重建頭皮模型和篩選活性分子的方法
【專利摘要】本發明涉及重建頭皮模型、其制備方法及其用于評估化妝品、藥品或皮膚病局部產品的效果的用途。本發明的重建頭皮也可用于制備旨在治療頭皮皮膚癥狀的移植物。
【專利說明】重建頭皮模型和篩選活性分子的方法
[0001]本發明涉及重建頭皮模型、其制備方法及其用于評估化妝品、藥品或皮膚病局部產品的效果的用途。
[0002]根據本發明的重建頭皮也可用于制備要移植到哺乳動物上，更特別移植到人類患者如遭受三度燒傷患者上的移植物。
[0003]近年來已開發出或多或少類似于人皮膚的重建皮膚模型。可提及的重建皮膚模型的實例包括下列文獻中描述的模型:EP O 285 471、EP O 285 474、EP O 418 035、WO90/02796、WO 91/16010、EP O 197 090、EP O 020 753、FR 2 665 175、FR 2 689 904。這些模型首先使為更好地理解皮膚在機械學領域和生理學領域中的作用所進行的必需的研究成為可能，其次構成化妝品和/或藥品活性劑的活性或局部成分的副作用的預測試驗。
[0004] 申請人:已經觀察到，這些模型適用于涉及人體皮膚的研究，但它們對涉及特殊皮膚一頭皮的研究不理想。就 申請人:所知，迄今尚未提出過重建頭皮模型。
[0005]頭皮是位于頭發下，即覆蓋顱骨的皮膚部分。在成年人中，其面積為650至700平方厘米的范圍。其具有常規結構，但有幾個重要特征使其有別于人體其它部位的皮膚:
-由于這些細胞的更快速更新，其表皮更厚，
-其角質層更厚但無序，
-由于它們的更大量存在(大約200至300個毛囊/平方厘米)，其毛囊的活性更大，
-其皮脂腺的產出旺盛且其汗腺的活性高，這允許大量細菌和真菌在其中定殖。
[0006]一般而言，由于這些`細胞的易生產性，上述文獻中描述的重建皮膚模型由真皮乳頭或結締組織鞘的成纖維細胞和/或取自外上皮鞘(也稱作0RS，即外根鞘)的細胞制成。具體而言，在拔出頭發時這些細胞被取出，并在將它們置于載體，通常真皮等價物上并在合適的培養基中培養時能制造表皮。但是，通過培養真皮乳頭細胞而得的組織表現出與在體頭皮不符的大分子(尤其是膠原)表達。通過培養ORS細胞而得的組織也沒有頭皮的特征。此外，沒有觀察到在在體頭皮上發生的正常脫屑現象，因為ORS細胞從未與空氣接觸，它們不會脫屑。由此獲得的模型因此不能用于體外再現頭皮屑的出現。最后，使用這些各種細胞獲得的表皮和真皮的大小和形態與頭皮的表皮和真皮不同:在頭皮的情況下，真皮比皮膚的情況中更厚和更內陷(invaginated)。
[0007] 申請人:已經證實，令人驚訝地，濾泡間頭皮細胞的培養使得開發具有在體頭皮的大部分特征的重建頭皮模型。
[0008]這種頭皮模型的一個特征是在最終基底上層中，即在表皮的顆粒層中表達內披蛋白和角蛋白KlO (尤其見圖1)。顆粒層的細胞位于肩 廣下方。顆粒層(或
由三層具有致密的橢圓形核的扁平角質形成細胞形成。在由“拔除(lifting)”過程中所取的樣品獲得的頭皮切片上發現內披蛋白和角蛋白KlO的遲發性表達，而在重建皮膚的切片中，在基底上層各處，即在馬爾皮基粘液物質(其構成棘層)層的細胞中觀察到這些標記物的表達。這表明根據本發明的頭皮模型具有在體頭皮的特性。
[0009]這些特征使得特別區分根據本發明的方法獲得的頭皮模型與標準重建皮膚模型成為可能。[0010]因此， 申請人:已經開發出制備頭皮等價物的新穎方法。
[0011] 申請人:分離濾泡間頭皮細胞并有意使用它們開發頭皮等價物。
[0012]術語“頭皮等價物”——在下文中也被稱作頭皮模型，是指鋪在頭皮真皮等價物上的頭皮表皮等價物的組裝物。這是經由技術方法體外制造的結構。
[0013]本發明因此涉及制備頭皮等價物的方法，包括接種步驟和在真皮等價物上培養濾泡間頭皮角質形成細胞的步驟，所述真皮等價物包含膠原和濾泡間頭皮成纖維細胞。
[0014]可以根據各種方法，例如文獻EP O 418 035、WO 00/29553或EP O 285 471中描述的那些制備真皮等價物，小心使用上述成纖維細胞。
[0015]可提到的真皮等價物包括膠原/成纖維細胞混合網架、已預先去表皮化的真皮、人工膜，例如Millipore牌過濾器，基于膠原的皮下基質、塑料、或與細胞生活力相容的任何其它載體。本發明的真皮等價物優選是膠原網架或膠原海綿形式。
[0016]術語“膠原網架”是現有技術中公知的(Bell等人1979，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.76，N0.3，第1274-1278頁)，其表示已使用數十年的已知真皮等價物模型。
[0017]優選地，根據本發明，根據Asselineau 等人，1987 (Models in dermat0., vol.1ll,Ed Lowe & Maibach, 1-7)介紹的方法制備該網架。
[0018]術語“膠原海綿”也是本領域技術人員已知的。其是指基于膠原的生物聚合物(例如:BASF Beauty Care 出售的 Mimedisk?)。
[0019]根據本發明，膠原可以是任何來源的任何類型的膠原。就此而言，參考Van derRest 和 Garonne 的，1990，Biochem., vol.72, 473-484 或 1991，Faseb Journal, vol.5，2814-2823的綜述中提到的各種類型的膠原。因 此，根據本發明，該膠原優選選自1、III或V類型的纖維膠原。
[0020]優選地，根據本發明，使用動物來源的膠原，特別是牛源膠原。
[0021]根據本發明優選使用的膠原是I型膠原。根據本發明最優選使用牛I型膠原。
[0022]無需說，根據本發明，可以使用任何比例和/或不同來源的不同類型膠原的混合物。
[0023]優選地，該真皮等價物是收縮膠原網架，并優選在該網架收縮2至6天后，更優選在3至5天后，再更優選在3天后進行角質形成細胞接種。膠原凝膠的收縮優選歸因于濾泡間頭皮成纖維細胞對膠原的作用。
[0024]濾泡間頭皮成纖維細胞和/或角質形成細胞優選分別從獲自頭皮樣品的真皮和表皮中分離。在一個優選實施方案中，已預先從這種樣品中除去外上皮鞘的角質形成細胞，例如通過脫除所述樣品上的毛發。例如使用鑷子拔除頭皮樣品上的毛發以從樣品上完全除去外上皮鞘的角質形成細胞。
[0025]優選經由下列步驟獲得濾泡間頭皮角質形成細胞:
-通過頭皮樣品的蛋白水解處理，特別通過使頭皮樣品與分散酶或嗜熱菌蛋白酶接觸，將頭發真皮與表皮分離，
-回收頭皮表皮，
-使由此獲得的頭皮表皮與胰蛋白酶接觸，
-回收濾泡間頭皮角質形成細胞；和 -培養由此獲得的角質形成細胞。[0026]角質形成細胞在接種前根據Rheinwald和Green的技術(Cell, vol.6,331-344，1975)通過在本領域技術人員已知的合適培養基中在生長因子，尤其是氨基酸、血清、霍亂毒素、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸和PH緩沖液存在下在由成纖維細胞構成的營養載體上培養而擴增。特別地，這種培養基尤其可含有至少一種角質形成細胞促有絲分裂生長因子(例如表皮生長因子(EGF)和/或角質形成細胞生長因子(KGF)，特別是KGF)、胰島素、氫化可的松和任選的抗生素(例如:慶大霉素或兩性霉素B)。
[0027]有利地，所述培養基還可包含血清或垂體提取物(例如牛來源)、腎上腺素、轉鐵蛋白和/或非必需氨基酸。
[0028]用于這種培養的成纖維細胞更優選是3T3成纖維細胞。3T3成纖維細胞是本領域技術人員公知的。這是自1962年起就為人所知的一種成纖維細胞系。“3T3”是指“3xl05細胞的3天傳代接種”。
[0029]濾泡間頭皮角質形成細胞的培養優選是與已預先停止增殖(優選通過預先輻照(例如用UV)或通過預先用絲裂霉素處理它們)的成纖維細胞(優選3T3成纖維細胞)的共培養物。絲裂霉素(特別是絲裂霉素C)阻斷這些細胞的增殖，但不阻止它們產生有助于角質形成細胞增殖的營養物質。
[0030]根據另一實施方案，角質形成細胞在接種前通過在已用纖連蛋白(例如“涂有纖連蛋白”的培養箱)或用膠原(例如“涂有I型膠原”的培養箱)處理或增補的培養基上或在富培養基，如Epilife?培養基(Gibco)上培養而擴增。
[0031]分散酶(也稱作中 性蛋白酶)是屬于蛋白酶家族的酶，其具有裂解纖連蛋白和I和IV型膠原的能力。
[0032]優選經由下列步驟獲得濾泡間頭皮角質形成細胞:
-通過頭皮樣品的蛋白水解處理，尤其通過使頭皮樣品與分散酶或嗜熱菌蛋白酶接觸，將頭發真皮與表皮分離，
-回收頭皮真皮，
-使由此獲得的頭皮真皮與膠原酶和/或胰蛋白酶接觸，
-回收濾泡間頭皮成纖維細胞；和 -培養由此獲得的成纖維細胞。
[0033]清楚理解的是，上文提到的酶以本領域技術人員已知的能使它們實現所需作用的濃度使用。其優選是用于將頭皮真皮與表皮分離的分散酶。胰蛋白酶(Gibco)可以由頭皮表皮獲得濾泡間頭皮角質形成細胞的懸浮液。膠原酶(Boehringer)和/或胰蛋白酶可以由頭皮真皮獲得濾泡間頭皮成纖維細胞的懸浮液。
[0034]優選通過過濾經由胰蛋白酶或膠原酶的作用獲得的懸浮液、接著在本領域技術人員已知的條件下離心和再懸浮離心團塊來進行濾泡間頭皮角質形成細胞或成纖維細胞的回收。
[0035]更特別地，本發明的方法包括:
a-用濾泡間頭皮角質形成細胞接種位于浸在培養基中的載體上的膠原網架； b-使濾泡間頭皮角質形成細胞在所述膠原網架表面增殖；
C-升高所述載體以使培養基在生產過程中不覆蓋表皮等價物的上表面。
[0036]該載體特別是載體格柵。[0037]特別通過用濾泡間頭皮成纖維細胞接種培養基、接著添加膠原而獲得本發明的真皮等價物。
[0038]本發明的方法可包含下列培養步驟:
a)例如從在接種了動物或人組織碎片的營養培養基上生成的單層培養物中收取收縮細胞，
b)使用補充了真皮細胞外基質的組分，特別是膠原的營養培養基，
所述混合物形成凝膠，其收縮，排出營養培養基，從而形成真皮等價物，特別是收縮膠原網架。
[0039]通過受控胰蛋白酶化或通過使用膠原酶，獲自健康人類供體并從單層培養物中收取的濾泡間頭皮成纖維細胞將用作收縮細胞。
[0040]根據本發明的制備方法的實施包括用濾泡間頭皮角質形成細胞接種真皮等價物或真皮基質。
[0041]保持能在所述基質表面增殖角質形成細胞的條件，使用與所述角質形成細胞接觸的至少一種最低營養培養基 ，優選如實施例1中介紹的3F培養基促進這種濾泡間頭皮角質形成細胞培養物的生長。
[0042]有利地，在基質上接種角質形成細胞后，通過浸在覆蓋角質形成細胞的這種營養培養基中，將植入的基質保持優選5至7天。
[0043]接下來，使該真皮等價物與空氣接觸。為此，將其置于相對于容器底升高的載體格柵上，并調節營養培養基的水平以剛好覆蓋載體格柵但該營養培養基在生產過程中不覆蓋皮膚等價物的上表面。
[0044]根據本發明的方法，接種了濾泡間頭皮角質形成細胞的收縮真皮等價物因此優選通過浸在培養基中培養5至7天，接著在合適的載體上露出5至7天。
[0045]由此構造的根據本發明的頭皮等價物充分分化和有序。其也總體均勻。
[0046]根據本發明的方法的一個變體，通過將選自真皮乳頭的成纖維細胞和/或結締組織鞘的成纖維細胞和/或完整真皮乳頭和/或結締組織鞘和/或結締組織鞘片段的毛發成纖維細胞植入已收縮或在收縮過程中的所述真皮頭皮等價物中(特別植入膠原網架中)，可以獲得包含毛發的頭皮等價物。這可以例如使用注射器實施。在濾泡間成纖維細胞已開始它們對膠原的作用后加入這些毛發成纖維細胞、完整真皮乳頭、結締組織鞘和/或結締組織鞘片段。它們的添加因此不與濾泡間頭皮成纖維細胞同時進行。毛發成纖維細胞優選以1000至10 000個細胞量添加，即每100個濾泡間頭皮成纖維細胞大約I至10個毛發成纖維細胞的比例。
[0047]通過將毛發成纖維細胞，如乳頭成纖維細胞或結締組織鞘的成纖維細胞或完整乳頭或結締組織鞘或結締組織鞘片段植入真皮等價物中，角質形成細胞會再現體毛或頭發(hair stalk (毛梗))的形態發生(Reynolds A.J., Lawrence C.Μ., Jahoda C.A., Humanhair follicle germinative epidermal cell culture.J.1nvest.Dermatol.1993Oct.:101 (4): 634-8) o
[0048]本發明的另一主題是可通過本發明的方法獲得的頭皮等價物。
[0049]這種頭皮等價物在其顆粒層中表達內披蛋白和/或角蛋白K10，這是與在體頭皮相當的表達。術語“相當的表達”是指在位于與在體組織中相同位置的細胞中和/或以相同強度發生的編碼這些蛋白質的基因的表達。
[0050]考慮到該頭皮等價物具有在體頭皮的特征，其可以以與取自待治療個體的頸背或枕骨區的移植物相同的方式同樣成功地移植。例如Bouhanna等人(Dermatol.Surg.;Nov.2003, 29(11)，1130-4)介紹了自體移植技術。在移植后，根據本發明的頭皮等價物因此具有適當替代原始頭皮部分的能力。
[0051]該頭皮等價物也可用于制備旨在治療頭皮皮膚癥狀，如燒傷、愈合缺陷或灰發癥并因此要移植到哺乳動物上，更特別移植到人類患者，如遭受三度燒傷患者上的移植物。移植物定義為要移植的組織部分。
[0052]因此，本發明的另一主題涉及如上定義的頭皮等價物，其用于治療上文提到的頭皮皮膚癥狀之一。這種頭皮等價物或移植物在內披蛋白和角蛋白KlO的表達方面具有與在體頭皮相當的特征(即在表皮的最終顆粒層中表達內披蛋白和角蛋白K10)。本發明因此還涉及如上所述的頭皮等價物用于制造治療這些頭皮皮膚癥狀之一用的移植物的用途。
[0053]無論用于其制備的工藝如何變化，所得到的頭皮等價物是可用作需要動物實驗的任何試驗(例如關于活性劑的釋放、它們的經皮滲透和/或它們的吸收和/或它們的生物利用度的研究，或關于活性劑和/或化妝品、藥品或皮膚病學成分的耐受度、相容性或效力的研究)的替代試驗的三維模型。
[0054]因此，本發明的另一主題是如上所述的頭皮等價物用于測試化合物在頭皮上的經皮滲透和/或吸收和/或生物利用度和/或效力和/或用于測試頭皮對化合物的耐受度和/或相容性的用途。
[0055]這一用途因此使得看出化合物是否滲入頭皮的各種層或是否確實具有所需效果成為可能。
[0056]這種頭皮等價物尤其可用于鑒別作為毛發生長調節劑的化合物和/或作用于頭皮的質量和體內平衡，尤其作用于頭皮脫屑、治療頭皮屑或敏感頭皮的分子。
[0057]此外，其能用于尋找與頭皮的正常或病理狀態相關的生物標記。另一優點在于有可能研究毛囊、汗腺或皮脂腺的工作以更接近在體頭皮。
[0058]這一模型是通過注射干細胞誘發毛發形成所必需的。
[0059]根據本發明的重建頭皮模型能夠量化能由干細胞(例如由球部細胞)誘發毛發形成的分子的活性。
[0060]包含毛囊的頭皮等價物尤其能夠實施體毛或頭發生長動力學并因此能用于需要許多在體內環境中盡可能完整的真發(live hairs)的任何研究，如毛發周期的研究和能影響這一周期的因素的研究，以及促進毛發生長的活性劑、抗脫發的活性劑或減慢毛發生長的活性劑的研究。
[0061]用于鑒定新穎活性劑的產品篩選法包括步驟(a)使所述受試產品與根據本發明的頭皮等價物接觸，然后步驟(b)分析所述產品對頭皮等價物的至少一個參數的作用和步驟(c)選擇改進所述參數的產品。
[0062]優選地，為了實施步驟(a)，局部施加受試產品，例如配制成標準局部制劑或引入
培養基中。
[0063]頭皮等價物的參數優選選自預先選擇的標記物在該頭皮等價物中的表達、生成和/或活性和/或頭皮等價物的脫屑。[0064]可特別通過分析與頭皮的質量和/或體內平衡相關的標記物，例如表皮和/或真皮標記物，如結構蛋白，尤其是表皮分化蛋白和真皮基質的大分子蛋白的表達、生成和/或活性來進行步驟(b)。可提到的結構蛋白的實例是毛發角蛋白。
[0065]與頭皮的質量和/或體內平衡相關的這些標記物可以是頭皮脫屑、頭皮屑狀況或敏感頭皮的代表。
[0066]當本發明的頭皮模型包含已如上所述植入真皮等價物中的毛發成纖維細胞，如乳頭成纖維細胞或結締組織鞘的或完整乳頭或結締組織鞘成纖維細胞或結締組織鞘片段時，該篩選試驗也旨在鑒別能誘發毛梗生長的產品。
[0067]為此，該篩選法的步驟(b)分析對毛梗生長的作用。
[0068]當根據本發明的頭皮模型包含免疫系統的細胞，如朗格漢斯細胞時，該篩選試驗還旨在鑒別能誘發刺激或過敏反應的產品。
[0069]為此，該篩選法的步驟(b)分析產品對至少一個參數的作用，所述參數優選選自: -細胞毒性；
-炎癥介質的釋放； -通過組織學或通過乳酸脫氫酶(角質形成細胞膜完整性的標記物)的釋放揭示的細胞損傷(Roguet 等人，J.Tox.1n vitro 6:303 (1992)和 Ponec M in In VitroToxicology.Eds Rougier, Maibach 和 Golberg p.107, 1994)；
-皮膚脂質，特別是神經酰胺和磷脂的合成和組成的改變(JID 86，598 (1986))；
-作為其分化的標記的上皮細胞的分層(M.Prunieras和R.Roguet Toxicologiecellulaire in vitro methodes et applications, Eds M.Adolphe, A.Guillouzo和F.Marano, INSERM 1995 出版，第 191-236 頁)(Duffy P.A., Flint 0.P.:1n vitro dermalirritancy test.1n C.K.Atterwill 和 C.E.Steele (Eds):1n vitro methods inToxicology, Cambridge Univ.Press Cambridge 1987,第 279-297 頁)(Use of skincell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy,Roguet, Cell Biology and Toxicology, 1999:15， 63-75)。
[0070]分析產品作用的步驟(b)優選是在與受試產品接觸的頭皮等價物上測得的至少一個參數與在對照頭皮等價物(其在相同條件下培養但沒有接受受試產品)上測得的那些參數的比較。
[0071]選擇改進頭皮等價物的參數的產品的步驟(C)根據預先確定的標準的函數進行。
[0072]這種參數的改進可以是刺激、降低或完全或部分抑制所述標記物的表達、生成和/或活性和/或毛梗的生長和/或頭皮等價物的脫屑。
[0073]選擇所述產品的標準是例如這種產品對測量參數具有刺激或抑制作用。
[0074]本發明的頭皮等價物也可用于化妝品、藥品或皮膚病學化合物的自動篩選法以鑒別新穎活性劑。
[0075]圖1更清楚圖解本發明，但不限制其范圍。
[0076]在該圖中，照片顯示使用抗內披蛋白抗體(1)和抗-KlO抗體(II)免疫標記后的重建皮膚(皮膚等價物)(A)、根據本發明的頭皮等價物(B)和頭皮樣品(C)的切片。
[0077]下面給出的實施例代表本發明非限制性的示例。
[0078]實施例1 -頭皮模型的制備從拉皮手術過程中收集的頭皮樣品(因此獲自相對成熟的女性)或從獲自相對年輕男性的頭皮樣品中分離濾泡間頭皮角質形成細胞和成纖維細胞。
[0079] 為了分離這些頭皮細胞，實施脫毛以除去外上皮鞘的角質形成細胞，然后將真皮與表皮分離以提取兩種目標細胞群，即濾泡間成纖維細胞和角質形成細胞。
[0080] 實驗方案:
除非另行指明，在 Bell 等人 1979 (P.N.A.S.USA, 76，1274-1278)，Asselineau 和Prunieras, 1984, (British J.0f Derm., 111, 219-222)或 Asselineau 等人，1987，(Models in dermat0., vol.1ll, Ed.Lowe 和 Maibach, 1-7)中描述了實施例中使用的
所有培養基和緩沖液。
[0081] 培養基MEM + 10% FCS + 3F (被稱作3F培養基)具有下列組成:
【權利要求】
1.制備頭皮等價物的方法，其特征在于在真皮等價物上接種和培養濾泡間頭皮角質形成細胞，所述真皮等價物包含膠原和濾泡間頭皮成纖維細胞。
2.根據前一權利要求的方法，其特征在于該真皮等價物是收縮膠原網架且在所述網架收縮2至5天后進行角質形成細胞接種。
3.根據前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述濾泡間頭皮成纖維細胞和角質形成細胞分別從獲自頭皮樣品的真皮和表皮中分離。
4.根據前一權利要求的方法，其特征在于所述濾泡間頭皮角質形成細胞獲自已預先從中除去外上皮鞘的角質形成細胞的頭皮樣品。
5.根據權利要求3或4的方法，其特征在于經由下列步驟獲得該濾泡間頭皮角質形成細胞: -通過頭皮樣品的蛋白水解處理，將頭皮真皮與表皮分離， -回收頭皮表皮， -使由此獲得的頭皮表皮與胰蛋白酶接觸， -回收濾泡間頭皮角質形成細胞；和 -培養由此獲得的角質形成細胞。
6.根據前一權利要求的方法，其特征在于所該角質形成細胞培養物是與預先用絲裂霉素處理或輻照的成纖維細胞的共培養物或在補充了纖連蛋白或膠原的培養基上的培養物。
7.根據權利要求3的方法，其特征在于經由下列步驟獲得該濾泡間頭皮成纖維細胞: -通過頭皮樣品的蛋白水解處理，`將頭皮真皮與表皮分離， -回收頭皮真皮， -使由此獲得的頭皮真皮與膠原酶和/或胰蛋白酶接觸， -回收濾泡間頭皮成纖維細胞；和 -培養由此獲得的成纖維細胞。
8.根據前述權利要求任一項的方法，其特征在于接種了濾泡間頭皮角質形成細胞的收縮真皮等價物通過浸在培養基中培養5至7天，接著在合適的載體上露出5至7天。
9.根據前述權利要求任一項的方法，其特征在于其包括步驟:將選自真皮乳頭的成纖維細胞和/或結締組織鞘的成纖維細胞的毛發成纖維細胞，和/或完整真皮乳頭和/或結締組織鞘和/或結締組織鞘片段植入已收縮或在收縮過程中的所述真皮等價物中。
10.頭皮等價物，其特征在于其在其顆粒層中展現出內披蛋白和/或角蛋白KlO的表達。
11.通過根據權利要求1至9任一項的方法獲得的頭皮等價物。
12.根據前一權利要求的頭皮等價物，其特征在于其在其顆粒層中展現出內披蛋白和/或角蛋白KlO的表達。
13.如權利要求10至12任一項所述的頭皮等價物，其用于治療頭皮皮膚癥狀。
14.根據前一權利要求使用的頭皮等價物，其特征在于所述皮膚癥狀是頭皮燒傷。
15.根據權利要求10至12任一項的頭皮等價物用于測試化合物在頭皮上的經皮滲透和/或吸收和/或生物利用度和/或效力的用途。
16.用于鑒別新穎活性劑的產品篩選法，其包括步驟(a)使所述受試產品與根據權利要求10至12任一項的頭皮等價物接觸，然后步驟(b)分析所述產品對頭皮等價物的至少一個參數的作用和步驟(c)選擇改變所述參數的產品。
【文檔編號】C12N5/071GK103764816SQ201280026055
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年5月30日 優先權日:2011年5月30日
【發明者】K.巴卡 申請人:萊雅公司