用于蛋白質分泌和木質纖維素降解的突變細胞的制作方法

用于蛋白質分泌和木質纖維素降解的突變細胞的制作方法
【專利摘要】本發明提供用于分泌蛋白質和用于降解木質纖維素類生物質的突變細胞。還提供利用這些細胞的方法。具體地，公開了真菌和酵母細胞中，β-葡萄糖苷酶和代謝阻遏基因creA/cre-1的組合型基因缺失在蛋白分泌中的利用。
【專利說明】用于蛋白質分泌和木質纖維素降解的突變細胞
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月15日提交的美國臨時申請61/453，086的權益，其全部內容通過參考引入此處。
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【技術領域】
[0005]本發明涉及用于產生蛋白質，比如纖維素酶，和用于降解木質纖維素類生物質的突變細胞。具體地，提供用于產生蛋白質，比如纖維素酶，的突變細胞和方法。
【背景技術】
[0006]木質纖維素類生物質是用于生物燃料生產的、豐富的和可再生的原料。然而，將不溶性的木質纖維素類生物質初始轉化為可透過細胞的和便于發酵的糖在生物燃料生產過程中存在重大的技術挑戰和主要瓶頸。因此，需要改善方法，解鎖木質纖維素類生物質作為多用途能源的全部潛力，來克服該瓶頸。
[0007]生物質的自然降解是通過真菌微生物分泌的木質纖維素降解酶實現的。例如，在新近燒焦的植物中，經常發現野生的絲狀真菌和實驗室模型生物粗糙脈孢菌(N.crassa),其分泌纖維素酶，并由此引發植物細胞壁的解聚作用。基于它們在木質纖維素降解中的天然角色，絲狀真菌及其木質纖維素降解酶作為生物技術生產過程中的生物質降解的催化劑具有很大的潛力。
[0008]但是，鑒于在絲狀真菌中纖維素酶的分泌是通過不溶性植物細胞壁成分，如纖維素，半纖維素，和木聚糖有效誘導的，可溶性誘導劑是不太有效的。例如，纖維二糖，作為纖維素酶的主要的可溶性最終產品，能夠在若干種絲狀真菌，包括紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)(里氏木霉(Trichoderma reesei ) ;T.reesei )和曲霉(黑曲霉，構巢曲霉，米曲霉)中誘導纖維素酶，但其誘導水平遠低于纖維素本身。然而，不溶性誘導劑存在的一個問題是，纖維素酶能粘住不溶性誘導劑，導致分泌的酶活性的產量減少。
[0009]不溶性生物質的處理是異質加工并且進入生物質表面受真菌細胞的限制。因此，在豐富的真菌培養中，由于缺乏與產生誘導作用的植物表面的接觸，大量的細胞將是自由浮動的，并且不分泌高水平的活化纖維素酶。為了在這種細胞懸浮液中優化蛋白質，包括纖維素酶，的生產并因此促進生物質的降解，需要這樣的細胞系統:在用可溶性小分子，比如纖維糊精，誘導后，分泌高水平的活性蛋白。

【發明內容】

[0010]在此提供用于增加蛋白的分泌和用于木質纖維素類生物質的降解的突變細胞。也提供使用在此描述的突變細胞增加蛋白質的分泌和降解木質纖維素類生物質的方法。此外，本發明至少一部分是基于意外發現在絲狀真菌，如粗糙脈孢菌中，突變型β-葡萄糖苷酶基因和/或分解代謝物阻遏基因cre-Ι，導致被纖維素類生物質，比如纖維二糖誘導時，增加蛋白質的分泌。不希望受限于理論，應該認為β -葡萄糖苷酶基因的活性和cre-Ι參與蛋白質的轉錄調控(圖1)。
[0011]因此，本發明的一個方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供突變細胞，該突變細胞在兩種或更多種β -葡萄糖苷酶基因中含有失活性突變；以及(b)將該突變細胞與纖維素類生物質接觸，該纖維素類生物質誘導該突變細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，該突變細胞在細胞的cre-Ι基因中進一步含有失活性突變。本發明的另一方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供突變細胞，該突變細胞在細胞的cre-Ι基因中含有失活性突變；以及(b)將該突變細胞與纖維素類生物質接觸，該纖維素類生物質誘導該突變細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，該突變細胞在兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中進一步含有失活性突變。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。
[0012]因此，本發明的一個方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供突變細胞，該突變細胞在兩種或更多種β -葡萄糖苷酶基因中含有失活性突變；以及(b)將該突變細胞與糖類接觸，該糖類誘導該突變細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，該突變細胞進一步在細胞的cre-Ι基因中含有失活性突變。本發明的另一方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供突變細胞，該突變細胞在細胞的cre-Ι基因中含有失活性突變；以及(b)將該突變細胞與糖類接觸，該糖類誘導該突變細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，該突變細胞在兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中進一步含有失活性突變。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精 ，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類為纖維二糖。
[0013]在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白為纖維素酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該突變細胞在至少一種β -甘露糖苷酶基因中進一步含有失活性突變。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該突變細胞在至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中進一步含有失活性突變。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該失活性突變為缺失。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為重組細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為真菌或酵母細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為真菌或酵母細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞選自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)細胞、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)細胞、里氏木霉(Trichoderma reesei )細胞、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)細胞、嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila))細胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)細胞、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)細胞、灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)細胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細胞、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)細胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)細胞、褐腐菌(Postia placenta)細胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)細胞和解纖維頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為四種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該三種或更多種葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種甘露糖苷酶基因為NCU00890。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。
[0014]本發明的另一個方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供重組細胞，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞顯示了該至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降；以及(b)將該重組細胞與纖維素類生物質接觸，該纖維素類生物質誘導該重組細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，該重組細胞進一步顯示了 cre-Ι基因的表達下降。本發明的另一方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供重組細胞，與相應非重組細胞中cre-Ι基 因的表達相比，該重組細胞顯示了 cre-Ι基因的表達下降；以及(b)將該重組細胞與纖維素類生物質接觸，該纖維素類生物質誘導該重組細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞進一步顯示了該至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。
[0015]本發明的另一個方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供重組細胞，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞顯示了該至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降；以及(b)將該重組細胞與糖類接觸，該糖類誘導該重組細胞分泌蛋白 質。在某些實施例中，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，該重組細胞進一步顯示了 cre-Ι基因的表達下降。本發明的另一方面提供一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，通過:(a)提供重組細胞，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，該重組細胞顯示了 cre-Ι基因的表達下降；以及(b)將該重組細胞與糖類接觸，該糖類誘導該重組細胞分泌蛋白質。在某些實施例中，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞進一步顯示了該至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類為纖維二糖。
[0016]在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白為纖維素酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，creA/cre-Ι的功能通過使顯性失活突變(dominantnegative mutant)或蛋白抑制劑過表達降低。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，與相應非重組細胞中至少一種甘露糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞進一步顯示了該至少一種β_甘露糖苷酶基因的表達下降。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，與相應非重組細胞中磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達相比，該重組細胞進一步顯示了該磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達下降。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低基因表達。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為四種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該三種或更多種葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種甘露糖苷酶基因為NCU00890。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。在可以與之前的實施例結合的某 些實施例中，該細胞為穩定細胞系或瞬時轉染的細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為真菌或酵母細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞選自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)細胞、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)細胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)細胞、嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila))細胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)細胞、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)細胞、灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)細胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細胞、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)細胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)細胞、褐腐菌(Postia placenta)細胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)細胞和解纖維頂抱霉(Acremonium cellulolyticus)細胞。
[0017]本發明的另一個方面提供在兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中含有失活性突變的突變細胞，其中比起在兩種或更多種β -葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在一些實施例中，該突變細胞在細胞cre-Ι基因中進一步含有失活性突變，其中比起在cre-Ι基因中缺乏所述突變的相應細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該突變細胞在至少一種甘露糖苷酶基因中進一步含有失活性突變，其中比起在至少一種β -甘露糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該突變細胞在至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中進一步含有失活性突變，其中比起在至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中缺乏所述突變的相應細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。
[0018]本發明的另一個方面提供在兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中含有失活性突變的突變細胞，其中比起在兩種或更多種β -葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在一些實施例中，該突變細胞在細胞cre-Ι基因中進一步含有失活性突變，其中比起在cre-Ι基因中缺乏所述突變的相應細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。 在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該突變細胞在至少一種β_甘露糖苷酶基因中進一步含有失活性突變，其中比起在至少一種β_甘露糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該突變細胞在至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中進一步含有失活性突變，其中比起在至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中缺乏所述突變的相應細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類為纖維二糖。
[0019]在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶 、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白為纖維素酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該失活性突變為缺失。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為重組細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為真菌或酵母細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞選自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)細胞、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)細胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)細胞、嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila))細胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)細胞、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)細胞、灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)細胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細胞、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)細胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)細胞、褐腐菌(Postia placenta)細胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)細胞和解纖維頂抱霉(Acremoniumcellulolyticus)細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為四種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該三種或更多種β_葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種β-甘露糖苷酶基因為NCU00890。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。
[0020]本發明的另一個方面提供重組細胞，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞顯示了該至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起至少兩種β -葡萄糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在某些實施例中，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，該細胞進一步顯示了cre-Ι基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起cre-Ι基因表達不下降的相應非重組細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在某些實施例中，creA/cre-Ι的功能通過顯性失活突變或蛋白抑制劑的過表達而降低，其中比起顯性失活突變沒有過表達的相應細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，與相應非重組細胞中至少一種甘露糖苷酶基因的表達相比，該細胞顯示了該至少一種甘露糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起至少一種β -甘露糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，與相應非重組細胞中至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達相比，該細胞進一步顯示了至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達不下降的非重組細胞，纖維素類生物質誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。[0021]本發明的另一個方面提供重組細胞，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞顯示了該至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起至少兩種β -葡萄糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在某些實施例中，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，該細胞顯示了 cre-Ι基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起cre-Ι基因表達不下降的相應非重組細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在某些實施例中，creA/cre-Ι的功能通過使顯性失活突變或蛋白抑制劑過表達降低，其中比起顯性失活突變沒有過表達的相應細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，與相應非重組細胞中至少一種甘露糖苷酶基因的表達相比，該細胞顯示了該至少一種β_甘露糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起至少一種β -甘露糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，與相應非重組細胞中至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達相比，該細胞進一步顯示了至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉默降低該表達，并且其中比起該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達不下降的非重組細胞，糖類誘導該細胞分泌更高水平的蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類為纖維二糖。
[0022]在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白為纖維素酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種β -葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為四種或更多種β-葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為五種或更多種β-葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為六種或更多種β-葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為七種或更多種β-葡萄糖苷酶基因。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該三種或更多種β-葡萄糖苷酶基因、四種或更多種β-葡萄糖苷酶基因、五種或更多種β-葡萄糖苷酶基因、六種或更多種β-葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，至少一種葡萄糖苷酶基因編碼胞外β_葡萄糖苷酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種β_甘露糖苷酶基因為NCU00890。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為穩定細胞系或瞬時轉染的細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為真菌或酵母細胞。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該細胞選自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)細胞、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)細胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)細胞、嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila))細胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)細胞、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)細胞、灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)細胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細胞、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)細胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)細胞、褐腐菌(Postia placenta)細胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)細胞和解纖維頂抱霉(Acremoniumcellulolyticus)細胞。
[0023]本發明的另一 方面涉及一種降解生物質的方法，通過:(a)提供木質纖維素類生物質；(b)提供之前的任何實施例中的細胞，或在cre-Ι基因中含有失活性突變的細胞；(c)通過用纖維素類生物質接觸該細胞誘導該細胞分泌蛋白；以及(d)用木質纖維素類生物質接觸誘導的細胞，其中分泌的蛋白降解木質纖維素類生物質。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。本發明的另一方面涉及一種降解生物質的方法，通過:(a)提供木質纖維素類生物質；(b)提供之前的任何實施例中的細胞，或在cre-Ι基因中含有失活性突變的細胞；(C)通過用糖類接觸該細胞誘導該細胞分泌蛋白；以及(d)用木質纖維素類生物質接觸誘導的細胞，其中分泌的蛋白降解木質纖維素類生物質。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該糖類為纖維二糖。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白為纖維素酶。在可以與之前的實施例結合的某些實施例中，該分泌蛋白由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCUO7190, NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1展示了粗糙脈胞菌的β-葡萄糖苷酶缺失菌株中纖維素酶的轉錄調節模型。需要轉錄去抑制和特異性誘導來實現纖維素酶基因表達的轉錄激活的最大化。箭頭表明纖維素代謝物的可能途徑。藍線表示被認為是A3i3G和Λ3β GAcre缺失菌株中最弱化的途徑；紅線表示被認為是Λ 3 β G和Λ 3 β G Λ cre缺失菌株中最具活性的途徑。
[0025]圖2展示了粗糙脈孢菌中纖維素酶的基因表達時間進程。圖2A展示了纖維二糖水解酶I (cbh-1，NCU07340)的時間進程。圖2B展示了內切葡聚糖酶2 (gh5_l，NCU00762)的時間進程。當用2%蔗糖誘導時，所有基因的表達水平標準化至I。菌株在含有2%蔗糖的基本培養基中生長16小時，接著在含有2% Avkel 'S、的基本培養基中生長4小時。在所有樣品以肌動蛋白(NCU04173)基因表達水平作為內源性對照。每個反應以一式三份進行并且誤差條表不95%置彳目區間。
[0026]圖3展示了在WT、Λ 3 β G和Λ 3 β G Λ ere中用0.2%纖維二糖或l%Aviee?誘導4小時后，選擇的纖維素酶的基因表達。當用1%鹿糖誘導時，cbh-1、gh6_2,和gh5_l的基因表達水平標準化至I。在所有樣品中以肌動蛋白作為內源性對照。每種菌株以一式三份生長并且誤差條表不I標準偏差。
[0027]圖4表不轉移至含有2%鹿糖的基本培養基4小時后，Δ cre_l中纖維素酶纖維二糖水解酶I (cbh-1，NCU07340)和內切葡聚糖酶2 (gh5_l，NCU00762)的基因表達水平。對于用2%蔗糖誘導的野生型，兩種 基因的表達水平標準化至I。肌動蛋白(NCU04173)基因表達水平作為內源性對照。每個反應以一式三份進行并且誤差條表示95%置信區間。
[0028]圖5展示了饑餓狀態下，野生型(WT)、Δ cre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130，和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Acre-1中纖維素酶纖維二糖水解酶I (cbh_l, NCU07340)和內切葡聚糖酶2(gh5-l，NCU00762)的基因表達水平。當用2%蔗糖誘導時，所有基因的表達水平標準化至I。菌株在含有2%蔗糖的基本培養基中生長16小時，接著在沒有添加碳源的基本培養基中生長4小時。在所有的樣品中，肌動蛋白(NCU04173)基因表達水平作為內源性對照。每個反應以一式三份進行并且誤差條表示95%置信區間。
[0029]圖6表示用IOmM或ImM纖維二糖誘導4小時后，纖維素酶纖維二糖水解酶I(cbh-1，NCU07340)和內切葡聚糖酶2(gh5-l，NCU00762)的基因表達水平。圖6A展示了野生型的結果。圖6B展示了 Λ4952Λ8755Λ130缺失突變體的結果。圖6C展示了Λ 4952 Λ 8755 Λ 130 Acre-1缺失突變體的結果。當用2%蔗糖誘導時，所有基因的表達水平標準化至I。菌株在含有2%蔗糖的基本培養基中生長16小時，接著在含有ImM纖維二糖、IOmM纖維二糖，或2%蔗糖的基本培養基中生長4小時。在所有的樣品中，肌動蛋白(NCU04173)基因表達水平作為內 源性對照。每個反應以一式三份進行并且誤差條表示95%置信區間。[0030]圖7概述了用纖維二糖或Avio;_誘導后，WT、Λ3β6，和Λ 3 β G Λ ere菌株中的蛋白質的產量和酶活性。圖7A展示了利用以纖維二糖誘導的Λ3β G的生物反應器中纖維素酶的產量。圖7Β展示了利用以纖維二糖誘導的A3i3GAcre的生物反應器中纖維素酶的產量。圖7C展示了利用以纖維二糖誘導的WT的生物反應器中纖維素酶的產量。圖7D展示了利用在Avkdfe上生長5天的WT的生物反應器中纖維素酶的產量。在用0.2%纖維二糖誘導36小時前，纖維二糖誘導的菌株在含有1%蔗糖的基本培養基中預生長24小時。測量蔗糖、葡萄糖、果糖(按葡萄糖當量，三角形)、纖維二糖(圓)、蛋白質產量(正方形)，和生物質累積量(菱形)的濃度。圖7E展示了來自7A、7B，和7D的24小時誘導的上清液對Avkd?酌活性。比較用纖維二糖誘導24小時的A3i3G(正方形)和Λ3β GAcre (三角形)的培養物上清液與在AviceW上生長5天的WT (菱形)的培養物上清液的纖維素酶活性。誤差條為I標準偏差。圖7F展示了來自7Α和7Β中生物反應器培養物上清液的Azo-CMC (內切葡聚糖酶)活性的時間進程。Azo-CMC活性表示為在2%Avkel?上生長5天的WT培養物上清液的活性的百分比。
[0031]圖8 比較來自野生型(WT)、Acre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130,和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Δ cre-Ι的培養物濾液的MuLac活性(纖維二糖水解酶I)。圖8A展示了以在AvkeWD上生長4天后的野生型在Avicel?上的活性的百分比表示的MuLac活性。圖8B展示了以μ g純化的重組Cbh-1當量表示的MuLac活性。菌株在2%鹿糖生長16小時，接著在2%蔗糖、2%纖維二糖，或2%Avied?中生長4天，并且取時間點2天和4天。用4_甲基傘形酮基-β -D-纖維二糖糖苷(4-MethylumbelIiferyl-β -D_cellobioside,MuLac)試驗測量培養物上清液中外切葡聚糖酶活性。
[0032]圖9 比較來自野生型(WT)、Acre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130,和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Acre-1的培養物濾液中的Αζο-CM-纖維素活性(內切_1，4_β-葡聚糖酶)。菌株在1%蔗糖生長24小時，接著在2%蔗糖、l%Avicel?,或2%纖維二糖中生長4天。以4天后野生型在Avice?上的活性的百分比表示內切-1，4- β -葡聚糖酶活性。注意，沒有展示蔗糖培養物的數據，因為不能檢測到4種菌株中的任何一種的Azo-CM-纖維素活性。
[0033]圖10比較粗糙脈胞菌野生型(WT)和Acre-1菌株的表型。圖1OA展示了來自在Avicd I’上生長7天的WT和Λ cre-1菌株的培養物濾液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。標記代表葡萄糖苷酶(NCU04952)、纖維二糖水解酶l(cbh-l，NCU07340)和2(cbh-2，NCU09680)，以及內切葡聚糖酶2(gh5-l，NCU00762)的蛋白帶。圖1OB比較由來自WT和Acre-1菌株的7天培養物上清液的微晶纖維素酶(Avicelase)試驗確定的內切葡聚糖酶在Azo-CMC、蛋白質濃度，以及葡萄糖和纖維二糖濃度上的活性。
[0034]圖11 展示了 來自野生型(WT)、Acre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130,和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Δ cre-Ι缺失突變體的培養物濾液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。菌株在1%蔗糖中生長24小時，接著在2%蔗糖、2%纖維二糖、1%蔗糖和1%纖維二糖，或1%鹿糖和丨%Avicci?中生長4天，在24小時時間點取出樣品。在標準的10%Tris-HCl (CriterionlO%Tris-HCl)聚丙烯酰胺凝膠上跑15 μ I過濾后的培養物上清液并用Thermo ScientificGelCode藍色染色試劑染色。注意:在鹿糖上的Δ cre_l和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Δ cre-Ι的跑至72kDa的蛋白質已經用質譜分析法鑒定為NCU01517(葡糖淀粉酶I)。
[0035]圖12展示了來自野生型粗糙脈胞菌和Λ 4952 Δ 8755 Δ130(β -G tKO)的培養物濾液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。菌株在1%蔗糖中生長24小時，接著在2%蔗糖、2%纖維二糖，或2%Avice?中生長5天。標記代表纖維二糖水解酶I (cbh_l, NCU07340)、纖維二糖水解酶2(cbh-2，NCU09680)，和內切葡聚糖酶2(gh5-2，NCU00762)的蛋白帶。此外，在野生型中標記葡萄糖苷酶(NCU04952)并且在三重缺失Λ 4952 Λ 8755 Λ 130中描述了不存在葡萄糖苷酶。
[0036]圖13 展示了密切相關真菌中 NCU00130(SEQ ID NO:1)、NCU04952 (SEQ ID NO: 2),和NCU08755 (SEQID NO:3)直系同源物的ClustalW比對。提供粗糙脈胞菌基因的整條序列，并且直系同源物僅展示不同的氨基酸。”表示相同的殘基，而表示插入或缺失。
[0037]圖14展示了葡萄糖苷酶NCU00130直系同源物的進化關系。用鄰接法(SaitouN.和Nei Μ., 1987)推斷進化史。展示了樹枝長度總和=1.56132503的最優樹。該樹按比例繪制，并且樹枝長度的單位與用于推斷系統樹的進化距離的單位相同。用泊松校正法(Poisson correction method) (Zuckerkandl E.和Pauling L.，1965)計算進化距離，并且該進化距離以每個位點中氨基酸替換數為單位。分析涉及11條氨基酸序列。排除含有間隙和缺失數據的所有位置。最終的數據集中總共有447個位置。在MEGA5 (Tamura K., DudleyJ., Nei Μ.,和Kumar S.，2007)中進行進化分析。
[0038]圖15展示了 β -葡萄糖苷酶NCU04952直系同源物的進化關系。展示了樹枝長度總和=2.84018960的最優樹。分析涉及11條氨基酸序列。最終的數據集中總共有690個位置。
[0039]圖16展示了 β -葡萄糖苷酶NCU08755直系同源物的進化關系。展示了樹枝長度總和=2.37353896的最優樹。分析涉及11條氨基酸序列。最終的數據集中總共有709個位置。
[0040]圖17展示了用纖維糊精誘導后，WT和Λ3β6中的纖維素酶誘導。圖17Α展示了用AvicelfU纖維二糖、纖維三糖,或纖維四糖誘導4小時后，WT中cbh_l、gh5_l,和gh6_2的表達。圖17B展示了用Avkd?、纖維二糖、纖維三糖，或纖維四糖誘導4小時后，A3i3G中cbh-l、gh5_l,和gh6_2的表達。當用1%鹿糖誘導時,cbh-l、gh5_l,和gh6_2的基因表達水平標準化至I。在所有的樣品中，肌動蛋白(NCU04173)基因表達水平作為內源性對照。誤差條表不I標準偏差。
[0041]圖18展示了用纖維二糖或Avicd?誘導后，WT和β -葡萄糖苷酶缺失菌株中纖維素酶的表達水平。圖18Α展示了來自WT、A30G，和Λ3β GAcre菌株的培養物濾液中分泌蛋白的SDS-PAGE分析。標記代表CBH-1、GH6-2，和GH5-1的蛋白帶。此外，在三重敲除中標記不存在胞外β -葡萄糖苷酶(NCU04952)。葡糖淀粉酶I (NCU01517)的存在與cre_l基因的缺失相關。培養物在1%蔗糖中生長24小時，接著添加2%蔗糖或0.2%纖維二糖。在24小時(WT、Δ3β6^ΠΔ3β6Δ ere)或72小時(Δ 3 β G)后，收集上清液。WT的Α—咅養物在2%Aviee:lia上生長5天，Λ 3 β G在1%蔗糖中生長24小時，接著在l%Avied?中生長48小時，而A3i3GAcre在1%蔗糖中生長24小時，接著在-%AVfcC?中生長24小時。圖18B展示了來自18A的上清液對AVKdS_的活性。在50°C用l%Avte?誘導24小時后，測量葡萄糖(深灰色)和纖維二糖(淺灰色)。誤差條表示I標準偏差。
[0042]圖19展示了用槐糖、乳糖或D_(+)_半乳糖誘導后，WT和A3i3G中的纖維素酶誘導。圖19A展示了用ImM槐糖、ImM乳糖，或ImM D_(+)_半乳糖誘導4小時后，WT和Λ3β6中cbh-1的表達。圖19B展示了用ImM槐糖、ImM乳糖，或ImM D-(+)-半乳糖誘導4小時后，WT和A3i3G中gh6-2的表達。當用1%蔗糖誘導時，cbh_l和gh6_2的基因表達水平標準化至I。在所有的樣品中，肌動蛋白(NCU04173)基因表達水平作為內源性對照。誤差條表不I標準偏差。
[0043]圖20展示了 WT和Λ 3 β G菌株的RNA測序。圖20Α展示了與用纖維二糖誘導相t匕，在WT粗糙脈胞菌中用Avicd?有差別地誘導的318種基因的分層聚類分析。淺色表示更高的相關表達，而深色表示更低的相關表達。圖20B展示了與用纖維二糖誘導的A3i3G相t匕，用纖維二糖或Avteel翁誘導的WT以FPKM (每百萬片段映射的每千個堿基的外顯子的片段)表示的纖維素酶表達。所有的菌株在2%蔗糖上生長16小時，接著轉移至無碳源(僅有Vogels鹽溶液)、0.2%纖維二糖或l%Av'kd&中培養4小時。
[0044]圖21展示了用纖維二糖或Avicel?誘導后，WT、Λ 3 β G，和Λ 3 β G Λ ere菌株的酶活性。圖21A展示了 24小時誘導的上清液對Avkd?的活性。比較來自用纖維二糖誘導24小時的Λ3β6(正方形)和Λ3β GAcre (菱形)的培養物上清液與來自在Avicd#上生長5天的WT (三角形)培養物上清液的纖維素酶活性。圖21B展示了在Avkxl?水解試驗(來自于21A)中，36小時后，纖維二糖(淺灰色)和葡萄糖(深灰色)的分解。誤差條表示I標準偏差。
[0045]圖22總結了在野生型(Aviee?)、Λ 3 β G (纖維二糖)，和Λ 3 β G Λ ere (纖維二糖)粗糙脈胞菌菌株中通過質譜分析鑒定的蛋白質。
[0046]圖23比較來自粗糙脈胞菌菌株Λ3β6、Δ3β GAcre, Δ3β6Δ890,Δ 3 β GA 6650, Δ 3 β G Δ 6650 Δ 890, Δ 3 β G Δ ere Δ 6650, Δ 3 β G Δ ere Δ 890,和Δ3β GAcreA 6650 Δ 890的培養物濾液中MuLac活性(纖維素酶活性)。帶有Λ 890的菌株缺失β-甘露糖苷酶基因NCU00890。帶有Λ 6650的菌株缺失磷脂酶基因或磷脂酶類基因NCU06650。菌株在2%蔗糖中生長36小時，接著在0.2%纖維二糖中生長24小時。用4-甲基傘形酮基_β-D-纖維二糖糖苷(MuLac)試驗測量培養物上清液中外切葡聚糖酶活性。在菌株之間，以相對熒光顯示結果。
具體實施例
[0047]鍵
[0048]本發明涉及突變細胞和重組細胞 ，該突變細胞和重組細胞顯示了蛋白，比如纖維素酶，的分泌增加，以響應纖維素類生物質或糖類的誘導；并且涉及利用這種細胞以增加蛋白分泌的方法。該分泌蛋白可以用于降解木質纖維素類生物質。在此公布的本發明的突變細胞在至少一種基因，比如葡萄糖苷酶基因、cre-Ι基因、β-甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶或磷脂酶類基因，中含有失活性突變。如在此公布，與相應非重組細胞中至少一種基因的表達相比，本發明的重組細胞顯示至少一種基因，比如β -葡萄糖苷酶基因、cre-Ι基因、β -甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶或磷脂酶類基因，的表達下降。
[0049]蛋白分泌誘導物
[0050]從含有多糖及多糖成分的生物，如植物，藻類，真菌，細菌，和細菌生物膜，大量獲得纖維素類生物質。纖維素是纖維素類生物質中的主要多糖。纖維素是脫水纖維二糖(anhydrocel1biose)(線性β _(1_4)-D-葡聚糖)的均聚物,并包括以β _糖苷鍵連接在一起的葡萄糖單位。雖然一般是多形的，但植物組織中的纖維素主要為平行葡聚糖鏈的不溶性的結晶基質。纖維素類生物質可以為未加工的生物質、預處理的生物質，或加工的生物質。纖維素類生物質也可以包括一種或更多種糖類。
[0051]本發明的合適的纖維素類生物質可以包括，但不限于，糖類、多糖、低聚糖、純化的纖維素，和纖維素衍生物。純化的纖維素包括全纖維素,如Solka Flok，和微晶纖維素，比如AYicdD和纖維素衍生物包括，但不限于，纖維糊精、β -甲基傘形酮基-低聚糖(β -methylumbelliferyl-oligosaccharides)、對硝基苯酌.低聚糖(p-nitrophenol-oligosaccharides)、長鏈的纖維素衍生物、羧甲基纖維素(CMC)，和羥乙基纖維素(HEC)。
[0052]在此使用的“纖維糊精”指的是不同長度的β (I — 4)葡萄糖聚合物，包括，但不限于，纖維二糖(2個葡萄糖單體)、纖維三糖(3個葡萄糖單體)、纖維四糖(4個葡萄糖單體)、纖維五糖(5個葡萄糖單體)，和纖維六糖(6個葡萄糖單體)。有利的是，短鏈纖維糊精，如纖維二糖，是可溶的。此外，本發明的分泌蛋白不附著短鏈纖維糊精，如纖維二糖。
[0053]在某些方面，本發明的纖維素類生物質可以為未加工的生物質材料，該生物質材料可以通過本發明的細胞降解。降解的生物質可以包括，但不限于，多糖，如纖維素和微晶纖維素；或低聚糖，如纖維糊精和纖維二糖。在其它方面，本發明的纖維素類生物質可以包括純化的多糖，如纖維素和微晶纖維素；或低聚糖，如纖維糊精和纖維二糖。在另外的其它方面，本發明的生物質可以包 括多糖的混合物，如纖維素和微晶纖維素；和低聚糖，如纖維糊精和纖維二糖。
[0054]在某些方面，本發明的纖維素類生物質直接加入到本發明的突變細胞或重組細胞中以誘導蛋白分泌。
[0055]在其它方面，通過一種或更多種纖維素衍生物，比如纖維糊精或纖維二糖從本發明的突變細胞或重組細胞誘導蛋白分泌，其中該纖維素衍生物通過細胞降解纖維素類生物質在原位產生。在某些方面，纖維素類生物質的數量足以產生誘導細胞分泌的纖維素衍生物，但該纖維素衍生物不附著，或相反，隔離從細胞分泌的一類或更多類蛋白。
[0056]此外，糖類可以用于誘導本發明的突變細胞或重組細胞分泌蛋白。合適的糖類包括，但不限于，多糖、低聚糖、槐糖、纖維素、微晶纖維素、纖維糊精、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖，和纖維六糖。
[0057]分泌蛋白
[0058]在某些方面，本發明的突變細胞和重組細胞顯示了至少一類、至少兩類、至少三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白分泌增加，以響應纖維素類生物質或糖類的誘導。
[0059]在此使用的，增加分泌指的是提高本發明的蛋白的分泌水平。分泌涉及從細胞內到細胞外的蛋白運動。分泌水平提高可以 是感興趣的蛋白的表達或產量增加的結果。可選地，分泌水平提高可以是感興趣的蛋白來自細胞的轉運增加的結果。本發明的方法還可以通過改變參與蛋白產生和分泌，導致該蛋白的總分泌水平提高的途徑提高蛋白的分泌水平。
[0060]本發明的可以分泌的蛋白質的類型，包括，但不限于，內源蛋白和外源蛋白。本發明的內源蛋白為本發明的細胞的內源的，或由本發明的細胞自然產生的蛋白。本發明的外源蛋白是不在本發明的細胞中自然表達的蛋白。外源蛋白可以通過本領域已知的任何方法在細胞中的重組表達。通常，編碼外源蛋白質的重組核酸可操作地連接到調控序列，如啟動子。可以使用本領域已知的任何合適的調控序列。合適的啟動子包括，但不限于，組成型啟動子或誘導型啟動子。此外，外源蛋白可以含有直接從細胞分泌的分泌型肽。可以使用本領域已知的適用于本發明的方法的任何分泌型肽。
[0061]在某些方面，分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。在此使用的“纖維素誘導蛋白”指的是在野生型細胞(例如，非突變或非重組細胞)中通過纖維素誘導表達和分泌的蛋白。例如，2011 年，C.M.Phillips 等人(Phillips, CM et al., ProteomeRes.201IS印2; 10(9):4177-85.Epub2011Augl)描述的纖維素誘導蛋白。
[0062]本發明的纖維素誘導的分泌蛋白包括，但不限于:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質。
[0063]在此使用的，“纖維素酶”或“纖維素酶多肽”指的是具有催化纖維素、地衣多糖，和谷物β -D-葡聚糖水解的酶活性的多肽。例如，纖維素酶可以水解纖維素中的1，4-β -D-糖苷鍵。本發明的纖維素酶包括，但不限于，內切纖維素酶，內切葡聚糖酶、內切_1，4-β-葡聚糖酶、內切-1，4_i3-D-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶((CMCase)、β_1，4_葡聚糖酶、β -1, 4-內切葡聚糖水解酶(β -1, 4-endoglucan hydrolase),和纖維糊精酶；外切纖維素酶如外切葡聚糖酶，纖維二糖酶、纖維二糖水解酶、氧化的纖維素酶比如纖維二糖脫氫酶；和纖維素磷酸化酶。 [0064]在此使用的，“GH61酶”指的是糖苷水解酶家族61的酶。本發明的GH61酶能夠提高纖維素酶的活性。GH61酶的例子包括，但不限于，多糖單加氧酶。在某些方面，本發明的GH61酶由GH61-1基因、GH61-2基因、GH61-5基因、NCU07898基因、NCU08760基因、其同源物，及其直系同源物編碼。
[0065]纖維二糖脫氫酶是具有氧化還原酶活性的酶，并包括具有ECl.1.99.18活性的酶。在某些方面，本發明的纖維二糖脫氫酶由NCU00206、cdh-l基因、其同源物，及其直系同源物編碼。
[0066]內酯酶為可以水解酰化的高絲氨酸內酯的高絲氨酸內酯環的酯鍵的酶。在某些方面，本發明的內酯酶由NCU07143、lac-2基因、其同源物，及其直系同源物編碼。
[0067]碳水化合物酯酶為具有EC3.1.1和EC3.1.2活性的酶。碳水化合物酯酶的例子包括，但不限于，乙酰木聚糖酶，肉桂酰酯酶(cinnamoyl esterase),阿魏酸酯酶,羧酸酯酶，和S-甲酰谷胱甘肽水解酶(S-formylglutathione hydrolase)。在某些方面,本發明的碳水化合物酯酶由NCU09491、NCU09664、其同源物，及其直系同源物編碼。
[0068]多糖裂解酶為具有EC4.2.2活性的酶。在某些方面，本發明的多糖裂解酶由NCU05598、其同源物，及其直系同源物編碼。
[0069]在此使用的的“含有纖維素結合結構域的蛋白”指的是含有纖維素結合結構域的蛋白纖維素結合結構域是在有纖維素活性的酶，如糖苷水解酶中發現的蛋白質結構域。一般地，纖維素結合結構域具有碳水化合物結合活性。在某些方面，本發明的含有纖維素結合結構域的蛋白由NCU09764、其同源物，及其直系同源物編碼。
[0070]在某些方面，本發明的分泌的纖維素誘導蛋白是由NCU05137、其同源物，及其直系同源物編碼的蛋白。
[0071]突奪細朐
[0072]本發明的一個方面涉及突變細胞，該突變細胞顯示了蛋白質分泌增加以響應纖維素類生物質或糖類；并涉及用這種細胞增加來自該細胞的蛋白的分泌和涉及降解木質纖維素類生物質的方法。在此使用的，本發明的突變細胞在至少一個基因中包含失活性突變。合適的失活性突變的例子包括，但不限于，引起抑制該基因編碼的蛋白功能的缺失、點突變、功能喪失型突變、截斷、重復、擴增、易位，和/或倒位。在感興趣的基因中產生一個或更多個失活性突變的方法在本領域中是眾所周知的，包括，但不限于，PCR誘變、插入誘變、化學誘變，和輻射。[0073]在本發明的一個方面，該突變細胞為真菌或酵母細胞。在本發明的另一發明，該突變細胞可以為子囊菌擔子菌真菌細胞，粗糙脈孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)細胞、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)細胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)細胞、嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila))細胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)細胞、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)細胞、灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)細胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細胞、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)細胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)細胞、褐腐菌(Postia placenta)細胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)細胞,或解纖維頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)細胞。優選地，該突變細胞為突變的粗糙脈孢菌細胞。在本發明的另一個方面，該突變細胞為重組細胞的。優選地，突變，重組細胞為粗糙脈孢菌突變、重組細胞。
[0074]β-葡萄糖苷酶突變細胞
[0075]β -葡萄糖苷酶基因編碼β -葡萄糖苷酶。在此使用的“ β -葡萄糖苷酶”指的是催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基水解并釋放葡萄糖的β-D-糖苷葡糖水解酶。β-葡萄糖苷酶是高度保守的酶。
[0076]在一個方面，本發明的突變細胞在至少兩種葡萄糖苷酶基因中包含失活性突變，這導致由該至少兩個基因編碼的葡萄糖苷酶的功能喪失。該至少兩種葡萄糖苷酶基因的失活性突變包括，但不限于，缺失突變、點突變、無義突變、截斷，和插入。失活性突變可以完全消除葡萄糖苷酶的活性或抑制葡萄糖苷酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突變可以影響突變基因的表達水平或影響由該突變基因編碼的蛋白質或RNA的功能活性。失活性突變也可以是順式或反式作用。失活性突變可以通過隨機突變，包括輻射或暴露于化學誘變劑，而引入，或者失活性突變能以有針對性的方式，包括含有失活性突變的菌株同源重組和雜交，而引入。
[0077]含有失活性突變的本發明的葡萄糖苷酶可以為胞內葡萄糖苷酶或胞外(即，分泌型)β-葡萄糖苷酶。合適的含有失活性突變的葡萄糖苷酶的例子包括，但不限于，粗糙脈孢菌基因NCU00130、NCU04952、NCU08755、其同源物，及其直系同源物編碼的那些葡萄糖苷酶。NCU00130直系同源物、NCU04952直系同源物，和NCU08755直系同源物的例子包括，但不限于，圖13-16列舉的那些。
[0078]在本發明的一個具體方面，相比缺乏失活的β -葡萄糖苷酶突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導突變細胞轉錄水平高10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000、50，000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0079]在本發明的一個具體方面，相比缺乏失活的葡萄糖苷酶突變的細胞，纖維素類生物質或糖類在兩天誘導后可以誘導突變細胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000，或 10，000 倍的至少一類蛋白。
[0080]在本發明的另一具體方面，相比缺乏失活的β_葡萄糖苷酶突變的細胞，纖維素類生物質或糖類在兩天誘導后可以誘導突變細胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、3、4、5、6、7、8、9，或10倍的總蛋白。
[0081]在本發明的另一具體方面，相比缺乏失活的葡萄糖苷酶突變的細胞，用至少InM、至少 5nM、至少 IOnM, 15nM、至少 20nM、至少 25nM、30nM、至少 35nM、至少 40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125nM、150nM、至少 175nM、200nM、至少 225nM、至少 250nM、至少275nM、300nM、至少 325nM、350nM、至少 375nM、至少 400nM、至少 425nM、至少 450nM、至少475nM、500nM、至少 525nM、至少 550nM、至少 575nM、600nM、至少 625nM、650nM、至少 675nM、至少 700nM、至少 725nM、至少 750nM、至少 775nM、800nM、至少 825nM、至少 850nM、至少 875nM、900nM、至少 925nM、950nM、至少 975nM、至少 1“1\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少54厘、至少641、至少741、至少841、至少9411、至少10 μ M、至少15μΜ、至少20μΜ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65 μ Μ、至少70 μ Μ、至少75 μ Μ、至少80 μ Μ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少I ImM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM,或更多纖維素類生物質或糖類誘導后，突變細胞可以轉錄水平高10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000,50, 000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0082]在本發明的另一具體方面，相比缺乏失活的葡萄糖苷酶突變的細胞，用至少InM、至少 5nM、至少 ΙΟηΜ、15nM、至少 20nM、至少 25nM、30nM、至少 35nM、至少 40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125nM、150nM、至少 175nM、200nM、至少 225nM、至少 250nM、至少275nM、300nM、至少 325nM、350nM、至少 375nM、至少 400nM、至少 425nM、至少 450nM、至少475nM、500nM、至少 525nM、至少 550nM、至少 575nM、600nM、至少 625nM、650nM、至少 675nM、至少 700nM、至少 725nM、至少 750nM、至少 775nM、800nM、至少 825nM、至少 850nM、至少 875nM、900nM、至少 925nM、950nM、至少 975nM、至少 1“1\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少54厘、至少641、至少741、至少841、至少9411、至少10 μ Μ、至少15μΜ、至少20μΜ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65 μ Μ、至少70 μ Μ、至少75 μ Μ、至少80 μ Μ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少llmM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM,或更多纖維素類生物質或糖類誘導后，突變細胞可以分泌水平高2、4、8、16、32、64、128，或256倍的至少一類蛋白。
[0083]在本發明的另一具體方面，該至少兩種葡萄糖苷酶為至少三種葡萄糖苷酶、至少四種葡萄糖苷酶、至少五種葡萄糖苷酶、至少六種葡萄糖苷酶、至少七種葡萄糖苷酶，或更多種葡萄糖苷酶。
[0084]在本發明的一個優選實施例中，在粗糙脈孢菌細胞中缺失葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952,以及 NCU08755。
[0085]在本發明的另一方面，包括降低至少兩種β -葡萄糖苷酶活性的失活性突變的突變細胞在cre-Ι基因中進一步包括失活性突變，其中比起在cre-Ι基因中缺乏突變的細胞，纖維素類生物質或糖類誘導該細胞分泌更高水平的至少一種蛋白。失活性突變可以影響突變基因的表達水平或影響由該突變基因編碼的蛋白質或RNA的功能活性。失活性突變可以是順式或反式作用。失活性突變可以通過隨機突變，包括輻射或暴露于化學誘變劑，而引入，或者失活性突變能以有針對性的方式，包括含有單一或多重失活性突變的菌株同源重組和雜交，而引入。
[0086]在本發明的一個具體方面，相比缺乏失活的creA/cre-Ι突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導該突變細胞轉錄水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000、10，000,50, 000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0087]在本發明的一個具體方面，相比缺乏葡萄糖苷酶突變或cre-Ι突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導該突變細胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100,500,1, 000,5, 000，或 10，000 倍的至少一類蛋白。
[0088]在本發明的另一具體方面，相比缺乏葡萄糖苷酶突變或cre-Ι突變的細胞，纖維素類生物質或糖類在兩天誘導后可以誘導該突變細胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9，或10倍的總蛋白。
[0089]在本發明的另一具體方面，相比缺乏葡萄糖苷酶突變或cre-Ι突變的細胞，用至少InM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125ηΜ、150ηΜ、至少 175ηΜ、200ηΜ、至少 225ηΜ、至少 250ηΜ、至少 275ηΜ、300ηΜ、至少 325ηΜ、350ηΜ、至少 375ηΜ、至少 400ηΜ、至少 425ηΜ、至少 450ηΜ、至少475nM、500nM、至少 525nM、至少 550nM、至少 575nM、600nM、至少 625nM、650nM、至少 675nM、至少 700nM、至少 725nM、至少 750nM、至少 775nM、800nM、至少 825nM、至少 850nM、至少 875nM、900nM、至少 925nM、950nM、至少 975nM、至少 14]\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少5口1、至少641、至少741、至少841、至少941、至少10 μ Μ、至少15μΜ、至少20μΜ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65μΜ、至少70μΜ、至少75μΜ、至少80 μ Μ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少llmM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，更多纖維素類生物質或糖類誘導后，突變細胞可以轉錄水平高10、50、100、500、1，000、5，000、10，000、50，000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0090]在本發明的另一具體方面，相比缺乏β_葡萄糖苷酶突變或cre-Ι突變的細胞，用至少InM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125ηΜ、150ηΜ、至少 175ηΜ、200ηΜ、至少 225ηΜ、至少 250ηΜ、至少 275ηΜ、300ηΜ、至少 325ηΜ、350ηΜ、至少 375ηΜ、至少 400ηΜ、至少 425ηΜ、至少 450ηΜ、至少475ηΜ、500ηΜ、至少 525ηΜ、至少 550ηΜ、至少 575ηΜ、600ηΜ、至少 625ηΜ、650ηΜ、至少 675ηΜ、至少 700ηΜ、至少 725ηΜ、至少 750ηΜ、至少 775ηΜ、800ηΜ、至少 825ηΜ、至少 850ηΜ、至少 875ηΜ、900ηΜ、至少 925ηΜ、950ηΜ、至少 975ηΜ、至少 1“]\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少5口1、至少641、至少741、至少841、至少941、至少10 μ Μ、至少15 μ Μ、至少20 μ Μ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65 μ Μ、至少70μΜ、至少75μΜ、至少80μΜ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少llmM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，或更多纖維素類生物質或糖類誘導后，突變細胞可以分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、8、16、32、64、128，或256倍的至少一類蛋白。
[0091]在本發明的另一具體 方面，該至少兩種β-葡萄糖苷酶為至少三種β-葡萄糖苷酶。[0092]在本發明的一個優選實施例中，在粗糙脈孢菌細胞中缺失β-葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952,以及 NCU08755，和 cre-Ι 基因。
[0093]CreA/cre~l 突變細胞
[0094]在一個方面，本發明的突變細胞在creA/cre-Ι基因中包含失活性突變，這導致由該基因編碼的CreA/CRE-Ι功能喪失。creA/cre-Ι基因的失活性突變包括，但不限于，缺失突變、點突變、無義突變、截斷，和插入。失活性突變可以完全消除CreA/CRE-Ι活性或抑制CreA/CRE-Ι至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突變可以影響突變基因的表達水平或影響由該突變基因編碼的蛋白質或RNA的功能活性。失活性突變也可以是順式或反式作用。失活性突變可以通過隨機突變，包括輻射或暴露于化學誘變劑，而引入，或者失活性突變能以有針對性的方式，包括含有失活性突變的菌株同源重組和雜交，而引入。在此“cre-Ι基因”和“creA/cre-Ι基因”能交替使用。
[0095]在本發明的一個具體方面，相比缺乏失活的cre-Ι突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導該突變細胞轉錄水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000、50，000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0096]在本發明的一個具體方面，相比缺乏cre-Ι突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導包括cre-Ι失活性突變的突變細胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、
50、100、500、1，000,5, 000，或 10，000 倍的至少一類蛋白。
[0097]在本發明的另一 具體方面，與缺乏cre-Ι突變的細胞相比，突變細胞顯示了參與C化合物/碳水化合物代謝、胞外代謝、具有結合的功能或輔助因子要求的蛋白質、C化合物/碳水化合物的運輸、運輸設施，和蛋白質合成的基因的表達基礎水平升高。
[0098]在本發明的一個優選實施例中，粗糙脈孢菌細胞中缺失cre-Ι基因。
[0099]在本發明的另一方面，在cre-Ι基因中包括失活性突變的突變細胞進一步包括消除由至少兩種β-葡萄糖苷酶基因編碼的β-葡萄糖苷酶活性的失活性突變。該至少兩種β -葡萄糖苷酶基因的失活性突變包括缺失、點突變、無義突變、截斷，和插入。失活性突變可以完全消除β -葡萄糖苷酶活性或抑制至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突變可以影響突變基因的表達水平或影響由該突變基因編碼的蛋白質或RNA的功能活性。失活性突變也可以是順式或反式作用。失活性突變可以通過隨機突變，包括輻射或暴露于化學誘變劑，而引入，或者失活性突變能以有針對性的方式，包括含有失活性突變的菌株同源重組和雜交，而引入。β-葡萄糖苷酶可以是胞內或胞外(即，分泌的)β-葡萄糖苷酶。
[0100]在本發明的一個具體方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導突變細胞轉錄水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000、10，000,50, 000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0101]在本發明的一個具體方面，相比缺乏至少兩種β-葡萄糖苷酶突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導突變細胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000，或10，000倍的至少一類蛋白。
[0102]在本發明的另一具體方面，該至少兩種β-葡萄糖苷酶為至少三種β-葡萄糖苷酶。
[0103]在本發明的一個優選實施例中，該突變細胞為包括β-葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952,以及NCU08755缺失和cre_l缺失的粗糙脈孢菌細胞。
[0104]甘露糖苷酶突變細胞
[0105]在本發明的另一方面，含有降低至少兩種β -葡萄糖苷酶活性的失活性突變的本發明的突變細胞、在cre-Ι基因中含有失活性突變的本發明的突變細胞，和/或含有降低至少兩種β -葡萄糖苷酶活性的失活性突變和在cre-Ι基因中含有失活性突變的突變細胞進一步包括降低至少一種β-甘露糖苷酶基因活性的失活性突變。
[0106]本發明的β_甘露糖苷酶基因編碼β_甘露糖苷酶。在此使用的“β_甘露糖苷酶”、“甘露聚糖內切_1，6-β-甘露糖苷酶”、“內切-1，4-β-甘露聚糖酶”、“內切- β -1，4-甘露聚糖酶(endo-β -1，4-mannase)”、“ β -甘露聚糖酶B”、“ β -1, 4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶”、“內切-β -甘露聚糖酶”、“ β -D-甘露聚糖酶”，和”1，4- β -D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶”可以交替使用并且指的是能隨機水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖(EC3.2.1.78)中的1，4-β-D-甘露糖苷鍵的酶。在某些發明，該至少一種β-甘露糖苷酶基因為NCU00890、里氏木霉蛋白ID62166、里氏木霉蛋白ID57857、其同源物，及其直系同源物。
[0107]在一個方面，本發明的突變細胞在至少一種β-甘露糖苷酶基因中包含失活性突變，這導致由該基因編碼的β_甘露糖苷酶的功能喪失。該至少一種β_甘露糖苷酶基因的失活性突變包括，但不限于，缺失突變、點突變、無義突變、截斷，和插入。失活性突變可以完全消除β -甘露糖苷酶的活性或抑制β -甘露糖苷酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突變可以影響突變基因的表達水平或影響由該突變基因編碼的蛋白質或RNA的功能活性。失活 性突變也可以是順式或反式作用。失活性突變可以通過隨機突變，包括輻射或暴露于化學誘變劑，而引入，或者失活性突變能以有針對性的方式，包括含有失活性突變的菌株同源重組和雜交，而引入。
[0108]在本發明的一個具體方面，相比缺乏至少一種β-甘露糖苷酶基因失活性突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導進一步含有至少一種β-甘露糖苷酶基因失活性突變的突變細胞轉錄水平高 2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000,50, 000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0109]在本發明的一個具體方面，相比缺乏至少一種β_甘露糖苷酶失活性突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導進一步含有至少一種β_甘露糖苷酶失活性突變的突變細胞分泌水平高 1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000，或10，000 倍
的至少一類蛋白。
[0110]在本發明一個優選實施例中，在粗糙脈孢菌細胞中缺失至少一種β -甘露糖苷酶基因。
[0111]磷脂酶突變細胞
[0112]本發明的另一方面，含有降低至少兩種β-葡萄糖苷酶活性的失活性突變的本發明的突變細胞、含有creA/cre- Ι基因中的失活性突變的本發明的突變細胞、含有降低至少兩種β -葡萄糖苷酶活性的失活性突變和含有creA/cre-Ι基因中失活性突變的突變細胞，和/或含有降低至少兩種β -葡萄糖苷酶活性的失活性突變，creA/cre-Ι基因中的失活性突變，和降低至少一種β-甘露糖苷酶活性的失活性突變的本發明的突變細胞進一步包括降低至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因活性的失活性突變。
[0113]在此使用的“磷脂酶類基因”是與磷脂酶基因具有序列同源性的基因，或編碼與磷脂酶具有氨基酸序列同源性的蛋白的基因。例如，本發明的磷脂酶類基因可以為NCU06650。雖然NCU06650沒有展示編碼具有磷脂酶活性的蛋白，但編碼的氨基酸序列的最接近的同源物為磷脂酶。
[0114]本發明的磷脂酶基因編碼磷脂酶。在此使用的磷脂酶包括，但不限于，將磷脂水解成，例如，脂肪酸和其他親脂性分子，的酶。編碼磷脂酶的基因可以包括，但不限于，編碼磷脂酶Al、磷脂酶Α2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D，或磷酸二酯酶的基因。
[0115]因此，在某些方面，該至少一種磷脂酶具有或磷脂酶類基因為NCU06650、里氏木霉蛋白ID67579、其同源物，及其直系同源物。
[0116]在一個方面，本發明的突變細胞在至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中包含失活性突變，該失活性突變導致由該基因編碼的蛋白的功能喪失。該至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的失活性突變包括，但不限于，缺失突變、點突變、無義突變、截斷，和插入。失活性突變可以完全消除磷脂酶的活性或抑制磷脂酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突變可以影響突變基因的表達水平或影響由該突變基因編碼的蛋白質或RNA的功能活性。失活性突變也可以是順式或反式作用。失活性突變可以通過隨機突變，包括輻射或暴露于化學誘變劑，而引入，或者失活性突變能以有針對性的方式，包括含有失活性突變的菌株同源重組和雜交，而引入。
[0117]在本發明的一個具體方面，相比缺乏至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因失活性突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導進一步含有至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因失活性突變的突變細胞轉錄水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000、50，000，或100，000倍的至少一類蛋白。
[0118]在本發明一個具體方面，相比缺乏至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因失活性突變的細胞，纖維素類生物質或糖類可以誘導進一步含有至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因失活性突變的突變細胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000，或10，000倍的至少一類蛋白。
[0119]在本發明一個優選實施例中，在粗糙脈孢菌細胞中缺失至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因。
[0120]重組細胞
[0121]本發明的另一方面涉及重組細胞，該重組細胞顯示了在細胞中至少兩種β-葡萄糖苷酶具有或cre-Ι基因的表達下降，也顯示了至少一類，至少兩類，至少三類，至少四類，至少五類，或更多類蛋白的分泌增加以響應纖維素類生物質或糖類；以及涉及用這種細胞增加來自細胞的蛋白的分泌，和降解木質纖維素類生物質的方法。本發明的重組細胞可以是穩定細胞系或瞬時轉染的細胞。
[0122]顯示感興趣的基因(例如，β -葡萄糖苷酶基因、cre-Ι基因、β -甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶基因或磷脂酶類基因)的表達下降本發明的重組細胞可以含有降低感興趣基因的表達的突變。本領域周知產生和塑造突變的方法，比如突變篩選。可選地,本發明的重組細胞可以為含有靶向并降低感興趣基因的表達的重組構建體，比如抑制性寡核苷酸的轉基因細胞。抑制性寡核苷酸的非限制性來自包括811?嫩、1^1?嫩、反義0嫩。此外，可以通過基因沉默技術，比如抑制或減數分裂沉默降低感興趣基因的表達。基因沉默技術可以靶向感興趣基因、感興趣基因的RNA、感興趣基因的調控蛋白。
[0123]本發明的重組細胞分泌的蛋白質的類型包括，但不限于，纖維素誘導蛋白。纖維素誘導蛋白的非限制性例子包括，但不限于，纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質。在某些方面，本發明的分泌蛋白由以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在某些方面，本發明的重組細胞增加至少一類、至少兩類、至少三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白分泌。
[0124]在某些發明，與相應非重組細胞中至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達相比，本發明的重組細胞顯示了該至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達下降。在其它實施例中，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，本發明的重組細胞顯示了 cre-Ι基因的表達下降。
[0125]在此使用的“相應非重組細胞”指的是這樣的細胞:與重組細胞的物種相同并在與重組細胞相同的條件下培養，但缺乏導致在重組細胞中降低基因表達的對重組細胞的修飾。本發明的基因的“表達下降”指的是與相應非修飾細胞中基因的表達水平相比，在修飾的細胞中該基因的表達水平降低。
[0126]在某些方面，該至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達可能會降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在其它方面，該CRE-1基因的表達可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
[0127]在本發明的具體方面，顯示至少兩種葡萄糖苷酶基因的蛋白下降的重組細胞進一步顯示基因creA/cre-Ι的表達下降。降低creA/cre-Ι表達的方法可以為基因沉默技術，包括siRNA、miRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默。基因沉默技術可以靶向creA/cre-Ι或creA/cre-Ι調控蛋白，或RNA。CreA/cre-Ι表達可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
[0128]在本發明的另一具體方面，顯示至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達下降的重組細胞可以是通過顯性失活突變或蛋白抑制劑的過表達使CreA/CRE-Ι轉錄因子的功能活性降低的細胞。CreA/CRE-Ι的功能可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
[0129]在本發明另一具體方面，顯示至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達下降的重組細胞，和/或顯示至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達水平下降和基因creA/cre-Ι的表達水平下降的重組細胞可以進一步顯示本發明的至少一種β-甘露糖苷酶基因的表達下降。降低β -甘露糖苷酶的方法包括，但不限于，基因沉默技術，包括siRNA、miRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默。基因沉默技術可以靶向至少一種β-甘露糖苷酶基因或β-甘露糖苷酶基因調控蛋白或RNA。β-甘露糖苷酶基因表達可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在某些發明。在重組粗糙脈孢菌細胞中β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表達降低。
[0130]在本發明另一具體方面，顯示至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達下降的重組細胞、顯示至少兩種β -葡萄糖苷酶基因的表達水平下降和基因creA/cre-Ι的表達水平下降的重組細胞，和/或顯示至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達水平下降、基因creA/cre-1的表達水平下降，和至少一種β-甘露糖苷酶基因的表達下降的重組細胞可以進一步展示本發明的至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達下降。降低磷脂酶表達的方法包括，但不限于，基因沉默技術，包括siRNA、miRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默。基因沉默技術可以靶向至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因或基因調控蛋白或RNA。磷脂酶基因或磷脂酶類基因表達可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在某些發明。在重組粗糙脈孢菌細胞中β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表達降低。在某些方面，在重組粗糙脈孢菌細胞中降低基因NCU06650的表達。
[0131]在本發明優選實施例中，在重組粗糙脈孢菌細胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表達。在本發明另一優選實施例中，在重組粗糙脈孢菌細胞中降低β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表達，以及cre_l基因的表達。在本發明另一優選實施例中，在重組粗糙脈孢菌細胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表達，cre-Ι基因的表達，以及β _甘露糖苷酶基因NCU00890的表達。在本發明進 一步優選實施例中，在重組粗糙脈孢菌細胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表達，cre-Ι基因的表達、β -甘露糖苷酶基因NCU00890的表達，以及基因NCU06650的表達。
[0132]在本發明的一個方面，該重組細胞顯示了基因cre-Ι基因的表達下降。降低cre-1表達的方法包括，但不限于基因沉默技術，包括siRNA、miRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默。基因沉默技術可以靶向cre-Ι或cre-Ι調控蛋白，或RNA。在重新細胞中，Cre-1表達可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少 99%，或 100%。
[0133]在本發明的另一方面，在重組細胞中通過顯性失活突變或蛋白抑制劑的過表達降低CreA/CRE-Ι轉錄因子的功能活性。CreA/CRE_l的功能可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或
100% ο
[0134]變體、序列一致性，和序列相似性[0135]本領域周知用于比較的序列比對方法。例如，確定任何兩條序列之間的序列一致性百分比可以用數學算法實現。這種數學算法的非限制性來自為Myers和Miller (1988)CAB10S4:1117 算法、Smith 等人(1981) Adv.Appl.Math.2:482 的局部同源算法、Needleman和 Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443453 的同源比對算法、Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:24442448 的搜索相似性算法、在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:58735877 中修改的 Karlin 和 Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264 算法。[0136]這些數學算法的計算機執行可以用于序列比較以確定序列一致性。這些執行包括，但不限于，PC/Gene程序中的CLUSTAL(可從加州山景城的Intelligenetics獲得)、ALIGN 程序(第 2 版)，和 Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA,和TFASTA,第8版(可從美國威斯康星州麥迪遜市575Science Drive的GeneticsComputer Group (GCG)獲得)可以用缺省參數以這些程序進行比對。Higgins等人(1988)Gene73:237244(1988)、Higgins 等人(1989)CAB10S5:151153、Corpet 等人(1988)NucleicAcids Res.16:1088190、Huang 等人(1992) CAB10S8:15565，和 Pearson 等人(1994) MetLMol.Biol.24:307331中詳細描述了 CLUSTAL程序。ALIGN程序是基于上述Myers和Miller (1988)的算法。當比較氨基酸序列時，可以將PAM120權重殘基表、間隙長度罰分12，和間隙罰分 4 與 ALIGN 程序一起使用。Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol.215:403 的BLAST程序是基于上述Karlin和Altschul (1990)的算法。BLAST核苷酸搜索能以BLASTN程序，得分=100，字長=12執行，以獲得與編碼本發明的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索能以BLASTX程序，得分=50，字長=3執行，以獲得與本發明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的間隙比對，可以利用Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res.25:3389 中描述的 Gapped BLAST (在 BLAST2.0 中)。可選地，PS1-BLAST (在BLAST2.0中)可以用于執行迭代搜索，迭代搜索檢測分子間的距離關系。參見上述 Altschul 等人(1997)的文獻。當利用 BLAST、Gapped BLAST，或 PS1-BLAST 時，可以利用各個程序(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的缺省參數。參見http://www.ncb1.nlm.nih.gov。I:匕對也可以通過審視手動執--。
[0137]在此使用的序列一致性或在兩條核酸或多肽序列的背景下的一致性指的是當在指定的比較窗口比對最大相符度時，兩條序列的殘基相同。當序列一致性的百分比與蛋白相關時，不一致的并且通常是因保守的氨基酸替換而不同的殘基位置不改變該分子的功能特性，其中氨基酸被具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基替換，這是公認的。當保守替換中的序列有區別時，可將序列一致性百分比向上調節以修正替換的保守性。在這些保守替換中有區別的序列被認為是具有序列相似性或相似性。本領域技術人員周知進行調節的方法。通常，這涉及將保守替換作為部分而不是完全錯配打分，從而提高序列一致性百分比。因此，例如，一致的氨基酸給I分，而非保守替換給O分，保守替換給O和I之間的分數。例如，在程序PC/GENE中執行保守替換的打分(加州山景城的Intelligenetics)
[0138]用比如在Sambrook, J.等人 2000 年 Molecular Cloning:A LaboratoryManual (第三版)中所述的標準分子生物技術可以合成、分離，或操作核酸。技術可以包括克隆、cDNA文庫表達，和mRNA或基因組DNA擴增。本發明的核酸或其序列可以并入包括表達盒或載體的克隆載體中。克隆載體可以是病毒載體、質粒、噬菌體、噬菌粒、柯斯質粒(cosmid)、福斯質粒(fosmid)、細菌噬菌體，或人工染色體。該病毒載體可包括腺病毒載體，逆轉錄病毒載體，或腺相關病毒載體。克隆載體可包括細菌人工染色體(BAC)、質粒、細菌噬菌體Pl衍生載體(PAC)、酵母人工染色體(YAC)，或哺乳動物人工染色體(MAC)。
[0139]核酸能可操作地連接到啟動子。啟動子可以是病毒、細菌、哺乳動物或植物啟動子。啟動子可以是組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子，或環境調控和發育調控啟動子。
[0140]增加蛋白分泌的方法
[0141]本發明的其它方面涉及通過提供能分泌至少一類、至少兩類、展示三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白以響應纖維素類生物質或糖類的本發明的細胞增加來自細胞的蛋白的分泌的方法，及通過使該細胞與纖維素類生物質或糖類接觸誘導該細胞分泌至少兩類、展示三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白。可與本發明的方法一起使用的纖維素類生物質可以包括，但不限于，多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在某些優選實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。
[0142]可與本發明的方法一起使用的糖類包括，但不限于多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖、纖維六糖，和槐糖。在某些優選實施例中，該糖類為纖維二糖。本發明的重組細胞分泌的蛋白的類型包括，但不限于:纖維素誘導蛋白。纖維素誘導蛋白的非限制性例子包括，但不限于:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質。在某些方面，本發明的分泌蛋白由以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCUO7190, NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764,或 NCU05137。
[0143]因此，本發明的某些方面提供增加來自細胞的蛋白的分泌的方法，通過:提供突變細胞，其中該突變細胞在兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突變，或在該細胞中的cre-Ι基因中含有失活性突變；以及使該突變細胞與纖維素類生物質或糖類接觸，其中該纖維素類生物質或糖類誘導該突變細胞分泌蛋白。在某些方面，該纖維素類生物質或糖類誘導該細胞分泌至少兩類、展示三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白。
[0144]在一些方面，增加來自細胞的蛋白分泌的方法包括在存在β-葡萄糖苷酶抑制劑的情況下，誘導該蛋白分泌。優選地，該β_葡萄糖苷酶抑制劑為野尻霉素。
[0145]本發明的其它方面提供增加來自細胞的蛋白的分泌的方法，通過:提供重組細胞，其中與相應非重組細胞中的至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達相比，該重組細胞顯示該兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因的表達下降，或與相應非重組細胞中的cre-Ι基因的表達相比，顯示cre-Ι基因的表達下降；以及使該重組細胞與纖維素類生物質或糖類接觸，其中該纖維素類生物質或糖類誘導該重組細胞分泌蛋白。在某些方面，該纖維素類生物質或糖類誘導該細胞分泌至少兩類、展示三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白。
[0146]降解木質纖維素類生物質的方法 [0147]本發明另外的方面涉及通過提供木質纖維素類生物質、提供本發明的任何突變或重組細胞、通過使該細胞與纖維素類生物質或糖類接觸誘導該細胞分泌至少一類、至少兩類、展示三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白，和使誘導的細胞與木質纖維素類生物質接觸，降解生物質的方法，其中分泌的至少一類、至少兩類、展示三類、至少四類、至少五類，或更多類蛋白降解木質纖維素類生物質。
[0148]木質纖維素類生物質一般指的是含纖維素和緊密結合至木質素的其它碳水化合物的聚合物的植物生物質。合適的木質纖維素類生物質的例子包括，但不限于，植物材料，城市固體廢棄物，城市廢紙，木屑，鋸木廠和造紙廠的廢物，和農業殘余物。適宜的植物材料的例子包括，但不限于，芒草、能源草、象草、柳枝稷、大米草(cord grass)、黑麥草、草蘆(reed canary grass)、蘆華、麥稻(wheat straw)、大麥桿(barley straw)、油菜稻桿、燕麥秸桿、玉米秸、大豆秸、燕麥殼、燕麥(oat spelt)、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、大麥、燕麥、亞麻、亞麻、小麥、亞麻籽、柑橘渣、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆屬植物(lupines)、棕櫚仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾豆膠(gum guar)、黃豆、干酒糟可溶物(Distillers Dried Grains with Solubles、DDGS)、i^ (Blue Stem)、玉米芯、松樹、針葉樹軟木(conifer softwood)、桉樹、樺木、柳樹、山楊(aspen)、白楊(poplar wood)、雜交白楊(hybr i d pop I ar )、能源甘鹿、短周期木本作物、作物殘洛、庭園廢物,及其組合。
[0149]可與本發明的方法一起使用的纖維素類生物質包括，但不限于:多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。在某些優選實施例中，該纖維素類生物質包括纖維二糖。
[0150]可以與本發明的方法一起使用的糖類包括，但不限于多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖、纖維六糖，和槐糖。在某些優選實施例中，該糖類為纖維二糖。本發明的重組細胞分泌的蛋白質的類型包括，但不限于纖維素誘導蛋白。纖維素誘導蛋白的非限制性例子包括，但不限于:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纖維素結合結構域的蛋白質。在某些方面 ，本發明的分泌蛋白由以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764,或 NCU05137。
[0151]在本發明的一些方面，降解木質纖維素類生物質的方法包括在存在β-葡萄糖苷酶抑制劑的情況下，用如上所述的本發明的突變細胞與木質纖維素類生物質接觸的步驟。優選地，該β_葡萄糖苷酶抑制劑為野尻霉素。
[0152]Sffl
[0153]在此描述的方法可以結合降解木質纖維素類生物質的其它方法一起實行。
[0154]例如，木質纖維素類生物質可以進行預處理，該預處理包括氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、用堿性水溶液、酸性溶液、有機溶劑、離子液體(IL)、電解水、磷酸處理，及其組合。將木質素從植物材料移除的預處理可以增加從半纖維素中釋放的糖的總量。
[0155]實施例
[0156]以下的實施例僅僅用于說明，并且不以任何方式限制本發明的任何方面。
[0157]實施例1
[0158]以下實施例涉及在粗糙脈胞菌三個β -葡萄糖苷酶基因缺失菌株和三個β -葡萄糖苷酶和cre-Ι基因缺失菌株中纖維素酶的轉錄和纖維素分解酶的產量的特征。
[0159]材料和方法[0160]菌株
[0161]從真菌遺傳庫存中心(Fungal Genetics Stock Center, FGSC)獲得的菌株包括粗糙脈胞菌野生型(WT) (FGSC2489)、cre-Ι基因缺失體(△ cre-1) (FGSC10372)，以及胞內β-葡萄糖苷酶NCU00130(FGSC11822和FGSCl 1823)和胞外β-葡萄糖苷酶:NCU08755 (FGSC18387 和 FGSC18388)和 NCU04952 (FGSC13731 和 FGSC13732)的缺失菌株。
[0162]用 FGSC(http:1Iwm.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20make%20a%20cross-2, pdf)描述的方法進行序列雜交產生四重缺失體。用基因特異性引物和潮霉素(hph)盒的普通引物確定所有缺失菌株的基因型。用于hph的正向引物為:
[0163]hph Middle FWD:5，_CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’[SEQ ID NO:4]
[0164]反向引物為:
[0165]NCUOO130: 5，-TAG TGT ACA AAC CCC AAG C_3， [SEQ ID NO:5]
[0166]NCU004953: 5，-AAC ACA CAC ACA CAC ACT GG-3’ [SEQ ID NO:6]
[0167]NCU08755: 5’ -ACA GTG GAG GTG AGA AAG G_3’ [SEQ ID NO:7]
[0168]NCU08807: 5，-GTA CTT ACG CAG TAG CGT GG-3’ [SEQ ID NO:8]
[0169]轉錄生長研究
[0170]在含有50ml Vogel’ s鹽和2%(wt/vol)蔗糖的250ml愛倫美氏燒瓶中，當0D595等于0.05時接種菌株，并使菌株在持續光照，200rpm的情況下，生長16小時。接著，使生物質在4000rpm下旋轉10分鐘并用Vogel’s中洗漆兩次以移除任何多余的鹿糖。然后，將該生物質加入含2%(wt/vol)鹿糖 、纖維二糖(Sigma),或Avicei# PHlOl (Avicel?)的50ml新培養物中。在持續光照，200rpm的情況下，誘導培養物4小時。接著通過Whatman玻璃微纖維過濾器(GF/F)過濾在布氏漏斗(Buchner funnel)上收集培養物生物質并用50ml Vogel’s洗滌。生物質在液態氮中速凍并儲存在_80°C。
[0171]RNA 分離
[0172]根據生產商指示，用氧化錯/ 二氧化娃小珠(0.2g,直徑0.5mm ;Biospec)和Min1-Beadbeater-96 (Biospec)以及 ImL TRIzol 試劑(Invitrogen)分離來自冷凍樣品的總 RNA。通過用不含 DNA 的 TURBO (TURBO DNA-free, Ambion)和 RNeasy 試劑盒(Qiagen)消化進一步純化總RNA。通過Nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA完整性。
[0173]實時定量RT-PCR
[0174]用EXPRESS One-Step SYBR GreenER 試劑盒(Invitrogen)和 StepOnePlus 實時PCR系統(Applied Biosystems)進行定量RT-PCR。反應以10 μ I總反應體積，一式三份地進行，其中10 μ I總反應體積包括各300ηΜ的正向引物和反向引物以及75ng模板RNA。通過StepOne軟件(Applied Biosystems)用相對定量/比較CT ( Δ Δ CT)進行數據分析。按鹿糖上表達的內源性對照肌動蛋白(endogenous control actin)作為參考樣品使數據標準化。誤差條代表95%置信區間。使用Tian等人2009年描述的RT-PCR引物。
[0175]肌動蛋白:5’-TGA TCT TAC CGA CTA CCT-3’ [SEQ ID NO:9]
[0176]5’ -CAG AGC TTC TCC TTG ATG-3’ [SEQ ID NO:10]
[0177]CBHI (NCU07340) 5’ -ATC TGG GAA GCG AAC AAA G_3’ [SEQ ID NO: 11] [0178]5’ -TAG CGG TCG TCG GAA TAG-3’ [SEQ ID NO:12]
[0179]CBHII (NCU09680) 5’ -CCC ATC ACC ACT ACT ACC-3’ [SEQ ID NO: 13]
【權利要求】
1.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供突變細胞，其中所述突變細胞包括兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中的失活性突變；以及 (b)將所述突變細胞與纖維素類生物質接觸，其中所述纖維素類生物質誘導所述突變細胞分泌所述蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述突變細胞進一步包括位于該細胞的cre-Ι基因中的失活性突變。
3.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: Ca)提供突變細胞，其中所述突變細胞包括位于該細胞的cre-Ι基因中的失活性突變；以及 (b)將所述突變細胞與纖維素類生物質接觸，其中所述纖維素類生物質誘導所述突變細胞分泌所述蛋白質。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述突變細胞進一步包括位于兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中的失活性突變。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其特征在于，所述纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或多種。
6.根據權利要求1-4 中任意一項所述的方法，其特征在于，所述纖維素類生物質包括纖維二糖。
7.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供突變細胞，其中所述突變細胞包括兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中的失活性突變；以及 (b)將所述突變細胞與糖類接觸，其中所述糖類誘導所述突變細胞分泌所述蛋白質。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述突變細胞進一步包括位于所述細胞的cre-Ι基因中的失活性突變。
9.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供突變細胞，其中所述突變細胞包括位于該細胞的cre-Ι基因中的失活性突變；以及(b)將所述突變細胞與糖類接觸，其中所述糖類誘導所述突變細胞分泌所述蛋白質。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述突變細胞進一步包括位于兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中的失活性突變。
11.根據權利要求7-10中任意一項所述的方法，其特征在于，所述糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。
12.根據權利要求7-10中任意一項所述的方法，其特征在于，所述糖類為纖維二糖。
13.根據權利要求1-12中任意一項所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白為纖維素誘導蛋白。
14.根據權利要求1-13中任意一項所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。
15.根據權利要求1-13中 任意一項所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白為纖維素酶。
16.根據權利要求1-13中任意一項所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
17.根據權利要求1-16中任意一項所述的方法，其特征在于，所述突變細胞進一步包括位于該細胞的至少一種β-甘露糖苷酶基因中的失活性突變。
18.根據權利要求1-17中任意一項所述的方法，其特征在于，所述突變細胞進一步包括位于該細胞的至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中的失活性突變。
19.根據權利要求1-18中任意一項所述的方法，其特征在于，所述失活性突變為缺失。
20.根據權利要求1-19中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞為重組細胞。
21.根據權利要求1-20中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞為真菌或酵母細胞。
22.根據權利要求1-21中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。
23.根據權利要求1-22中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞選自粗糙脈孢菌(N.crassa)細胞、構巢曲霉細胞、里氏木霉細胞、黃孢原毛平革菌細胞、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲霉)細胞、玉米赤霉細胞、核盤菌細胞、灰葡萄孢霉細胞、黑曲霉細胞、產黃青霉細胞、裂褶菌細胞、褐腐菌細胞、米曲霉細胞和解纖維頂孢霉細胞。
24.根據權 利要求1-23中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。
25.根據權利要求1-23中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為四種或更多種葡萄糖苷酶基因。
26.根據權利要求1-23中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。
27.根據權利要求1-23中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。
28.根據權利要求1-23中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。
29.根據權利要求24-28中任意一項所述的方法，其特征在于，所述三種或更多種β-葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
30.根據權利要求1-29中任意一項所述的方法，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。
31.根據權利要求1-29中任意一項所述的方法，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。
32.根據權利要求1-31中任意一項所述的方法，其特征在于，所述至少一種β-甘露糖苷酶基因為NCU00890。
33.根據權利要求1-32中任意一項所述的方法，其特征在于，所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。
34.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供重組細胞，其中與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相t匕，所述重組細胞中所述至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達顯示出下降；以及 (b)將所述重組細胞與纖維素類生物質接觸，所述纖維素類生物質誘導所述重組細胞分泌所述蛋白質。
35.根據權利要求34所述的方法，其特征在于，與相應非重組細胞中的cre-Ι基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出cre-Ι基因的表達下降。
36.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供重組細胞，其中與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，所述重組細胞顯示出cre-Ι基因的表達下降；以及 (b)將所述重組細胞與纖維素類生物質接觸，其中所述纖維素類生物質誘導所述重組細胞分泌所述蛋白質。
37.根據權利要求36所述的方法，其特征在于，與相應非重組細胞中至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出所述至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降。
38.根據權利要求34-371中任意一項所述的方法，其特征在于，所述纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖 維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。
39.根據權利要求34-37中任意一項所述的方法，其特征在于，所述纖維素類生物質包括纖維二糖。
40.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供重組細胞，其中與相應非重組細胞中的至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞顯示出所述至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降；以及 (b)將所述重組細胞與糖類接觸，其中所述糖類誘導所述重組細胞分泌所述蛋白質。
41.根據權利要求40所述的方法，其特征在于，與相應非重組細胞中的cre-Ι基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出cre-Ι基因的表達下降。
42.一種增加來自細胞的蛋白質的分泌的方法，所述方法包括: Ca)提供重組細胞，其中與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，所述重組細胞顯示出cre-Ι基因的表達下降；以及 (b)將所述重組細胞與糖類接觸，其中所述糖類誘導突變細胞分泌所述蛋白質。
43.根據權利要求42所述的方法，其特征在于，與相應非重組細胞中至少兩種β-葡萄糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出所述至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降。
44.根據權利要求40-43中任意一項所述的方法，其特征在于，所述糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。
45.根據權利要求40-43中任意一項所述的方法，其特征在于，所述糖類為纖維二糖。
46.根據權利要求34-45中任意一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素誘導蛋白。
47.根據權利要求34-46中任意一項所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。
48.根據權利要求34-46中任意一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素酶。
49.根據權利要求34-46中任意一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
50.根據權利要求34-49中任意一項所述的方法,其特征在于,creA/cre-Ι的功能通過使顯性失活突變或蛋白抑制劑過表達而降低。
51.根據權利要求34-50中任意一項所述的方法，其特征在于，與相應非重組細胞中至少一種甘露糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出所述至少一種甘露糖苷酶基因的表達下降。
52.根據權利要求34-51中任意一項所述的方法，其特征在于，與相應非重組細胞中磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出所述磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達下降。
53.根據權利要求34-52中任意一項所述的方法，其特征在于，通過siRNA、反義DNA、抑制，或減數分裂沉 默降低基因表達。
54.根據權利要求34-53中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。
55.根據權利要求34-53中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為四種或更多種葡萄糖苷酶基因。
56.根據權利要求34-53中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。
57.根據權利要求34-53中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。
58.根據權利要求34-53中任意一項所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。
59.根據權利要求54-58中任意一項所述的方法，其特征在于，所述三種或更多種β-葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
60.根據權利要求34-59中任意一項所述的方法，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。
61.根據權利要求34-59中任意一項所述的方法，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。
62.根據權利要求34-61中任意一項所述的方法，其特征在于，所述至少一種β-甘露糖苷酶基因為NCU00890。
63.根據權利要求34-62中任意一項所述的方法，其特征在于，所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。
64.根據權利要求34-63中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞為穩定細胞系或瞬時轉染的細胞。
65.根據權利要求34-64中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞為真菌或酵母細胞。
66.根據權利要求34-65中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。
67.根據權利要求34-66中任意一項所述的方法，其特征在于，所述細胞選自粗糙脈孢菌(N.crassa)細胞、構巢曲霉細胞、里氏木霉細胞、黃孢原毛平革菌細胞、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲霉)細胞、玉米赤霉細胞、核盤菌細胞、灰葡萄孢霉細胞、黑曲霉細胞、產黃青霉細胞、裂褶菌細胞、褐腐菌細胞、米曲霉細胞和解纖維頂孢霉細胞。
68.一種突變細胞，所述突變細胞包括位于兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中的失活性突變，其中，與在所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平的蛋白質。
69.根據權利要求68所述的突變細胞，其特征在于，在所述突變細胞的cre-Ι基因中進一步包括失活性突變，其中與在cre-Ι基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平的蛋白質。
70.根據權利要求68或權 利要求69所述的突變細胞，其特征在于，在所述突變細胞的至少一種β_甘露糖苷酶基因中進一步包括失活性突變，其中與在至少一種β_甘露糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平的蛋白質。
71.根據權利要求68-70中任意一項所述的突變細胞，其特征在于，在所述突變細胞的至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中進一步包括失活性突變，其中與在所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述細胞分泌更高水平的蛋白質。
72.根據權利要求68-71中任意一項所述的突變細胞，其特征在于，所述纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。
73.根據權利要求68-71中任意一項所述的突變細胞，其特征在于，所述纖維素類生物質包括纖維二糖。
74.一種突變細胞，在該突變細胞的兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中包括失活性突變，其中與在所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，糖類能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平的蛋白質。
75.根據權利要求74所述的突變細胞，其特征在于，在所述突變細胞的cre-Ι基因中進一步含有失活性突變，其中與在所述cre-Ι基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，糖類能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平 的蛋白質。
76.根據權利要求74或權利要求75所述的突變細胞，其特征在于，在所述突變細胞的至少一種β_甘露糖苷酶基因中進一步包括失活性突變，其中與在所述至少一種β_甘露糖苷酶基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，糖類能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平的蛋白質。
77.根據權利要求74-76中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，在所述突變細胞的至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中進一步包括失活性突變，其中與在所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因中缺乏所述突變的相應細胞相比，糖類能夠誘導所述突變細胞分泌更高水平的蛋白質。
78.根據權利要求74-77中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。
79.根據權利要求74-77中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述糖類為纖維二糖。
80.根據權利要求68-79中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素誘導蛋白。
81.根據權利要求68-80中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，分泌的蛋白質選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。
82.根據權利要求 68-80中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素酶。
83.根據權利要求68-80中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，分泌的蛋白質由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
84.根據權利要求68-83中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述失活性突變為缺失。
85.根據權利要求68-84中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述細胞為重組細胞。
86.根據權利要求68-85中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述細胞為真菌或酵母細胞。
87.根據權利要求68-86中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。
88.根據權利要求68-87中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述細胞選自粗糙脈孢菌(N.crassa)細胞、構巢曲霉細胞、里氏木霉細胞、黃孢原毛平革菌細胞、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲霉)細胞、玉米赤霉細胞、核盤菌細胞、灰葡萄孢霉細胞、黑曲霉細胞、產黃青霉細胞、裂褶菌細胞、褐腐菌細胞、米曲霉細胞和解纖維頂孢霉細胞。
89.根據權利要求68-88中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。
90.根據權利要求68-88中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為四種或更多種β-葡萄糖苷酶基因。
91.根據權利要求68-88中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。
92.根據權利要求68-88中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。
93.根據權利要求68-88中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述兩種或更多種β-葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。
94.根據權利要求89-93中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述三種或更多種葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
95.根據權利要求68-94中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄糖苷酶。
96.根據權利要求68-94中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。
97.根據權利要求68-96中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述至少一種β -甘露糖苷酶基因為NCU00890。
98.根據權利要求68-97中任何一項所述的突變細胞，其特征在于，所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。
99.一種重組細胞，與相 應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞顯示出所述至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述至少兩種β -葡萄糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
100.根據權利要求99中所述的重組細胞，其特征在于，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出cre-Ι基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述cre-Ι基因表達不下降的相應非重組細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
101.根據權利要求100中所述的重組細胞，其特征在于，creA/cre-Ι的功能通過顯性失活突變或蛋白抑制劑的過表達而降低，其中與顯性失活突變沒有過表達的相應細胞相t匕，纖維素類生物質能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
102.根據權利要求99-101中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，與相應非重組細胞中至少一種甘露糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞顯示出所述至少一種甘露糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述至少一種甘露糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
103.根據權利要求99-102中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，與相應非重組細胞中至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的 表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因表達不下降的非重組細胞相比，纖維素類生物質能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
104.根據權利要求99-103中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。
105.根據權利要求99-103中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述纖維素類生物質包括纖維二糖。
106.一種重組細胞，與相應非重組細胞中至少兩種葡萄糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞顯示出所述至少兩種β -葡萄糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述至少兩種β -葡萄糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞相比，糖類能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
107.根據權利要求106所述的重組細胞，其特征在于，與相應非重組細胞中cre-Ι基因的表達相比，所述重組細胞顯示出cre-Ι基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述cre-Ι基因表達不下降的相應非重組細胞相t匕，糖類能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
108.根據權利要求107所述的重組細胞，其特征在于，creA/cre-Ι的功能通過顯性失活突變或蛋白抑制劑的過表達而降低，其中與顯性失活突變沒有過表達的相應細胞相比，糖類能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
109.根據權利要求106-108中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，與相應非重組細胞中至少一種甘露糖苷酶基因的表達相比，所述重組細胞顯示出所述至少一種β -甘露糖苷酶基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述至少一種甘露糖苷酶基因表達不下降的相應非重組細胞相比，糖類能夠誘導所述重組 細胞分泌更高水平的蛋白質。
110.根據權利要求106-109中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，與相應非重組細胞中至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達相比，所述重組細胞進一步顯示出所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因的表達下降，其中通過siRNA、反義DNA、抑制或減數分裂沉默來降低所述表達，并且與所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因表達不下降的非重組細胞相比，糖類能夠誘導所述重組細胞分泌更高水平的蛋白質。
111.根據權利要求106-110中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。
112.根據權利要求106-110中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述糖類為纖維二糖。
113.根據權利要求99-112中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素誘導蛋白。
114.根據權利要求99-113中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，分泌的蛋白質選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。
115.根據權利要求99-113中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素酶。
116.根據權利要求99-113中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，分泌的蛋白質由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
117.根據權利要求99-116中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為三種或更多種葡萄糖苷酶基因。
118.根據權利要求99-116中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為四種或更多種葡萄糖苷酶基因。
119.根據權利要求99-116中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為五種或更多種葡萄糖苷酶基因。
120.根據權利要求99-116中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為六種或更多種葡萄糖苷酶基因。
121.根據權利要求99-116中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述兩種或更多種葡萄糖苷酶基因為七種或更多種葡萄糖苷酶基因。
122.根據權利要求117-121中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述三種或更多種葡萄糖苷酶基因、四種或更多種葡萄糖苷酶基因、五種或更多種葡萄糖苷酶基因、六種或更多種葡萄糖苷酶基因，或七種或更多種葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
123.根據權利要求99-122中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞內葡萄 糖苷酶。
124.根據權利要求99-122中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，至少一種β-葡萄糖苷酶基因編碼胞外葡萄糖苷酶。
125.根據權利要求99-124中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述至少一種β -甘露糖苷酶基因為NCU00890。
126.根據權利要求99-125中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述至少一種磷脂酶基因或磷脂酶類基因為NCU06650。
127.根據權利要求99-126中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述細胞為穩定細胞系或瞬時轉染的細胞。
128.根據權利要求99-127中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述細胞為真菌或酵母細胞。
129.根據權利要求99-128中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述細胞為子囊菌和擔子菌物種的絲狀真菌。
130.根據權利要求99-129中任何一項所述的重組細胞，其特征在于，所述細胞選自粗糙脈孢菌(N.crassa)細胞、構巢曲霉細胞、里氏木霉細胞、黃孢原毛平革菌細胞、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲霉)細胞、玉米赤霉細胞、核盤菌細胞、灰葡萄孢霉細胞、黑曲霉細胞、產黃青霉細胞、裂褶菌細胞、褐腐菌細胞、米曲霉細胞和解纖維頂孢霉細胞。
131.一種降解生物質的方法，所述方法包括: (a)提供木質纖維素類生物質；(b)提供權利要求68-130中任何一項所述的細胞，或提供在cre-Ι基因中含有失活性突變的細胞； (c)通過用纖維素類生物質接觸所述細胞，誘導所述細胞分泌蛋白質；以及 (d)用木質纖維素類生物質接觸經過誘導的細胞，其中，分泌的蛋白質降解所述木質纖維素類生物質。
132.根據權利要求131所述的方法，其特征在于，所述纖維素類生物質包括多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖中的一種或更多種。
133.根據權利要求131所述的方法，其特征在于，所述纖維素類生物質包括纖維二糖。
134.一種降解生物質的方法，所述方法包括: (a)提供木質纖維素類生物質； (b)提供權利要求68-130中任何一項所述的細胞，或提供在cre-Ι基因中含有失活性突變的細胞； (c)用糖類接觸所述細胞誘導所述細胞分泌蛋白質；以及 (d)用木質纖維素類生物質接觸經過誘導的細胞，其中，分泌的蛋白質降解所述木質纖維素類生物質。
135.根據權利要求134所述的方法，其特征在于，所述糖類選自多糖，低聚糖，纖維素，微晶纖維素，纖維 糊精，纖維二糖，纖維三糖，纖維四糖，纖維五糖，和纖維六糖。
136.根據權利要求134所述的方法，其特征在于，所述糖類為纖維二糖。
137.根據權利要求131-136中任何一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素誘導蛋白。
138.根據權利要求131-137中任何一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質選自:纖維素酶、GH61酶、纖維二糖脫氫酶、內酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纖維素結合結構域的蛋白質，及其組合。
139.根據權利要求131-137中任何一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質為纖維素酶。
140.根據權利要求131-137中任何一項所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白質由選自以下的基因編碼:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
【文檔編號】C12P21/00GK103890168SQ201280023229
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年3月15日 優先權日:2011年3月15日
【發明者】伊麗莎白·A.·茲納米羅斯基, 詹姆斯·H.·多德納-凱特, N.·路易斯·格拉斯 申請人:加利福尼亞大學董事會