用于載物遞送進入細胞的系統的制作方法
【專利摘要】本發明涉及命名為NickFect的用于細胞內載物遞送的系統，該系統包括至少一種組分A，其共價地連接至細胞穿透肽B和/或肽或非肽構建體C。所述遞送系統NickFect涉及與載物非共價或共價復合的化學修飾的新的細胞穿透肽（CPP），用于有效的細胞遞送。
【專利說明】用于載物遞送進入細胞的系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及命名為NickFect的用于細胞內載物(cargo)遞送的系統，該系統包含至少一種組分A，其共價連接至細胞穿透肽B和/或肽或非肽構建體C。所述遞送系統NickFect涉及與載物非共價或共價復合(絡合)的化學修飾的新的細胞穿透肽(CPP)用于有效的細胞遞送。更精確地，本發明涉及包含無毒性的肽遞送載體的建構物(構建體)，其具有增加的穩定性且更有效地從胞內溶酶體逃脫并且其能夠與載物形成穩定的復合物(絡合物)，其在血清的存在下保持完整。
[0002]本發明涉及一種遞送系統，其具有所形成的納米顆粒的整體負電荷，用于寡核苷酸遞送。
[0003]本發明還涉及一種遞送系統，其包含分支的CPP，其中脂肪酸修飾的TPlO或它的部分通過賴氨酸或它們的類似物的a、0、Y、e-氨基連接至兩親性肽和/或a-螺旋肽或肽片段。
[0004]此外，本發明涉及用于體外或體內將載物(RNA、DNA、藥物、質粒、小環(minicircles)等)遞送進入祀細胞的細胞質或細胞核的方法。本發明還涉及該系統在疾病的診斷中作為研究工具和作為靶向系統的用途、包含上述系統的組合物特別是藥物組合物、以該系統覆蓋的材料以及具有進入材料的遞送系統的材料。最后還涉及新的細胞穿透肽。
【背景技術】
[0005]疏水性細胞膜是封閉細胞內容物的脂雙層。它的功能是作為屏障:通常，僅小的和/或疏水性分子可以穿過，并且防止其它大分子如裸露DNA、RNA或蛋白質進入細胞內部。雖然在過去的十年中設計了幾種策略來解決此問題，但不能穿過質膜仍然是成就目前的藥物研究和開發(R&D)要克服的主要障礙之一。
[0006]在過去的40年中，已開發了若干種目的在于調芐基因表達的基于寡核苷酸(ON)的方法。除了其它因素以外，這類方法的效率還取決于ON有效攝取進入細胞以及隨后的內體逃逸。用于基因調節的其它最基本的方法涉及使用細菌載體來表達感興趣的基因。除了評價不同基因的功能方面以外，極具吸引力的策略是在臨床環境中利用，即基因治療。最初考慮基因治療用于遺傳性基因疾病的矯正治療，例如，通過剪接-校正寡核苷酸。然而，在過去的15年中，用于癌癥疾病的實驗性基因治療已成為最常見的應用，雖然也已經研究了其它獲得性疾病[I]。
[0007]已經出現利用較短ON序列來干擾基因表達的其它通用策略。最近已嚴格地開發了基于雙鏈RNA分子的、長度為20-25個核苷酸的干擾RNA (siRNA)的反義方法，將其用于進行基因沉默或剪接校正ON (SC0)，并用于操作剪接模式[2，3]。雖然是用于調芐基因表達的有效生物分子，但它們的親水性本性和大小(在大小超過IMDa的質粒的情況下)會阻止細胞內化。
[0008]因此，為了促進目前的基因治療，需要各種細胞遞送系統來將不同分子轉運進入細胞，但它們的大多數具有一些缺點，如高細胞毒性、固有的免疫原性、低轉染效率等(表I)。
[0009]表1:遞送載體
[0010]
【權利要求】
1.一種包括細胞穿透肽B的用于載物遞送進入細胞的系統，所述系統可以包括共價連接的組分A和共價或非共價連接的肽或非肽構建體C，作為用于將載物遞送進入細胞的靶向部分。
2.根據權利要求1所述的系統，其中，肽B包括化學修飾的細胞穿透肽TP10，所述細胞穿透肽TPlO具有共價連接至主鏈的任何脂肪酸(例如硬脂酸)。
3.根據權利要求1-2所述的系統,其中，由Lys、Orn>Thr> Ser> Asp或Glu取代在位置3處的Tyr。
4.根據權利要求1-3所述的系統,其中，由Lys、Orn、Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu或任何其它親水性氨基酸取代在位置8處的He。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的系統，其中，由亮氨酸的異構體和/或類似物(例如正亮氨酸)取代至少一個Leu。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的系統，其中，由賴氨酸的異構體和/或類似物(例如鳥氨酸)取代至少一個賴氨酸。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的系統，其中，肽B是包含通過賴氨酸或它們的類似物的a、0、Y、S、e -氨基連接至兩親性肽和/或a -螺旋肽和/或肽片段(例如NPY、P物質、緩激肽、模型序列如(Ala-Leu)n、TP10、甘丙肽、肥大脫粒肽)的脂肪酸修飾的TPlO肽和/或它的片段(例如甘丙肽、肥大脫粒肽)的分支肽。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的遞送系統，其中，將一個或多個組分A直接地或通過間隔子連接至肽B。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的遞送系統，其中，連接的組分A可以是不同的。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的系統，其中，組分A包含磷酸基(PO3)或任何帶負電荷的部分(選自由Asp、Glu、碳水化合物但不限于此組成的組中)或者甚至可以是具有整體負電荷的肽序列。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的系統，包含至少一種組分C，所述組分C是靶向部分。
12.根據權利要求11所述的系統，其中，所述靶向部分是細胞或腫瘤歸巢肽、適體、受體配體、包含連接至失活肽的可切割位點的間隔子、肽配體、細胞毒性肽、用于已知或未知受體的生物活性肽配體、選擇性地結合至某種組織或細胞類型的肽序列、或核定位序列(NLS)。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的系統，進一步包括載物，其中一種或多種載物共價地和/或非共價地連接至組分B。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的系統，其中，將一種或多種組分A、一種或多種組分C以及一種或多種載物連接至肽B。
15.根據權利要求1-14中任一項所述的系統，包含一種以上的肽B。
16.根據權利要求1-15中任一項所述的系統，其中，使用間隔臂來連接至少一種組分C和載物。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的系統，其中，所述載物選自由以下各項組成的組中但不限于此:寡核苷酸和其修飾變體，包括單鏈寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA和它們的類似物)、雙鏈寡核苷酸(siRNA、shRNA、誘餌DNA);質粒和其其它變體；合成核苷酸類似物。
18.根據權利要求1-16中任一項所述的系統，其中，所述載物選自由以下各項組成的組中:細胞或腫瘤歸巢肽、適體、受體配體、包含連接至失活肽的可切割位點的間隔子、肽配體、細胞毒性肽、生物活性肽、抗體、診斷劑、蛋白質、藥物例如抗癌藥物或抗生素。
19.根據權利要求1-17中任一項所述的系統，進一步包括至少一種顯像劑和/或標記分子。
20.根據權利要求1-19中任一項所述的系統，包含在連接循環中的清除調節劑，如PEG。
21.根據權利要求1-20中任一項所述的系統，其中，所形成的肽B和載物納米顆粒的總表面電荷是負的。
22.—種組合物，包含一種以上的根據權利要求1-21中任一項所述的遞送系統。
23.根據權利要求1-22中任一項所述的系統在疾病的診斷中作為研究工具、作為靶向系統和作為藥物組合物的用途 。
【文檔編號】C12N15/87GK103813808SQ201280018078
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年2月22日 優先權日:2011年2月22日
【發明者】厄洛·朗格爾, 皮雷特·阿魯庫斯科, 尼基塔·奧斯科爾科夫, 達娜·瑪麗亞·科波洛維奇 申請人:派普菲克斯公司