類胡蘿卜素組合物的制造方法

類胡蘿卜素組合物的制造方法
【專利摘要】本發明提供類胡蘿卜素組合物的制造方法，該方法包括：使用30℃以下的有機溶劑(A)對含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母清洗后，在10～70℃的溫度、用有機溶劑(B)對酵母中的類胡蘿卜素進行提取。并且，該制造方法不需要特殊的提取設備、無需經過煩雜的精制工序，另外并非一定需要使用對人體有害的有機溶劑，即可從法夫酵母屬酵母的培養物中，工業高效地生產含有高含量蝦青素等的天然物來源的類胡蘿卜素組合物。
【專利說明】類胡蘿卜素組合物的制造方法
【技術領域】[0001]本發明涉及類胡蘿卜素組合物的制造方法。更詳細而言，該類胡蘿卜素的制造方法的特征在于從法夫酵母屬酵母中提取蝦青素等類胡蘿卜素。
【背景技術】
[0002]類胡蘿卜素作為廣泛分布在自然界的呈現黃色、橙色直至紅色或者紫色的天然色素被公知，其中之一的蝦青素，作為魚類、雞蛋的著色劑在飼料用途中廣泛使用。此外公知蝦青素作為食品添加劑在油脂加工食品、蛋白質性食品、水溶液狀食品、健康食品等中廣泛使用。進一步地，近年來通過利用蝦青素的對于由自由基所誘發的脂質過氧化的抗氧化活性、以及其高達α-生育酚的數百倍的對單線態氧的消除作用等的強抗氧化作用，來抑制體內過剩的活性氧，期待蝦青素作為化妝品類或功能性食品、醫藥品用于以下用途:斑和皺紋的改善，預防白內障、動脈硬化、或心臟病等，強化免疫力、或預防癌癥等。
[0003]蝦青素廣泛分布在自然界中的鮭魚、鱒魚、鯛等魚類，螃蟹、蝦、磷蝦等甲殼類等中，同時也可以通過屬于副球菌屬(Paracoccus)、短桿菌屬(Brevibacterium)等細菌類，雨生紅球藻(Hematococcus pluvialis)等藻類，紅發夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)(別名:紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)等酵母類微生物生產。由于奸青素、玉米黃質等類胡蘿卜素在供給穩定性、成本方面存在問題，目前廣泛使用的是化學合成品。但是，化學合成品中混入了來源于制造方法的雜質，特別是存在會混入合成反應中使用的對人體有害的毒物類的擔憂，從安全性方面出發希望供給來源于天然原料的產品。
[0004]在這樣的背景下，多有如下報道:特別是，利用了認為適于工業規模大量生產的天然產物藻類、微生物來制造以蝦青素為代表的類胡蘿卜素的方法。例如，專利文獻I中報道了如下方法:對于紅球藻屬藻類，對經培養的藻類孢囊細胞進行熱丙酮處理，使雜質葉綠素溶出，然后用乙醇提取蝦青素的方法。但是，由于按照相同方法得到的類胡蘿卜素組合物中含有大量來源于生物體的雜質，因此，難以在工業上制造含有充足的蝦青素含量的類胡蘿卜素組合物，此外，難以將制造中使用的丙酮除去至例如食品添加劑使用的規定值以下的水平。
[0005]此外，專利文獻2還報道了如下方法:將破壞了細胞壁的紅球藻屬藻類和水、甘油等助溶劑混煉以得到成形體，將該成形體填充在提取槽內，供給超臨界流體以提取蝦青素，而不使用對人體有害的有機溶劑，由此得到0.5~60%含量的蝦青素的方法。但是，按照相同方法進行大量生產時需要特殊的設備，除此以外，為了達到充分的收率還需要長時間的提取操作，并且為獲得高含量蝦青素，還需要另行進行濃縮操作等，在工業生產高含量的類胡蘿卜素組合物時，無法滿足簡便性、經濟性。
[0006]專利文獻3公開如下方法:作為使用法夫酵母屬(法夫酵母屬)酵母的方法，將該酵母的菌體放入正己烷-乙醇的混合溶劑中，用壓縮粉碎機粉碎的同時進行提取，將濃縮提取物而得到的油狀物質在-50 V的冷卻狀態下懸濁，過濾以除去游離脂肪酸和甘油三酸酯，進一步將色素油中殘存的游離脂肪酸進行金屬皂化而除去，從而將蝦青素高濃度化。此外，專利文獻4公開了如下方法:用有機溶劑提取法夫酵母屬(法夫酵母屬)酵母的破碎菌體，將提取液濃縮后得到的油狀粗提物通過離子交換色譜法、吸附色譜法等精制方法精致，得到蝦青素或其酯類。但是這些方法中的任一方法的工序都很復雜，特別是在后者方法中，低濃度的蝦青素的粗提液需經過多種色譜法進行精制，采用繁雜的工序，因此難以實現工業化。
[0007]另一方面，專利文獻5，6報告如下例子:使用生產蝦青素的新的細菌(E-396株)，用低級醇或者低級醇和水的混合物進行提取，之后將其濃縮得到沉淀物，通過用低級醇類對沉淀物清洗，得到蝦青素含量為40%以上的干燥物。按照相同方法可以僅用乙醇等安全性高的溶劑和水來制造高含量的蝦青素組合物，但在專利文獻5的情況下于80°C以上的溫度下進行提取，需要在密閉壓力容器中處理，此外，在上述高溫操作下，存在如下問題:天然來源的自由體反式蝦青素的一部分可能發生順式化，具有目標結構的蝦青素的精制收率低。進一步地，專利文獻5、6的方法，對于確認了該制造的新的細菌以外的菌，實際上是否適用尚且未知。
[0008]除此以外，專利文獻7還報道了以下制造方法:用丙酮提取培養后的法夫酵母屬(法夫酵母屬)酵母菌體，將得到的提取液濃縮得到粗提物，向粗提物中加入烴類溶劑，使其結晶析出。該法具有簡便性高，可得到蝦青素含量為40%以上的高含量的組合物等優點，但是制造過程中使用烴類溶劑，因此存在著最終得到的組合物中殘留此類溶劑的擔憂。
[0009]特別是，公知法夫酵母屬酵母每單位干燥菌體重量含有25重量％左右的脂質，由該酵母得到的提取液的組成中以該脂質為主成分，因此將這樣的提取液濃縮后得到的濃縮物會變成很黏的粘性液體。因此， 為了使用法夫酵母屬酵母獲得含有高濃度蝦青素的組合物，需要在制造中除去以脂質為代表的大量雜質，其結果，需要伴隨如上所述的復雜且非工業的方法，或需要使用己烷等有機溶劑，所述有機溶劑對人體有害，對其在最終產品中的殘留量進行了限制。
[0010]基于上述情況，謀求如下制造類胡蘿卜素組合物的方法:通過操作簡便，且殘留溶劑少、或者殘留溶劑不會產生問題的方法來制造含有高濃度蝦青素的天然來源的類胡蘿卜素組合物。
[0011]現有技術文獻
[0012]專利文獻
[0013]專利文獻1:日本特開平11-56346號公報
[0014]專利文獻2:日本特開2004-41147號公報
[0015]專利文獻3:日本特開平7-101827號公報
[0016]專利文獻4:日本特開平10-276721號公報
[0017]專利文獻5:W02009/028643號公報
[0018]專利文獻6:日本特開2007-319015號公報
[0019]專利文獻7:日本特開2004-208504號公報

【發明內容】

[0020]發明要解決的問題
[0021]如上所述，現有的含有高濃度蝦青素的天然來源的類胡蘿卜素組合物的制造方法中，提取操作需要特殊的設備，或為了除去來源于菌體的脂質等雜質需要復雜且非工業的方法等，會導致操作煩雜化、成本增加的問題。進一步地，在制造過程中使用烴類溶劑等不適合于食用用途的有機溶劑的情況下，殘留溶劑的去除已成問題。特別是，對于脂質含量多的法夫酵母屬酵母，或者難以進行為得到高濃度蝦青素的精制操作，或可能實現但會變成非常煩雜的操作，其中，認為在工業水平上進行含有蝦青素的組合物的粉末化事實上是不可能的。例如，本發明人將上述專利文獻5的方法實際運用于法夫酵母屬酵母時明確:沉淀物中殘存了大量的脂 質，在清洗工序中不進行過濾等操作，難以以滿意的效率進行制造。
[0022]本發明的目的在于提供如下制造方法，該方法能夠在不需要特殊提取設備、煩雜的精制工序、此外在未必需要使用對人體有害的有機溶劑的條件下，從法夫酵母屬酵母的培養物中高效地工業生產含有高濃度蝦青素等的天然來源的類胡蘿卜素組合物。
[0023]解決問題的方法
[0024]對上述問題進行了深入研究后，結果發現:從法夫酵母屬酵母提取類胡蘿卜素之前，在特定條件下清洗該酵母，能夠從法夫酵母屬酵母高效提取蝦青素等類胡蘿卜素，此外，該方法也適用于工業生產，從而完成了本發明。
[0025]即，本發明涉及類胡蘿卜素組合物的制造方法，該方法包括:
[0026]使用30°C以下的有機溶劑(A)對含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母進行清洗的工序，以及
[0027]在10~70°C的溫度、用有機溶劑(B)對清洗過的酵母中的類胡蘿卜素進行提取的工序。
[0028]類胡蘿卜素優選蝦青素。
[0029]有機溶劑(A)優選為選自酮類、醇類、烴類、醚類以及脂肪酸酯類中的至少I種有機溶劑。
[0030]有機溶劑(B)優選為選自醇類、烴類以及醚類中至少I種的有機溶劑。
[0031]優選有機溶劑(A)以及有機溶劑(B)均為乙醇。
[0032]優選進一步包括對得到的類胡蘿卜素提取液進行濃縮使其成為油狀組合物的工序。
[0033]得到的油狀組合物中的蝦青素含量優選為I~20重量％。
[0034]進一步優選使類胡蘿卜素從得到的類胡蘿卜素提取液中析出，并對得到的析出物進行固液分離而使其成為粉末組合物的工序。
[0035]得到的粉末組合物中的蝦青素含量優選為20~80重量％。
[0036]進一步，本發明涉及類胡蘿卜素組合物，其含有蝦青素，所述蝦青素在粉末X射線衍射中，于衍射角 13.3° (2Θ±0.2° )、13.8° (2Θ±0.2° )、14.3° (2Θ±0.2° )、15.8 ° (2Θ±0.2 ° )、16.3 ° (2 θ ±0.2 ° )、18.2 ° (2 θ ±0.2 ° )、20.5° (2Θ±0.2° )、24.8° (2 θ ±0.2° )以及 25.3。(2 θ ±0.2° )處有峰，并且具有(3R、3’ R)的化學結構。
[0037]優選上述類胡蘿卜素組合物為卡爾粉體流動特性指數(Carr index)在60以上的粉體。
[0038]上述類胡蘿卜素組合物中的蝦青素含量優選為20~80重量％。
[0039]進一步本發明涉及類胡蘿卜素組合物，其為油狀組合物，其含有法夫酵母屬酵母來源的蝦青素，并且組合物中的麥角固醇含量相對于蝦青素含量的比率為40重量％以下。
[0040]優選上述類胡蘿卜素組合物中的蝦青素含量為I~20重量％，并且所述組合物在30°C、剪切速度為100s—1時的粘度為0.01~IPa.S。
[0041]發明效果
[0042]按照本發明的制造方法，通過事先除去法夫酵母屬酵母中含有的脂質等大部分雜質，之后可以高效地進行類胡蘿卜素的提取、濃縮操作，因此可以提供簡便且適于工業生產的、天然物來源的類胡蘿卜素組合物的制造方法。此外按照本發明的制造方法，可以僅使用適于食用用途的安全的溶劑進行操作，可以通過操作簡便、且殘留溶劑少或者殘留溶劑不會產生問題的方法進行制造。
[0043]進一步地，按照本發明可制造的類胡蘿卜素組合物，不僅高濃度地含有以蝦青素等為目標物的類胡蘿卜素，還可以得到具有優異的粉體流動特性的粉體。此外，向按照本發明可制造的類胡蘿卜素組合物中添加食用液體油脂，使之成為油狀物的情況下，和按照現有方法制得的相同蝦青素含量的油狀物相比，可以得到粘度低、操作方面優異的油狀物。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1:表示實施例14、比較例5以及參考例I中的組合物的吸收性的評價結果的圖。
【具體實施方式】
[0045]以下詳細說明本發明的實施方式。
[0046]本發明的制造方法是類胡蘿卜素組合物的制造方法，其包括:使用30°C以下的有機溶劑(A)對含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母進行清洗后，在10~70°C的溫度、用有機溶劑(B)對酵母中的類胡蘿卜素進行提取。
[0047]作為本發明中的類胡蘿卜素，沒有特別限定，具體地可列舉:a-胡蘿卜素、β_胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、S-胡蘿卜素、番茄紅素等胡蘿卜素類，葉黃素、玉米黃質、角黃素、巖藻黃素、蝦青素、花藥黃質等葉黃素類等，其中，本發明的制造方法特別適合于制得蝦青素作為類胡蘿卜素。此種情況下，作為得到的蝦青素也包括得到蝦青素和蝦青素以外的類胡蘿卜素的混合物的情況。
[0048]作為用作本發明的制造方法中的原料的法夫酵母屬酵母，只要是生產類胡蘿卜素的物質，就不做特別限定，但是特別是作為制造作為類胡蘿卜素的蝦青素的法夫酵母屬酵母的具體例，可列舉法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(別名:法夫酵母(Phaffia rhodozyma))等。
[0049]需要說明的是，本發明中，不僅限于使用上述法夫酵母屬酵母的野生株，例如，還可優選使用對類胡蘿卜素類的生物合成相關的基因的轉錄以及翻譯活性、或者表達蛋白質的酶活性進行了改變或改良的突變體、重組體，所述類胡蘿卜素類是上述法夫酵母屬酵母的目標產物。
[0050]對本發明中使用的法夫酵母屬酵母的培養方法不做特別限定，只要適當選擇適宜作為對象的法夫酵母屬酵母的培養方法，或者適合作為目標產物的類胡蘿卜素的生產的培養方法即可。作為培養用碳源，可列舉，例如:蔗糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、玉米糖漿、糖蜜、淀粉、甘油、乙醇、醋酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等，但不限定于這些物質。這些碳源可以單獨使用，以增加菌體中的類胡蘿卜素的含量作為目的，可以組合使用2種以上的碳源。組合使用2種以上的碳源的情況下，可將這些碳源同時添加至培養基中，也可以在培養過程中變更添加的碳源。作為后者的例子可列舉:作為碳源，在培養的前半段添加葡萄糖、在培養的后半段使用木糖進行培養的方法；同樣，在前半段使用葡萄糖，在后半段使用麥芽糖進行培養的方法；在前半段使用葡萄糖、在后半段使用乙醇進行培養的方法；在前半段使用葡萄糖、在后半段使用甘油進行培養的方法；以及在前半段使用葡萄糖、在后半段使用檸檬酸的培養方法等，但不限定于上述組合，任何碳源的組合都可同樣實施。作為培養用氮源，可列舉:例如，氨、銨鹽、尿素、氨基酸類、酵母提取物、胨、玉米漿等，但不限定于上述物質。上述的氮源可單獨使用，和碳源的情況相同，也可組合使用其中2種以上。作為碳源、氮源以外的營養素，可列舉，例如:磷酸等磷源、鎂、鉀、鈉、銅、鐵、鋅、錳、鑰等礦物質，生物素等維生素類等，但不限定于上述物質。碳源、氮源、以及其他的營養素，可通過一次性添加、分開添加、或者連續添加等方法供給。對培養溫度不做特別限定，但優選15~26°C的范圍。對培養液的PH不做特別限定，但優選3~7的范圍。
[0051]本發明的制造方法中，從按照如上所述的培養得到的含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母中提取酵母細胞中的類胡蘿卜素時，可從培養后的法夫酵母屬酵母中直接提取，也可根據要求將上述法夫酵母屬酵母破碎而使其成為細胞破碎物，再從該破碎物中提取。因此作為本發明的制造方法中使用的“法夫酵母屬酵母”，其所指的對象是酵母細胞本身，通過冷凍干燥、噴霧干燥等干燥得到的物質，以及以下所述實施了細胞破碎處理的物質中的任意物質。特別是酵母細胞的破碎，有助于高效地提取在法夫酵母屬酵母中生產、蓄積的類胡蘿卜素。細胞破碎處理未必是必需的，但若不對細胞進行破碎，則在細胞中生產、蓄積的類胡蘿卜素的回收率較低。需要說明的是，本發明中的酵母細胞的破碎，以能夠提取作為目標物的類胡蘿卜素的程度為準，進行對細胞壁表面結構的損傷即可，不需要一定將細胞壁完全破壞，或者使酵母細胞片段化。
[0052]成為上述細胞破碎和/或后述的利用有機溶劑(A)進行清洗的對象的法夫酵母屬酵母的形態可列舉:含有該酵母的培養液，將該培養液進行濃縮后的物質，通過加壓過濾、減壓過濾、自然過濾、離心分離、傾析等常規方法從這些培養液中采集作為濕菌體的法夫酵母屬酵母得到的物質，或將該濕菌體進行清洗后的物質，或將濕菌體懸浮在溶劑(例如:包括水、生理食鹽水、緩沖液等)中得到的物質，或使上述濕菌體干燥后得到的干燥菌體、或者通過噴霧干燥、冷凍干燥等使含有該酵母的培養液干燥得到的干燥菌體、使這些干燥菌體懸浮在溶劑(例如，包括水、生理食鹽水、緩沖液等)中得到的物質等，上述任意物質均可。此外，進行上述過濾操作的情況下，為了高效的操作可以使用過濾助劑，這種情況下，可以不除去使用的過濾助劑而以濕菌體或者干燥菌體的形式進行以后的操作。在細胞破碎時，優選法夫酵母屬酵母懸浮在水性溶劑中的水性懸浮液的形態，從操作性等方面出發，更優選使用下述物質作為法夫酵母屬酵母的水性懸浮液:含有法夫酵母屬酵母的培養液本身，或對該培養液進行濃縮得到的物質、或將法夫酵母屬酵母的濕菌體懸浮在溶劑中得到的物質。
[0053]上述法夫酵母屬酵母的破碎，通過以下的I種或者幾種破碎方法以任意順序進行。作為破碎方法，可列舉，例如:除物理處理、化學處理、酶處理之外，還有加熱處理、自溶解、滲透壓溶解、原生質溶解等。
[0054]作為上述物理處理，可列舉:例如，使用高壓均質器、旋轉刃式均質器、超聲波均質器、法壓壺、球磨機等，或組合使用這些物理處理。
[0055]作為上述化學處理，可列舉:例如，使用鹽酸、硫酸等酸(優選強酸)的處理，使用氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿(優選強堿)的處理等，或者組合使用這些化學處理。
[0056]作為上述酶處理，可列舉:例如，可以使用溶菌酶、酵母裂解酶、葡聚糖酶、Novozyme、蛋白水解酶、纖維素酶等的方法，也可以適當地組合使用這些酶處理。
[0057]作為上述加熱處理可列舉:例如，在60~140°C加熱30分鐘~3小時左右的處理。
[0058]作為上述自溶解，可列舉:例如，除通過乙酸乙酯等溶劑進行的處理以外，還有在30~60°C加熱I~48小時左右的處理等。
[0059]此外，通過使用和細胞內的鹽濃度不同的溶液進行處理，可以引發細胞的滲透壓溶解、原生質溶解。但是，僅通過此方法，多發生細胞的破碎效果不充分的情況，因此優選組合使用上述的物理處理、化學處理、酶處理、加熱如理、自溶解等。上述破碎方法中，優選物理處理、化學處理(特別是酸處理，優選強酸(例如，水溶液中的PKa為2.5以下的酸))、加熱處理，從高效破碎的觀點出發，更優選物理處理、化學處理。
[0060]本發明的制造方法中，將如上述制備的含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母，用30°C以下的有機溶劑(A)進行清洗。在此，清洗優選在含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母作為濕菌體、干燥菌體或者水性懸浮液的狀態下進行。此外，對該情況下的濕菌體、干燥菌體的含水率、水性懸浮液中的 菌體濃度不做特別限制，但若為濕菌體，通常可優選使用含水率在20~75重量％的范圍的物質，若為干燥菌體，通常可優選使用含水率在0.01~20重量％的范圍的物質，此外，若為水性懸浮液，通常可使用作為干燥重量換算的菌體濃度在I~25重量％的范圍的物質。
[0061]本發明的制造方法中，作為清洗時所用的有機溶劑(A)，不做特別的限定，但優選在清洗條件下，對目標物類胡蘿卜素的溶解度不高的溶劑。作為這樣的有機溶劑，可以優選使用例如酮類、醇類、烴類、醚類、以及脂肪酸酯類。
[0062]作為上述酮類，不做特別限制，可以適當使用碳原子數為3~6的物質。作為具體例，可列舉:例如，丙酮、甲乙酮、甲基丁基酮、甲基異丁基酮等。優選丙酮、甲乙酮、最優選丙酮。
[0063]作為上述醇類，無論環狀、非環狀，也無論飽和、不飽和，不做特別限制，但是通常優選使用飽和醇。通常碳原子數為I~20，優選碳原子數為I~12，更優選碳原子數為I~
6。其中，優選碳原子數為I~5的一元醇、碳原子數為2~5的二元醇、碳原子數為3的三元醇。
[0064]作為這些醇類的具體例，可列舉:例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、
2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-1^一烷醇、
1-十二烷醇、烯丙醇、丙炔醇、苯甲醇、環己醇、1-甲基環己醇、2-甲基環己醇、3-甲基環己醇、4-甲基環己醇等一元醇；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1.3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3 丁二醇、1，4- 丁二醇、2，3- 丁二醇、1，5戊二醇等二元醇；甘油等三元醇。[0065]作為一元醇，優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-1^一烷醇、1-十二烷醇、苯甲醇、環己醇、1-甲基環己醇、2-甲基環己醇、3-甲基環己醇、4-甲基環己醇等。更優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1- 丁醇、環己醇等。更加優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特別優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇等。最優選乙醇。
[0066]作為二元醇，優選:1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3丙二醇等，最優選1，2_乙二醇。作為三元醇，優選甘油。
[0067]作為上述烴類，不做特別的限制，可列舉:例如，脂肪族烴、芳香族烴、鹵代烴等。其中優選脂肪族烴、芳香族烴，更優選脂肪族烴。 [0068]作為脂肪族烴，無論環狀，非環狀，也無論飽和、不飽和，不做特別的限制，但通常優選使用飽和脂肪族烴。通常使用碳原子數為3~20的脂肪族烴，優選碳原子數為5~12的脂肪族烴，更優選碳原子數為5~8的脂肪族烴。作為具體例，可列舉:例如，丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2- 二甲基丁烷、2，3- 二甲基丁烷、庚烷、庚燒異構體(例如:2_甲基己燒、3-甲基己燒、2，3- 二甲基戍燒、2，4- 二甲基戍燒)、辛燒、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、對萜烷、環己烯等。優選:戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁燒、庚燒、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3- 二甲基戍燒、2，4- 二甲基戍燒、羊燒、2，2, 3- 二甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、對萜烷等。更優選:戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁燒、2，3-二甲基丁燒、庚燒、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3-二甲基戍燒、2，4-二甲基戊烷、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷等，更加優選:戍烷、己烷、環己烷、甲基環己烷等，從對氧化的防護效果特別高的觀點出發，特別優選:庚烷、甲基環己燒，最優選庚烷。
[0069]作為芳香族烴，不做特別的限制，通常使用碳原子數為6~20的芳香族烴，優選使用碳原子數為6~12的芳香族烴，更優選碳原子數為7~10的芳香族烴。作為具體例，可列舉:苯、甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙基苯、異丙苯、均三甲苯、四氫化萘、丁基苯、對甲基異丙基苯、環己基苯、二乙基苯、戍基苯、二戍基苯、十二烷基苯、苯乙烯等。優選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙基苯、異丙苯、均三甲苯、四氫化萘、丁基苯、對甲基異丙基苯、環己基苯、二乙基苯、戍基苯等。更優選:甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、異丙苯、四氫化萘等。最優選異丙苯。
[0070]作為鹵代烴，無論環狀、非環狀，也無論飽和、不飽和，不做特別限制，但通常優選使用非環狀的鹵代烴。更優選氯代烴、氟代烴，進一步優選氯代烴。此外，可適當使用碳原子數為I~6的鹵代烴，優選使用碳原子數為I~4的鹵代烴、更優選使用碳原子數為I~2的鹵代烴。作為具體例，可列舉:例如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，I, 1-三氯乙烷、1，I, 2-三氯乙烷、1，I, I, 2-四氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1，2-二氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷、氯苯、1，I, 1,2-四氟乙烷等。優選:二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙燒、1，2_二氣乙燒、1，I, 1-二氣乙燒、1，I, 2_二氣乙燒、1，1-二氣乙稀、1，2_二氣乙稀、二氯乙烯、氯苯、1，I, 1，2_四氟乙烷等。更優選:二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，I, I, 2-四氟乙燒等 。
[0071]作為上述醚類，無論環狀、非環狀，也無論飽和、非飽和，不做特別限制，但通常優選使用飽和醚類。通常使用碳原子數為3~20的醚類，優選使用碳原子數為4~12的醚類，更優選使用碳原子數為4~8的醚類。作為具體例，可列舉:例如，二乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二異丙醚、二丁醚、二己醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧雜環己烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇單丁醚等。優選二乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二異丙醚、二丁醚、二己醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧雜環己烷、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚等。更優選:二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚、二氧雜環己烷、四氫呋喃、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚等。進一步優選:二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚、二氧雜環己烷、四氫呋喃、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚等。更進一步優選:二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚等。最優選甲基叔丁基醚。
[0072]作為上述脂肪酸酯類，不做特別的限制，可列舉:例如，丙酸酯、乙酸酯、甲酸酯等。優選:乙酸酯、甲酸酯，進一步優選乙酸酯。作為酯基，不做特別的限制，通常使用碳原子數為I~8的烷基酯、碳原子數為7~12的芳烷基酯，優選使用碳原子數為I~6的芳烷基酯，進一步優選使用碳原子數為I~4的烷基酯。
[0073]作為丙酸酯的具體例，可列舉:例如，丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸異戊酯等。優選丙酸乙酯等。
[0074]作為乙酸酯的具體例，可列舉:例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸仲己酯、乙酸環己酯、乙酸芐基酯等。優選:乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸仲己酯、乙酸環己酯等。進一步優選:乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯等，最優選乙酸乙酯。
[0075]作為甲酸酯的具體例，可列舉:例如，甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸戊酯等。優選:甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸戊酯等，最優選甲酸乙酯。
[0076]關于本發明的有機溶劑(A)，不言而喻，上述溶劑可以單獨使用，也可以組合2種以上使用。此外，上述溶劑也可以在和水混合的狀態下使用。即，含水有機溶劑也包括在本發明的有機溶劑(A)中。
[0077]在本發明的制造方法中，作為清洗時的溫度條件，只要滿足將清洗用有機溶劑(A)的溫度設定在30°C以下的條件，就不做特別限定，優選20°C以下，更優選10°C以下，特別優選8°C以下。有機溶劑(A)的溫度超過30°C時會產生以下問題:清洗液中的類胡蘿卜素的含量升高，其結果，可從酵母中提取的類胡蘿卜素量降低，類胡蘿卜素的回收率變差。
[0078]此外，清洗所使用的有機溶劑㈧的量，并不因使用的有機溶劑㈧的種類、洗凈時的溫度、作為目標物的類胡蘿卜素的種類而作特別限定，但例如，類胡蘿卜素相對于有機溶劑(A)的溶解度在30重量％以下的條件、具體而言，相對于菌體的干燥重量I重量份，有機溶劑(A)的量在200重量份以下、進一步優選50重量份以下、更優選20重量份以下，可以在一定程度上抑制清洗時類胡蘿卜素的損失。但是，在清洗時的有機溶劑(A)的溫度非常低的情況下，或使用幾乎不能溶解目標物類胡蘿卜素的有機溶劑(A)(例如:甘油、己烷、乙酸乙酯、甲苯等)的情況下，使用更多量的有機溶劑㈧進行清洗，也可達成同樣的目的。
[0079]特別是，以制得作為類胡蘿卜素的蝦青素為目的的情況下，作為有機溶劑㈧優選使用酮類或者醇類，其中，進一步優選使用丙酮或者乙醇，更優選使用乙醇。例如，使用丙酮或者乙醇作為有機溶劑(A)的情況下，作為其用量，不做特別限定，例如:相對于菌體的干燥重量I重量份，有機溶劑(A)優選為0.1重量份以上，進一步優選I重量份以上，更優選5重量份以上，且優選200重量份以下，進一步優選50重量份以下，更優選20重量份以下。
[0080]本發明的制造方法中，使用有機溶劑(A)對含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母進行清洗時的清洗方式不做特別限制，例如，可以用攪拌葉或靜態混合攪拌器、泵等進行混合，或在對菌體進行過濾操作時，向濾板上的法夫酵母屬酵母中添加有機溶劑(A)進行過濾清洗，從清洗效率的觀點出發，優選使用攪拌葉使含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母和有機溶劑(A)接觸、混合一定時間，之后，將該法夫酵母屬酵母和有機溶劑(A)分離，從而進行清洗操作。對這種情況下的清洗時間(即，有機溶劑(A)和含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母的接觸時間)，不做特別的限制，但優選24小時以內，進一步優選I分鐘~6小時的范圍，更優選10分鐘~3小時的范圍。需要說明的是，在此，通過適宜調整清洗時間，可以在一定程度上抑制清洗時類胡蘿卜素的損失。此外，對清洗結束后的法夫酵母屬酵母和有機溶劑(A)的分離操作的種類不做特別的限制，可以通過加壓過濾、減壓過濾、自然過濾、離心分離、傾析等常規方法進行實施，不言而喻，也可以組合進行上述操作。在進行過濾操作的情況下，為了高效操作可以使用過濾助劑。
[0081]本發明的制造方法中，如上所述，在進行提取操作之前，使用有機溶劑(A)對法夫酵母屬酵母預先進行清洗，從菌體內含有大量脂質的法夫酵母屬酵母中，除去來源于菌體的以脂質為主的大部分雜質，最終除了可實現所制得的目標物類胡蘿卜素組合物的高含量化、降低作為油狀組合物時的粘度、提高得到粉末組合物時的粉體流動性，還可以抑制在制造過程中由殘存脂質引起的黏性，大幅改善粘附在裝置內等問題等，增加生產效率或生產率。
[0082]在本發明的制造方法中，隨后，從使用上述有機溶劑(A)進行了清洗的法夫酵母屬酵母中，在10~70°C的溫度、使用有機溶劑⑶進行作為目標物的類胡蘿卜素的提取。
[0083]在本發明的制造方法中，作為提取所使用的有機溶劑(B)，若能夠有效地提取目標物類胡蘿卜素就不做特別的限制，例如，可優選使用醇類，烴類以及醚類。
[0084]作為上述醇類，無論環狀、非環狀，也無論飽和、不飽和，不做特別限制，通常優選使用飽和醇類。通常 ，碳原子數為1~20，優選碳原子數為1~12，進一步優選碳原子數為I~6。其中，優選碳原子數為I~5的一元醇，碳原子數為2~5的2元醇，碳原子數為3的3元醇。
[0085]作為這些醇的具體例可列舉:例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、 3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-1^一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、丙炔醇、苯甲醇、環己醇、1-甲基環己醇、2-甲基環己醇、3-甲基環己醇、4-甲基環己醇等一元醇；1，2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2，3- 丁二醇、1，5-戊二醇等2元醇；甘油等3元醇。
[0086]作為I元醇，優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-1^一烷醇、1-十二烷醇、苯甲醇、環己醇、1-甲基環己醇、2-甲基環己醇、3-甲基環己醇、4-甲基環己醇等。進一步優選:甲醇、乙醇、
1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、
2-乙基-1-丁醇、環己醇等。更優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇等。特別優選:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、2-乙基-1-丁醇、異戊醇等，最優選乙醇。
[0087]作為2元醇，優選:1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇等，最優選1，2_乙二醇。作為3元醇，優選甘油。
[0088]作為上述烴類，不做特別限制，可列舉:例如，脂肪族烴、芳香族烴、鹵代烴等。其中優選脂肪族烴、芳香族烴，進一步優選脂肪族烴。
[0089]作為脂肪族烴，無論環狀、非環狀，也無論飽和、不飽和，不做特別限制，通常優選使用飽和脂肪烴。通常使用碳原子數為3~20的脂肪族烴，優選使用碳原子數為5~12的脂肪族烴，進一步優選使用碳原子數為5~8的脂肪族烴。作為具體例，可列舉:例如，丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構體(例如:2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、
1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、對萜烷、環己烯等。優選:戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁燒、2，3- 二甲基丁燒、庚燒、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3- 二甲基戍燒、2，4- 二甲基戍燒、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、對萜烷等。進一步優選:戊烷、2-甲基丁烷、己烷、
2-甲基戍燒、2，2-二甲基丁燒、2，3- 二甲基丁燒、庚燒、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3- 二甲基戊烷、2，4- 二甲基戊烷、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷等，更優選:戊烷、己烷、環己烷、甲基環己烷等，從氧化的防護效果特別高的觀點出發，特別優選:庚烷、甲基環己烷，最優選庚烷。[0090]作為芳香族烴，不做特別限制，通常使用碳原子數為6~20的芳香族烴，優選使用碳原子數為6~12的芳香族烴，進一步優選使用碳原子數為7~10的芳香族烴。作為具體例，可列舉:例如，苯、甲苯、二甲苯，鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙基苯、異丙苯、均三甲苯、四氫化萘、丁基苯、對甲基異丙基苯、環己基苯、二乙基苯、戍基苯、二戍基苯、十二燒基苯、苯乙烯等。優選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲醚、對二甲苯、乙基苯、異丙苯、均三甲苯、四氫化萘、丁基苯、對甲基異丙基苯、環己基苯、二乙基苯、戍基苯等。進一步優選:甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、異丙苯、四氫化萘等。最優選異丙苯。
[0091]作為鹵代烴，無論環狀、非環狀，也無論飽和、不飽和，不做特別限制，但通常優選使用非環狀的鹵代烴。進一步優選使用氯代烴、氟代烴，更優選氯代烴。此外，可適當使用碳原子數為I~6的鹵代烴，優選使用碳原子數為1~4的鹵代烴，進一步優選使用碳原子數為1~2的鹵代烴。作為具體例，可列舉:例如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2_ 二氣乙燒、1，1, 1- 二氣乙燒、1，1, 2_ 二氣乙燒、1，1, 1, 2-四氣乙燒、1，1, 2, 2-四氣乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1，2-二氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷、氯苯、1，I, 1,2-四氟乙烷等。優選:二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，1, 1-三氯乙烷、1，1, 2-三氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，1，1,2-四氟乙烷等。進一步優選:二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，1, 1, 2-四氟乙燒等。
[0092]作為上述醚類，無論環狀、非環狀，也無論飽和、非飽和，不做特別限制，但通常優選使用飽和醚類。通常使用碳原子數為3~20的醚類，優選使用碳原子數為4~12的醚類，進一步優選使用碳原子數為4~8的醚類。作為具體例，可列舉:例如，二乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二異丙醚、二丁醚、二己醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧雜環己烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇單丁醚等。優選:二乙醚、甲基叔丁基酯、二丙醚、二異丙醚、二丁醚、二己醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二氧雜環己烷、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二丁醚、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚等。進一步優選:二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚、二氧雜環己烷、四氫呋喃、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚等。更優選:二乙醚、甲基叔丁基醚、茴香醚等。最優選:甲基叔丁基醚。
[0093]對于本發明中的有機溶劑(B)，不言而喻，上述溶劑可單獨使用，也可組合2種以上使用。此外，清洗時使用的有機溶劑㈧和提取時使用的有機溶劑(B)，可以相同也可以不同。從使用的溶劑的回收、再利用的觀點出發，優選清洗時使用的有機溶劑(A)和提取時使用的有機溶劑(B)使用相同的有機溶劑。此外，從不產生殘留溶劑的問題的觀點出發，最優選清洗時使用的有機溶劑(A)和提取時使用的有機溶劑(B)兩者均使用乙醇。
[0094]本發明的制造方法中，對作為提取溶劑使用的有機溶劑(B)的用量不做特別限定，有機溶劑(B)的用量相對菌體的干燥重量顯著較多的情況下，得到的提取液中的類胡蘿卜素濃度會變的極端稀薄，難以進行有效的精制處理。另一方面，相對對于菌體的干燥重量，有機溶劑⑶的用量顯著較少的情況下，雖然能夠得到高濃度的類胡蘿卜素提取液，但從類胡蘿卜素相對于有機溶劑(B)的飽和溶解度的觀點出發，極難有效地提取菌體中的類胡蘿卜素。從這樣的觀點出發，本發明的制造方法中有機溶劑(B)的用量，相對于菌體的干燥重量I重量份優選為I重量份以上，進一步優選為5重量份以上，最優選為10重量份以上。此外，對其上限也不做特別限定，優選1000重量份以下，進一步優選500重量份以下，最優選300重量份以下。
[0095]本發明的制造方法中，用有機溶劑⑶進行提取時的溫度在10~70°C的范圍，優選20°C以上，進一步優選25°C以上，特別優選35°C以上。此外，優選60°C以下，進一步優選50°C以下。需要說明的是，提取時的溫度越高提取效率越高，但超過70°C的情況下，類胡蘿
卜素中的蝦青素的一部分會發生順式體化等，產生類胡蘿卜素的結構變質的問題。另一方面，在低于10°C的提取溫度下，類胡蘿卜素相對于有機溶劑⑶的溶解度很低，因此難以得到滿意的收率。
[0096]在本發明的制造方法中，使用有機溶劑(B)進行提取操作時，對有機溶劑(B)和法夫酵母屬酵母的混合方式不做特別限制，例如:可以使用攪拌葉或靜態混合攪拌器、泵等，或高壓均質器、旋刃式均質器、超聲波均質器等破碎、乳化裝置，不言而喻，可以組合這些裝置進行提取。
[0097]在本發明的制造方法中，作為提取方法可以采用間歇提取、連續提取中的任意方法，可以多次重復進行這些操作，從生產率的各方面來看，優選在工業上連續提取，特別優選連續提取中的逆流多步提取。間歇提取的情況下，對攪拌時間不做特別限定，但通常為5分鐘以上，連續提取的情況下，對平均時間不做特別限制，但通常為10分鐘以上。此外，對間歇提取的次數也不做特別限定，即使是單次提取也可高效提取，但從收率的觀點出發，優選重復進行2次以上的提取。
[0098]需要說明的是，在本發明的制造方法中，從可以提高后續提取工序的提取效率，可大幅減少提取時使用的有機溶劑(B)的用量的觀點出發，優選在使用有機溶劑(B)進行提取前，在和提取時使用的有機溶劑(B)接觸的狀態下對清洗后的法夫酵母屬酵母進行加熱處理。加熱處理時使用的有機溶劑(B)的用量即便是提取時使用的有機溶劑(B)的用量的一部分，例如，相對于提取時使用的有機溶劑(B)的總用量，加熱處理時使用的有機溶劑(B)的量為其10~70%左右，也可發揮效果。具體而言，相對于菌體的干燥重量I重量份，在加熱處理時可優選使用I~50重量份以上的有機溶劑(B)，進一步優選5~30重量份左右的有機溶劑(B)。該加熱處理時的溫度，若在40°C以上就不做特別限定，但優選在50~80°C的范圍進行。對加熱時間也不做特別限定，優選I~120分鐘，進一步優選15~60分鐘。作為加熱方法也不做特別限定，可以在用有機溶劑(A)清洗了法夫酵母屬酵母后，加入加熱至給定溫度的有機溶劑(B)，也可以在加入常溫的有機溶劑(B)后，將該混合物加熱到給定溫度。此外，加熱時有機溶劑(B)和法夫酵母屬酵母可在靜置狀態下、也可在攪拌狀態下進行，優選在適當進行攪拌的狀態下進行加熱。這種情況下對攪拌方式不做特別限定，可以直接使用提取時所使用的混合方法和/或裝置。本發明的制造方法中，可在上述加熱處理后，除去加熱處理中使用的部分或者全部有機溶劑(B)后，進行下面的提取，但優選不對加熱處理后的有機溶劑(B)和法夫酵母屬酵母的混合物進行分離，而接著進行下面的提取工序。此外，提取時，可根據需要進一步追加需要的有機溶劑(B) ( 即，提取時使用的有機溶劑⑶為，加熱處理后殘留的有機溶劑⑶和之后根據需要追加的有機溶劑⑶的總和)。需要說明的是，加熱處理時的溫度比提取溫度高的情況下，可冷卻到所希望的溫度后，再實施下面的提取操作。[0099]上述使用有機溶劑(B)進行的類胡蘿卜素的提取操作結束后，進行法夫酵母屬酵母和有機溶劑(B)的分離。對分離操作的種類不做特別限定，可通過加壓過濾、減壓過濾、自然過濾、離心分離、傾析等常規方法進行，不言而喻，也可組合這些方法進行操作。
[0100]按照本發明的制造方法，可以高效地提取法夫酵母屬酵母中含有的蝦青素等類胡蘿卜素，其提取率通常在50%以上，進一步優選70%以上，更優選80%以上。
[0101]在本發明的制造方法中，可以得到如上所述獲得的類胡蘿卜素組合物的提取液本身，或對其進行適宜加工，獲得類胡蘿卜素組合物。對按照本發明的制造方法得到的類胡蘿
卜素組合物的性狀不做特別限定，優選按照以下說明進行處理得到的油狀組合物、或者粉末組合物。
[0102]上述油狀組合物可通過用有機溶劑(B)對類胡蘿卜素的提取液進行濃縮制造。對該情況下的濃縮操作的方式不做特別限制，可適當使用反應罐中的減壓濃縮、快速濃縮、薄膜濃縮等操作。
[0103]上述濃縮操作，優選實施至充分除去油狀物組合物中的有機溶劑(A)、或有機溶劑(B)。油狀組合物中的有機溶劑(A)以及有機溶劑(B)的殘留濃度，只要作為食品、化妝品、醫藥品而言處于不危害人體的程度就不做特別限制，作為油狀組合物中的殘留量，優選I重量％以下，進一步優選0.1重量％,更優選0.01重量％以下。
[0104]上述濃縮操作中的溫度條件，只要是不會在濃縮中顯著發生類胡蘿卜素的分解或順式體化等變質的條件，就不做特別限定，優選在10~80°C的范圍，進一步優選20~70°C的范圍，更優選25~60°C的范圍。 此外，本發明中的濃縮操作，可根據需要在減壓下進行。
[0105]在本發明的制造方法中，通過進行上述濃縮得到的濃縮物為油狀的情況下，可將其作為油狀組合物直接利用，但作為固體物被制得的情況下或從作為產品的易操作性的觀點出發，也可以通過向該濃縮物中添加液體油脂進行混合，從而制備目標油狀組合物。需要說明的是，本發明中的“油狀組合物”，不僅是指類胡蘿卜素和其他成分以均勻的油狀狀態混合在一起的情況，還包括類胡蘿卜素部分析出、成為漿狀的形態。
[0106]作為可進行上述添加的液體油脂，若是能夠使蝦青素等類胡蘿卜素的濃縮物溶解或者分散的油脂，就不做特別限定，例如，可以是來源于動植物的天然油脂，也可以是合成油脂或加工油脂。更優選在食品、化妝品或者醫藥用途中容許使用的油脂。作為植物油，可列舉:例如，椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油、亞麻油、山茶油、糙米胚芽油、菜籽油、米油、花生油、玉米油、小麥胚芽油、大豆油、蘇子油、棉籽油、向日葵籽油、木棉油、月見草油、牛油樹油脂(shea butter)、波羅雙樹脂(sal fat)、可可脂、芝麻油、紅花油、橄欖油等,作為動物油脂，可列舉:例如，豬油、乳脂、魚油、牛脂等，進一步可列舉:通過分離、氫化、酯交換等對其進行了加工而得到的油脂(例如硬化油)。不言而喻，也可使用中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)。或者可使用這些油脂的混合物。作為中鏈脂肪酸甘油三酯，可列舉:例如，脂肪酸的碳原子數分別為6~12、優選為8~12的甘油三酯。
[0107]上述油脂中，從容易操作，臭氣等方面出發，優選植物油脂，合成油脂、加工油脂等，作為進一步優選的具體例，可列舉:椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油、菜籽油、米油、大豆油、棉籽油、紅花油、橄欖油、MCT等。
[0108]可以在制作類胡蘿卜素提取液的濃縮物后，添加、混合上述液體油脂，從而制備作為目標物的類胡蘿卜素的油狀組合物，也可在提取操作、或者濃縮操作之前或中途預先添加，再進行之后的處理。
[0109]作為本發明的含有類胡蘿卜素的油狀組合物中的類胡蘿卜素的含量，不做特別限定，可根據目標產品所需要的用途適宜選擇，例如將蝦青素作為目標物類胡蘿卜素的情況下，從制備具有易操作的粘度、性狀的油狀組合物的觀點出發，作為油狀組合物中的蝦青素含量的上限，優選30重量％以下，進一步優選20重量％以下，更進一步優選15重量％以下。此外，作為油狀組合物中的蝦青素含量的下限，不做特別限定，優選0.1重量％以上，進一步優選I重量以上，更進一步優選3重量％以上。
[0110]特別地，按照本發明的制造方法，可以制造來源于法夫酵母屬酵母的麥角固醇的含量較低的油狀組合物。例如，按照本發明的制造方法得到的油狀組合物中，麥角固醇含量相對于蝦青素含量的比率(麥角固醇含量/蝦青素含量)在40重量％以下。即，如上所述，含有來源于法夫酵母屬酵母的蝦青素，且麥角固醇含量相對于蝦青素含量的比率在40重量％以下的、含有類胡蘿卜素的油狀組合物與其制造方法無關均屬于本發明的范疇。麥角固醇含量的比率優選35重量％以下，進一步優選30重量％以下。麥角固醇含量相對于蝦青素含量的比率可以通過高效液相色譜等測定。
[0111]進而，按照本發明的制造方法，不僅可以得到含有高濃度蝦青素的油狀組合物，而且與按照現有公知的制造方法得到的含有來源于法夫酵母屬酵母的蝦青素的油狀組合物相比，按照本發明的制造方法所得到的油狀組合物粘度非常低，具有容易操作的性狀的特點。例如，采用本發明優選的制造方法，可以制造目前還未實現的高濃度且低粘度的含有類胡蘿卜素的油狀組合物，該含有類胡蘿卜素的油狀組合物中，蝦青素含量為I~20重量％，30°C、剪切速度IOOs-1時的粘度為0.01~IPa.S，優選0.01~0.7Pa.s的范圍。即，含有來源于法夫酵母屬酵母的蝦青素，且蝦青素含量為I~20重量％，30°C、剪切速度IOOs-1時的粘度為0.01~IPa.S，優選0.01~0.7Pa.s的、含有類胡蘿卜素的油狀組合物與其制造方法無關均屬于本發明 的范疇。
[0112]進一步確認了:與按照現有公知的制造方法得到的來源于法夫酵母屬酵母的類胡蘿卜素組合物相比，按照本發明的制造方法得到的類胡蘿卜素組合物在由生物體吸收的吸收性方面也優異。
[0113]另一方面，在本發明的制造方法中，通過對利用有機溶劑(B)得到的類胡蘿卜素提取液進行濃縮和/或冷卻等處理，使類胡蘿卜素析出，并對得到的析出物進行固液分離，可以制造高濃度地含有作為類胡蘿卜素的蝦青素的粉末組合物。
[0114]需要說明的是，從法夫酵母屬酵母提取類胡蘿卜素的情況下，在提取工序之前未進行用有機溶劑實施的清洗工序的情況下，即使將提取液濃縮也只能得到粘稠的濃縮物，類胡蘿卜素不能以可分離的狀態析出，例如，如專利文獻5、6所述，即使用乙醇等清洗該濃縮液，也不能制得作為晶體的類胡蘿卜素，尤其是蝦青素。因此，按照本發明的制造方法，特別是以類胡蘿卜素組合物呈現粉末狀為目的時，下述順序非常重要，即，在利用有機溶劑(B)提取之前，先用有機溶劑(A)進行清洗。
[0115]本發明的制造方法中，對析出類胡蘿卜素的方法沒有特別的限制，可列舉，例如:濃縮提取液的同時進行蒸發析晶的方法；直接向提取液或者適宜濃縮后的提取液中添加類胡蘿卜素的不良溶劑，使類胡蘿卜素析出的方法；直接將提取液或者適宜濃縮后的提取液冷卻到超過類胡蘿卜素飽和溶解度的條件下進行析晶的方法等。本發明中，不言而喻，可以組合這些方法進行制造，但從收率、操作性的觀點出發，優選將提取液濃縮，在類胡蘿卜素呈現一定程度的結晶析出的狀態下，通過添加不良溶劑或冷卻使類胡蘿卜素析出。
[0116]在上述粉末組合物的制造中，進行提取液濃縮操作的情況下，提取液的濃縮倍率過低時，目標物類胡蘿卜素大部分溶解在母液中，制得的粉末組合物的總量變少，存在不能得到滿意的收率、生產率的傾向。另一方面，提取液的濃縮倍率過高的情況下，除類胡蘿卜素以外的來源于法夫酵母屬酵母的雜質的析出變得顯著，存在可制得的粉末組合物中的蝦青素含量低的問題。因此，在粉末組合物的制造中，為了滿足充分的收率、生產率、含量，應將提取液濃縮至適當的濃縮倍率，例如，優選濃縮至提取液的濃縮倍率在10~1000倍的范圍，進一步優選濃縮至50~500倍的范圍。
[0117]在粉末組合物的制造中，在上述析出操作之后，接著進行提取時使用的有機溶劑和析出物的固液分離。上述固液分離中可使用通常的固液分離操作，例如:傾析、離心分離、加壓過濾、減壓過濾、自然過濾等，進一步根據需要進行濾餅清洗，進而通過進行真空干燥等干燥處理以除去殘存的有機溶劑等，得到作為干燥粉末的類胡蘿卜素組合物。
[0118]對于蝦青素，在粉末X射線衍射中，公知有如下兩種多晶型:于衍射角 13.3 。 (20±0.2 。 )、13.8 。 (20±0.2 。 )、14.3 。 (2 0 ±0.2 。)、
15.8 ° (2 0 ±0.2 ° )、16.3 ° (2 0 ±0.2 ° )、18.2 ° (2 0 ±0.2 ° )、
20.5° (2 0 ±0.2。)、24.8。(20 ±0.2。)、以及25.3。(20 ±0.2。)處有強峰的 I型，以及于衍射角 12.2° (2 0 ±0.2° )、13.2° (2 0 ±0.2° )、13.5° (2 0 ±0.2° )、
16.1 ° (2 0 ±0.2 ° )、16.6 ° (2 0 ±0.2 ° )、20.1 ° (2 0 ±0.2 ° )、
21.3 ° (2 0±0.2 ° )、22.7 ° (2 0 ±0.2 ° )、24.6 ° (2 0±0.2 ° )、以及27.5° (20 ±0.2° )處有強峰的II型，可知按照上述本發明的制造方法得到的粉末組合物，在粉末X射線衍射中，于衍射角13.3° (2 0 ±0.2° )、13.8° (20 ±0.2° )、
14.3 ° (2 0 ±0.2 ° )、15.8 ° (2 0 ±0.2 ° )、16.3 ° (2 0 ±0.2 ° )、
18.2 ° (2 0±0.2 ° )、20.5 ° (2 0 ±0.2 ° )、24.8 ° (2 0 ±0.2 ° )以及25.3° (2 0 ±0.2° )處有強峰。即，按照本發明的制造方法得到的粉末組合物，作為晶型可以說是高含量含有I型蝦青素的類胡蘿卜素組合物。進一步地，按照本發明的制造方法得到的類胡蘿卜素組合物中的蝦青素是來源于法夫酵母屬的蝦青素，其具有(3R，3’ R)的化學結構。目前，還沒有報告來源于法夫酵母屬酵母的、高含量含有具備上述晶型和化學結構的蝦青素的粉末狀組合物。因此，在粉末X射線衍射中，含有下述蝦青素的類胡蘿卜素組合物與其制造方法無關均屬于本發明的范疇，所述蝦青素于衍射角13.3° (2 0 ±0.2° )、
13.8 ° (2 0 ±0.2 ° )、14.3 ° (2 0 ±0.2 ° )、15.8 ° (2 0 ±0.2 ° )、
16.3° (2 0 ±0.2° )、18.2° (2 0 ±0.2° )、20.5° (2 0 ±0.2° )、24.8° (2 0 ±0.2° )以及25.3° (2 0 ±0.2° )處有強峰，并且具有(3R，3’ R)的化學結構。
[0119]在本發明的制造方法中，通過在制造過程中使用有機溶劑(A)清洗菌體，除去大部分來源于法夫酵母屬酵母的脂質等雜質，作為類胡蘿卜素組合物而得到的粉末組合物，其粉體流動特性優異。具體地，按照本發明優選的制造方法得到的粉末組合物，能夠得到卡爾(Dr.Carr)粉體流動特性指數在60以上的粉體。從粉體的流動特性的觀點出發，其指數越高越優選，通過適宜選擇上述優選的制造條件，可以得到卡爾粉體流動特性指數在70以上，進一步80以上的粉末組合物。另一方面，按照專利文獻7的方法得到的含有蝦青素的粉末組合物，其卡爾粉體流動特性指數低于60，流動性差，存在輸送類胡蘿卜素粉末時效率惡化，無法順利填充至裝置等生產率、操作性方面的問題。因此，作為含有上述蝦青素的類胡蘿卜素組合物，卡爾粉體流動特性指數在60以上的粉體也是本發明的類胡蘿卜素組合物的優選方式之一。
[0120]需要說明的是，卡爾粉體流動特性指數是綜合評價粒子的刮鏟角、壓縮度、刮鏟角、均勻度的指數，在CHEMICAL ENGIBEERING, Januaryl8 (1965)中也有定義。有關上述粉體流動性指數的定義如表1所示。
【權利要求】
1.類胡蘿卜素組合物的制造方法，該方法包括: 使用30°C以下的有機溶劑(A)對含有類胡蘿卜素的法夫酵母屬酵母進行清洗的工序，以及 在10~70°C的溫度、用有機溶劑(B)對清洗過的酵母中的類胡蘿卜素進行提取的工序。
2.根據權利要求1所述的制造方法，其中，類胡蘿卜素為蝦青素。
3.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，有機溶劑(A)為選自酮類、醇類、烴類、醚類以及脂肪酸酯類中的至少I種有機溶劑。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的制造方法，其中，有機溶劑(B)為選自醇類、烴類以及醚類中的至少I種有機溶劑。
5.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，有機溶劑(A)和有機溶劑(B)均為乙醇。
6.根據權利要求1~5中任一項所述的制造方法，其進一步包括: 對得到的類胡蘿卜素提取 液進行濃縮使其成為油狀組合物的工序。
7.根據權利要求6所述的制造方法，其中，得到的油狀組合物中的蝦青素含量為I~20重量％。
8.根據權利要求1~5中任一項所述的制造方法，其進一步包括: 使類胡蘿卜素從得到的類胡蘿卜素提取液中析出，并對得到的析出物進行固液分離而使其成為粉末組合物的工序。
9.根據權利要求8所述的制造方法，其中，得到的粉末組合物中的蝦青素含量為20~80重量％。
10.類胡蘿卜素組合物，其含有蝦青素，所述蝦青素在粉末X射線衍射中，于衍射角 13.3° (2 0 ±0.2° )、13.8 ° (2 0 ±0.2° )、14.3° (2 0 ±0.2 ° )、15.8 ° (2 0 ±0.2 ° )、16.3 ° (2 0 ±0.2 ° )、18.2 ° (2 0 ±0.2 ° )、20.5° (2 0 ±0.2° )、24.8° (2 0 ±0.2° )以及 25.3。(2 0 ±0.2° )處有峰，并且具有(3R、3’ R)的化學結構。
11.根據權利要求10所述的類胡蘿卜素組合物，其為卡爾粉體流動特性指數在60以上的粉體。
12.根據權利要求10或11所述的類胡蘿卜素組合物，其中，組合物中的蝦青素含量為20~80重量％。
13.類胡蘿卜素組合物，其為油狀組合物，其含有法夫酵母屬酵母來源的蝦青素，并且組合物中的麥角固醇含量相對于蝦青素含量的比率為40重量％以下。
14.根據權利要求13所述的類胡蘿卜素組合物，其中，蝦青素含量為I~20重量％，并且所述組合物在30°C、剪切速度100s—1時的粘度為0.01~IPa ? S。
【文檔編號】C12P23/00GK103649328SQ201280031844
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年6月29日 優先權日:2011年6月30日
【發明者】金谷健登, 木下浩一, 平野優 申請人:株式會社鐘化