE基因編碼同時具有硫解酶活性和HMG-CoA還原酶活性的多肽。事實上，mvaE基因產物代表存在于真細菌中的IPP生物合成的第一雙功能酶和融合到另一種天然蛋白質上的HMG-CoA還原酶的第一例子(Hedl 等人，J Bacteriol.(《細菌學雜志》)2002 年 4 月;184(8):2116 - 2122)。另一方面，mvaS基因編碼具有HMG-CoA合酶活性的多肽。
[0075]因此，可對細胞(例如細菌(如大腸桿菌)細胞)進行工程改造以表達一種或多種來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌和/或鉛黃腸球菌)的mvaE和mvaS基因，以增加類異戊二烯前體(如甲羥戊酸)的產量、峰值滴度和細胞生產率。可以在多拷貝質粒上表達該一種或多種mvaE和mvaS基因。質粒可以是聞拷貝質粒、低拷貝質粒或中等拷貝質粒。或者，該一種或多種mvaE和mvaS基因可整合進宿主細胞的染色體中。對于一種或多種mvaE和mvaS基因在質粒上或作為宿主細胞染色體的整合部分的兩種異源表達而言，可以用誘導型啟動子或組成型表達啟動子驅動基因的表達。啟動子可以是該一種或多種mvaE和mvaS基因的表達的強驅動子，可以是表達的弱驅動子，或可以是表達的中等驅動子。
[0076]設想單獨來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌和/或鉛黃腸球菌的mvaE和mvaS基因或所述基因與編碼來自MVA上游途徑的蛋白質的一種或多種其他mvaE和mvaS基因相結合的多個選項在本發明范圍內。因而，可以任何上文所述方式在細胞(例如細菌細胞)中表達表1中所設想的任何基因組合。
[0077]表1:--氛用于本發明的在宿主細胞中表汰mvaE矛口 mvaS基因的誅.頂。
[0078]
【權利要求】
1.一種能夠增加異戊二烯的產量的重組細胞，所述細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸: a.來自鵓雞腸球菌(Enterococcusgal I inarum)的mvaE基因和mvaS基因； b.來自鉛黃腸球菌(EnterococcuscasselifIavus)的mvaE基因和mvaS基因； c.來自尿腸球菌(Enterococcusfaecium)的mvaE基因和mvaS基因；和 d.來自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)的mvaE基因和mvaS基因 其中所述mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中所述細胞還包含: i.一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的核酸；和 i1.編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸， 其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產異戊二烯細胞相比所述細胞產生增加量的異戊二烯。
2.根據權利要求1所述的細胞，其中所述編碼MVA下游途徑的多肽的核酸包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。
3.根據權利要求1或2所述的細胞，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶選自馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)甲輕戍酸激酶、布氏擬甲燒球菌(Methanococcoides burtonii)甲輕戍酸激酶多妝、乳桿菌(Lactobacillus)甲輕戍酸激酶多肽、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)甲輕戍酸激酶多肽、酵母甲輕戍酸激酶多肽、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲輕戍酸激酶多妝、鏈球菌(Streptococcus)甲輕戍酸激酶多肽、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)甲輕戍酸激酶多肽、鏈霉菌(Streptomyces)甲輕戍酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲輕戍酸激酶多肽。
4.根據權利要求3所述的細胞，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽或其變體。
6.根據權利要求5所述的細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽為來自葛屬(Pueraria)或楊屬(Populus)或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。
7.根據權利要求6所述的細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽選自山葛(Puerariamontana)、野葛(Pueraria 1bata)、美洲山楊(Populus tremuloides)、銀白楊(Populusalba)、黑楊(Populus nigra)和毛果楊(Populus trichocarpa)。
8.根據權利要求5所述的細胞，其中所述植物異戊二烯合酶多肽為銀白楊異戊二烯合酶多肽。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的細胞，還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S-異構酶(IDI)多肽的核酸。
10.根據權利要求9所述的細胞，其中所述編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的異源核酸。
11.根據權利要求10所述的細胞，其中所述IDI多肽為酵母IDI多肽。
12.根據權利要求9所述的細胞，其中所述編碼IDI多肽的核酸為編碼IDI多肽的內源核酸拷貝。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸克隆進多拷貝質粒中。
15.根據權利要求1-13中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸整合進所述細胞的染色體中。
16.根據權利要求1-15中任一項所述的細胞，其中所述細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞、埃希桿菌(Escherichia)細胞、泛菌(Pantoea)細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、木霉(Trichoderma)細胞、曲霉(Aspergillus)細胞或酵母細胞。
17.根據權利要求16所述的細胞，其中所述細胞選自大腸桿菌細胞、檸檬泛菌(Pantoea citrea)細胞、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)細胞、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)細胞、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)細胞、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)細胞、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)細胞、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)細胞、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)細胞、耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)細胞、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)細胞、凝結芽抱桿菌(Bacillus coagulans)細胞、環狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)細胞、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)細胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細胞、白色鏈霉菌(Streptomyces albus)細胞、變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)細胞、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coe licolor)細胞、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)細胞、假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)細胞和產喊假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)細胞。
18.根據權利要求17所述的細胞，其中所述細胞為大腸桿菌。
19.一種產生異戊二烯的方法，包括:(a)在適于產生異戊二烯的培養條件下培養根據權利要求1所述的宿主細胞；以及(b)產生異戊二烯。
20.根據權利要求19所述的方法，還包括(c)回收異戊二烯。
21.能夠增加類異戊二烯前體的產量的重組細胞，所述細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸: (a)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因； (b)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因； (c)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和 (d)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因， 其中所述mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產類異戊二烯前體細胞相比所述細胞產生增加量的類異戊二烯前體。
22.根據權利要求21所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。
23.根據權利要求21-22中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸克隆進多拷貝質粒中。
24.根據權利要求21-22中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸整合進所述細胞的染色體中。
25.根據權利要求21-24中任一項所述的細胞，其中所述細胞為革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、埃希桿菌細胞、泛菌細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、木霉細胞、曲霉細胞或酵母細胞。
26.根據權利要求25中任一項所述的細胞，其中所述細胞選自大腸桿菌細胞、檸檬泛菌細胞、枯草芽孢桿菌細胞、地衣芽孢桿菌細胞、遲緩芽孢桿菌細胞、短芽孢桿菌細胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌細胞、嗜堿芽孢桿菌細胞、解淀粉芽孢桿菌細胞、克勞氏芽孢桿菌細胞、耐鹽芽孢桿菌細胞、巨大芽孢桿菌細胞、凝結芽孢桿菌細胞、環狀芽孢桿菌細胞、燦爛芽孢桿菌細胞、蘇云金芽孢桿菌細胞、白色鏈霉菌細胞、變鉛青鏈霉菌細胞、天藍色鏈霉菌細胞、灰色鏈霉菌細胞、假單胞菌屬物種細胞和產堿假單胞菌細胞。
27.根據權利要求26所述的細胞，其中所述細胞為大腸桿菌。
28.根據權利要求21-27中任一項所述的細胞，其中所述類異戊二烯前體為甲羥戊酸(MVA)。
29.—種產生類異戊二烯前體的方法，包括:(a)在適于產生類異戊二烯前體的培養條件下培養根據權利要求21所述的宿主細胞；以及(b)產生所述類異戊二烯前體。
30.根據權利要求29所述的方法，還包括(c)回收所述類異戊二烯前體。
31.能夠增 加類異戊二烯的產量的重組細胞，所述細胞包含一種或多種包含選自如下的核苷酸序列的異源核酸: (a)來自鵓雞腸球菌的mvaE基因和mvaS基因； (b)來自鉛黃腸球菌的mvaE基因和mvaS基因； (c)來自屎腸球菌的mvaE基因和mvaS基因；和 (d)來自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因， 其中所述mvaE基因和mvaS基因編碼具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶催化活性的多肽，并且其中所述細胞還包含: 1.一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的核酸；和 i1.一種或多種編碼聚丙烯焦磷酸合酶的核酸， 其中與不包含所述mvaE基因和mvaS基因的產類異戊二烯細胞相比所述細胞產生增加量的類異戊二烯。
32.根據權利要求31所述的細胞，其中所述編碼MVA下游途徑的多肽的核酸包含選自如下的酶:(a)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶；(b)將甲羥戊酸5-磷酸轉化為甲羥戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉化為異戊烯焦磷酸的酶。
33.根據權利要求31或32所述的細胞，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、布氏擬甲烷球菌甲羥戊酸激酶多肽、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。
34.根據權利要求33所述的細胞，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
35.根據權利要求31-33中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。
36.根據權利要求31-35中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸克隆進多拷貝質粒中。
37.根據權利要求31-35中任一項所述的細胞，其中將所述一種或多種核酸整合進所述細胞的染色體中。
38.根據權利要求31-37中任一項所述的細胞，其中所述細胞為革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、埃希桿菌細胞、泛菌細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、木霉細胞、曲霉細胞或酵母細胞。
39.根據權利要求36所述的細胞，其中所述細胞選自大腸桿菌細胞、檸檬泛菌細胞、枯草芽孢桿菌細胞、地衣芽孢桿菌細胞、遲緩芽孢桿菌細胞、短芽孢桿菌細胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌細胞、嗜堿芽孢桿菌細胞、解淀粉芽孢桿菌細胞、克勞氏芽孢桿菌細胞、耐鹽芽孢桿菌細胞、巨大芽孢桿菌細胞、凝結芽孢桿菌細胞、環狀芽孢桿菌細胞、燦爛芽孢桿菌細胞、蘇云金芽孢桿菌細胞、白色鏈霉菌細胞、變鉛青鏈霉菌細胞、天藍色鏈霉菌細胞、灰色鏈霉菌細胞、假單胞菌屬物種細胞和產堿假單胞菌細胞。
40.根據權利要求39所述的細胞，其中所述細胞為大腸桿菌。
41.根據權利要求31-40中任一項所述的細胞，其中所述類異戊二烯選自單萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。
42.根據權利要求41所述的細胞，其中所述類異戊二烯為倍半萜。
43.根據權利要求31-41中任`一項所述的細胞，其中所述類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、a -金合歡烯、3 -金合歡烯、金合歡醇、香葉醇、香葉基香葉醇、芳樟醇、檸檬烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、廣藿香醇、(6-菔烯、檜烯、Y-萜品烯、異松香烯和瓦倫西亞桔烯。
44.一種產生類異戊二烯的方法，包括:(a)在適于產生類異戊二烯的培養條件下培養根據權利要求31所述的宿主細胞；以及(b)產生類異戊二烯。
45.根據權利要求44所述的方法，還包括(C)回收所述類異戊二烯。
【文檔編號】C12N9/00GK103764814SQ201280031905
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月29日
【發明者】Z·Q·貝克, M·C·米勒, C·M·派瑞斯, Y·A·普里馬克, J·P·普奇, D·H·韋爾斯 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司