克魯維酵母屬的突變體酵母和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法
【專利摘要】將屬于克魯維酵母屬的酵母進行改變以提高來自木糖的乙醇收率。減弱屬于克魯維酵母屬的酵母中的選自來源于馬克斯克魯維酵母的ADH1基因、與該ADH1基因在功能上等價的基因、來源于馬克斯克魯維酵母的ADH4基因、和與該ADH4基因在功能上等價的基因中的至少一種基因。
【專利說明】克魯維酵母屬的突變體酵母和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及利用了克魯維酵母屬(Kluyveromyces)酵母的突變體酵母和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法。
【背景技術】[0002]包含木素纖維素的生物質可以作為乙醇等有用醇和/或有機酸的原料而被有效地利用。包含木素纖維素的生物質包括木質系生物質和草本系生物質。木質系生物質等包含木素纖維素的生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素構成。為了由包含木素纖維素的生物質制造乙醇等液體燃料，將纖維素和/或半纖維素水解(糖化)至構成單糖，通過發酵而將單糖轉換為乙醇。纖維素由葡萄糖構成，半纖維素主要由阿拉伯糖和木糖構成。因此，在利用包含木素纖維素的生物質制造乙醇時，期望不僅葡萄糖，連木糖也作為發酵的底物而被有效地利用。
[0003]另外，在由包含木素纖維素的生物質制造乙醇時，如果能夠將上述的糖化反應和發酵反應同時(不區分各反應工序地)進行，則可以實現制造成本的減低。將該方法稱為同時糖化發酵方法。同時糖化發酵中，需要具有能夠在糖化酶的反應溫度區域(約40°C以上)發酵的耐熱性、不僅能夠利用葡萄糖還能夠利用5碳單糖木糖作為底物的微生物。
[0004]作為具有耐熱性的酵母，已知馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)等克魯維酵母屬(Kluyveromyces)酵母。該克魯維酵母屬酵母能夠利用木糖進行乙醇發酵，但其收率不充分。例如，非專利文獻I和2中關于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的醇脫氫酶基因(包含多個異構體)報告了功能分析。另外，專利文獻I中公開了被賦予了將木糖異構化為木酮糖的能力的重組酵母，還記載了減少醇脫氫酶活性。但是，由這些知識不能判斷通過醇脫氫酶基因的缺失和/或破壞會對乙醇發酵能力有怎樣的影響。并且，不能判斷作為分類學上不同的種的馬克斯克魯維酵母等克魯維酵母屬酵母中的醇脫氫酶基因的功能。
[0005]現有技術文獻
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻1:日本特表2005-514951號公報
[0008]非專利文獻
[0009]非專利文獻1:FEMS Yeast Research2, (2002) ρ.481-494
[0010]非專利文獻2:FEMS Yeast Research8, (2008) ρ.967-978
【發明內容】
[0011]發明要解決的課題
[0012]如上所述，克魯維酵母屬酵母具有木糖同化性且具有耐熱性，因而被較大地期待作為在上述的同時糖化發酵法等中有用的微生物。但是，克魯維酵母屬酵母來自木糖的乙醇收率非常差，另外也不知曉改善該收率的手段。因此，本發明鑒于這樣的事實，目的在于提供以提高來自木糖的乙醇收率的方式進行了改變而得的屬于克魯維酵母屬的突變體酵母、和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法。
[0013]用于解決課題的方法
[0014]為了實現上述目的，本
【發明者】們進行了深入研究，結果發現，通過減弱克魯維酵母屬酵母中的多個醇脫氫酶基因中的特定的基因，從而該酵母中的來自木糖的乙醇收率大幅提高，從而完成了本發明。即，本發明包含以下(I)-(6)。
[0015](I)突變體酵母，減弱了屬于克魯維酵母屬的酵母中的選自來源于馬克斯克魯維酵母的ADHl基因、與該ADHl基因在功能上等價的基因、來源于馬克斯克魯維酵母的ADH4基因、和與該ADH4基因在功能上等價的基因中的至少一種基因。
[0016](2)根據(I)所述的突變體酵母，其特征在于，所述屬于克魯維酵母屬的酵母是馬克斯克魯維酵母。
[0017](3)根據(I)所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADHl基因在功能上等價的基因來源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(C)的任一蛋白質，
[0018](a)包含序列號2的氨基酸序列的蛋白質，
[0019](b)包含相對于序列號2的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質，
[0020](c)包含相對于序列號2的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了 I-多個氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質。
[0021](4)根據(I)所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADH4基因在功能上等價的基因來源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(C)的任一蛋白質，
[0022](a)包含序列號4的氨基酸序列的蛋白質，
[0023](b)包含相對于序列號4的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質，
[0024](c)包含相對于序列號4的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了 I-多個氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質。
[0025](5)乙醇的制造方法，其包括以下工序:
[0026]用含木糖的培養基來培養(I)-(4)的任一項所述的突變體酵母的培養工序，和
[0027]然后，從培養基回收乙醇的回收工序。
[0028](6)根據(5)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，將所述培養工序在包含所述突變體酵母、含木素纖維素的生物質和糖化酶的反應體系中進行。
[0029]本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本專利申請2011-076715號的說明書和/或附圖所記載的內容。
[0030]發明的效果
[0031]本發明的突變體酵母來自葡萄糖的乙醇收率幾乎不變，來自木糖的乙醇收率大幅提高。因此，本發明的突變體酵母可以在包含例如來源于木質系生物質等包含木素纖維素的生物質的木糖的培養基中高收率地制造乙醇。[0032]本發明的乙醇的制造方法通過利用來自木糖的乙醇收率大幅提高了的突變體酵母，從而可以大幅提高乙醇制造效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1是顯示用含木糖的培養基培養4種ADH破壞株時的培養基中的木糖濃度變化的特性圖。
[0034]圖2是顯示用含木糖的培養基培養4種ADH破壞株時的培養基中的乙醇濃度變化的特性圖。
[0035]圖3是顯示用含木糖的培養基培養4種ADH破壞株時的菌體濃度變化的特性圖。
[0036]圖4是顯示用含葡萄糖的培養基培養4種ADH破壞株時的培養基中的木糖醇濃度變化的特性圖。
[0037]圖5是顯示用含葡萄糖的培養基培養4種ADH破壞株時的培養基中的乙醇濃度變化的特性圖。
[0038]圖6是顯示用含葡萄糖的培養基培養4種ADH破壞株時的菌體濃度變化的特性圖。
[0039]圖7是顯示來源于釀酒酵母(S.cerevisiae)的ADHl與來源于馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)的 ADHl 之間的比對(alignment)白勺圖。
[0040]圖8是顯示來源于釀酒酵母的ADHl與來源于馬克斯克魯維酵母的ADH2之間的比對的圖。
[0041]圖9是顯示來源于釀酒酵母的ADHl與來源于馬克斯克魯維酵母的ADH3之間的比對的圖。
[0042]圖10是顯示來源于釀酒酵母的ADHl與來源于馬克斯克魯維酵母的ADH4之間的比對的圖。
[0043]圖11是顯示來源于釀酒酵母的ADH2與來源于馬克斯克魯維酵母的ADHl之間的比對的圖。
[0044]圖12是顯示來源于釀酒酵母的ADH2與來源于馬克斯克魯維酵母的ADH2之間的比對的圖。
[0045]圖13是顯示來源于釀酒酵母的ADH2與來源于馬克斯克魯維酵母的ADH3之間的比對的圖。
[0046]圖14是顯示來源于釀酒酵母的ADH2與來源于馬克斯克魯維酵母的ADH4之間的比對的圖。
[0047]圖15是顯示來源于釀酒酵母的ADHl與來源于釀酒酵母的ADH2之間的比對的圖。【具體實施方式】
[0048]本發明的突變體酵母具有以下特征:減弱了克魯維酵母屬酵母中的特定醇脫氫酶基因，來自木糖的乙醇收率提高了。[0049]這里，克魯維酵母屬酵母是包含K.aestuari1、K.africanus、K.bacillisporus、K.blattae、多布克魯維酵母(K.dobzhanskii)、湖北克魯維酵母(K.hubeiensis)、乳酸克魯維酵母(K.1actis)、K.lodderae、馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)、非發酵克魯維酵母(K.nonfermentans)、K.piceae、中國克魯維酵母(K.sinensis)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans) > K.walti1、威克海姆克魯維酵母(K.wickerhamii)和亞羅克魯維酵母(K.yair0Wii)等酵母的含義。即，本發明的突變體酵母可以通過對這些具體的克魯維酵母屬酵母及其突變體減弱特定的醇脫氫酶基因來制作。作為克魯維酵母屬酵母，特別優選使用作為耐熱性酵母已知的馬克斯克魯維酵母。作為馬克斯克魯維酵母，不特別限定，可以使用在保藏機構能夠分售地保存的公知株，另外還可以使用由公知株衍生的突變株。作為馬克斯克魯維酵母的公知株，可列舉馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株。作為由公知株衍生的突變株，可例示例如，為了對馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株付與營養缺陷型而破壞ura3基因和/或leu2基因而得的株。
[0050]本發明的突變體酵母中減弱了特定的醇脫氫酶基因。這里“基因的減弱”是包含降低該基因的表達量、降低由該基因編碼的酶的活性這兩方面。例如，通過使特定的醇脫氫酶基因破壞或缺失的方法、使該基因的表達控制區(啟動子等)破壞或缺失的方法、表達針對該基因的反義RNA的方法等，可以降低該基因的表達量。另外，應用所謂轉座子法、轉基因法、轉錄后基因沉默法、RNAi法、無義介導的降解(Nonsense mediated decay, NMD)法、核酶法、反義法、miRNA(微小 RNA, micro-RNA)法、siRNA(小干擾 RNA, small interferingRNA)法等，可以減低該基因的表達量。進而，通過使醇脫氫酶的抑制劑作用的方法等，可以降低由該基因編碼的酶的活性。此外，還可以組合這些方法，來減弱特定的醇脫氫酶基因。
[0051]另外，本發明的突變體酵母具有來自木糖的乙醇收率提高了的特征。換言之，本發明的突變體酵母具有木糖代謝能力提高了的特征。這里，木糖代謝能力是指將培養基所含的木糖代謝而形成醇的發酵 反應的效率。因此，木糖代謝能力的提高，與提高該發酵反應的反應效率成為同義。酵母的木糖代謝能力可以通過用含木糖的培養基進行培養，對產生的醇進行定量來評價。另外，酵母的木糖代謝能力可以以例如培養基所含的木糖的攝入速度(消耗速度)為指標來評價。木糖的攝入速度可以通過經時地測定培養開始時已知濃度的木糖的減少量來計算。
[0052]減弱的醇脫氫酶基因是存在于克魯維酵母屬酵母中的多個醇脫氫酶基因中的特定的醇脫氫酶基因。具體地，醇脫氫酶基因在馬克斯克魯維酵母中已知4個種類(KmADHl-KmADH4)。在馬克斯克魯維酵母中減弱的醇脫氫酶基因是它們中的KmADHl基因和/或KmADH4基因。在除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母中減弱的醇脫氫酶基因是與KmADHl基因在功能上等價的ADH基因和/或與KmADH4基因在功能上等價的ADH基因。
[0053]在除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母中，與KmADHl基因在功能上等價的ADH基因和與KmADH4基因在功能上等價的ADH基因可以通過現有公知的方法來鑒定。例如，首先，在除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母中特定多個醇脫氫酶基因。而且，從由這些基因編碼的醇脫氫酶中，特定具有與由KmADHl基因編碼的醇脫氫酶的氨基酸序列序列類似性最高的氨基酸序列的醇脫氫酶。這樣特定的醇脫氫酶基因，可以特定為與馬克斯克魯維酵母中的KmADHl基因在功能上等價的基因。此外，在特定與KmADH4基因在功能上等價的基因時也是同樣的。這里，序列類似性的值是指使用安裝了 BLAST(序列局部比對查詢工具，Basic Local Alignment Search Tool)程序的計算機以默認的設定求出的值。
[0054]這里，KmADHl基因的編碼區的堿基序列和由KmADHl基因編碼的醇脫氫酶的氨基酸序列分別不于序列號I和2。另外，KmADH4基因的編碼區的喊基序列和由KmADH4基因編碼的醇脫氫酶的氨基酸序列分別示于序列號3和4。
[0055]此外，存在于馬克斯克魯維酵母中的這些KmADHl基因和KmADH4基因不限于以上的具體的堿基序列和氨基酸序列。即，KmADHl基因和KmADH4基因只要編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質，還包含編碼含有分別相對于序列號2和4所示的氨基酸序列具有80%以上、優選為85%以上、更優選為90%以上、進一步優選為95%以上、最優選為98%以上的序列類似性的氨基酸序列的蛋白質的基因。這里，序列類似性的值是指使用安裝了 BLAST (BasicLocal Alignment Search Tool)程序的計算機以默認的設定求出的值。
[0056]另外，KmADHl基因和KmADH4基因只要編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質，還包含編碼含有分別對序列號2和4所示的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了 I個或多個(例如2-35個、優選為2-30個、更優選為2-20個、進一步優選為2-10個)氨基酸的氨基酸序列的蛋白質。
[0057]進而，KmADHl基因和KmADH4基因只要編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質，則也包含相對于分別包含序列號 I和3所示的堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸的一部分或全部在嚴格條件下雜交的多核苷酸。這里，嚴格條件是指具有90%左右、優選為95%、進一步優選為98%的同一性的一對多核苷酸形成特異性雜交的條件(溫度條件、鹽濃度條件)。
[0058]<乙醇制造>
[0059]通過利用以上所說明的突變體酵母，可以進行以木糖等糖為底物的乙醇發酵。特別是，上述的本發明的突變體酵母具有優異的木糖代謝能力，即來自木糖的乙醇收率優異，因而適合利用了含木糖的培養基的乙醇發酵。含木糖的培養基是克魯維酵母屬酵母能夠生長的培養基，是指至少含有木糖作為成為乙醇合成的底物的糖成分的培養基。此外，含木糖的培養基還可以含有除了木糖以外的糖成分，例如葡萄糖。
[0060]對含木糖的培養基不特別限定，可以通過在SD培養基、YPD培養基、YPAD培養基、YM培養基和含Yeast Nitrogen Base的各種合成培養基中添加木糖，或者將這些公知培養基所含的糖成分替換成木糖來制備。
[0061]另外，還可以從木質系生物質、草本系生物質這樣的包含木素纖維素的生物質制備含木糖的培養基。即，將包含木素纖維素的生物質所含的纖維素、半纖維素進行糖化處理，使用所得的處理物作為含木糖的培養基。作為糖化處理不特別限定，可以毫不限制地利用現有公知的方法。作為糖化方法，可列舉例如，利用稀硫酸或濃硫酸的硫酸法、利用纖維素酶、半纖維素酶的酶法等。另外，可以在糖化處理之前，對木質系生物質、草本系生物質實施現有公知的前處理。作為前處理不特別限定，可列舉例如，將木質素用微生物分解的處理，木質系生物質、草本系生物質的粉碎處理，浸潰在離子液體、堿溶液中緩和結構的處理，用高溫水進行蒸煮的水熱處理，利用氨的處理等。
[0062]特別是，在由馬克斯克魯維酵母制作的突變體酵母中，耐熱性特別優異，因而可以在例如40°C上、優選為35-48°C、更優選為40-42°C這樣的比較高溫度下進行乙醇發酵。這樣的溫度區域是纖維素酶、半纖維素酶這樣的糖化酶也顯示活性的溫度區域。因此，該突變體酵母適合利用了糖化酶的所謂同時糖化發酵。這里，同時糖化發酵是指將利用糖化酶的木質系生物質的糖化處理、和來自木糖的乙醇發酵處理在同一反應體系中進行的處理。更具體地，將含有木質系生物質、糖化酶和突變體酵母的溶液在例如40°C這樣的溫度條件進行孵育。由此，可以進行木質系生物質的糖化、和來自由糖化而得的木糖、葡萄糖的乙醇發酵，從而制造乙醇。另外，此時即可以攪拌溶液，也可以振蕩溶液。
[0063]另外，在回收由培養基所含的木糖等碳源發酵生產而得的乙醇時，不特別限定，可以應用現有公知的任何方法。例如，上述的乙醇發酵結束后，通過固液分離操作而分離成含乙醇的液層、和含有突變體酵母、固體成分的固層。然后，將液層所含的乙醇通過蒸餾法分離?純化，從而可以回收純度高的乙醇。此外，乙醇的純化度可以根據乙醇的使用目的適宜調整。
[0064]實施例
[0065]以下，通過實施例更詳細地說明本發明，但本發明的技術的范圍不限于以下的實施例。
[0066]〔實施例1〕
[0067]在本實施 例中，使用馬克斯克魯維酵母作為克魯維酵母屬酵母，制作醇脫氫酶基因的破壞株，對來自木糖的乙醇收率進行比較研究。
[0068]<株的制作>
[0069]<利用接合、孢子形成的ura3-leu2_突變株的制作>
[0070]使用作為馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的ura3_株的RAK3605株(Nonklang, S.et al., Appl.Environ.Microbiol.74, p.7514-7521 (2008))作為基準株。明確了來源于馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的營養缺陷型突變株以低頻率成為2倍體。通過紫外線突變可以獲得多重營養缺陷型突變株，其結果是在染色體DNA中引入突變的概率上升。為了制作更穩定的株，通過接合和孢子形成，從而為了由2倍體簡單地制作多重營養缺陷型株而制作了以下的株。
[0071]首先，對RAK3605株照射紫外線照射，獲得Iys-株(RAK3896株:ura3-lys2-)、ade-株(RAK3919 株:ura3-ade2_)和 Ieu-株(RAK3966 株:ura3_leu2_)。制作在這些株中將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3隨機地向染色體轉化而得的株、RAK4088 株(ura3-leu2-ScURA3)、RAK4152 株(ura3-ade2_ScURA3)、RAK4153 株(ura3-lys2-ScURA3)。將 RAK4152 和 RAK4153 株在 YPD 培養基(l%w/v 酵母提取物，2%w/V胨，2%葡萄糖，2%w/V瓊脂)上以混合的方式劃線，向麗培養基(0.17%w/V yeastnitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate (酵母氮源，不含氨基酸，不含硫酸銨)，0.5%w/v硫酸銨，2%w/V葡萄糖，2%w/V瓊脂)復制。將在麗培養基中生長的株 RAK4154 株(ura3-/ura3-ade2-/ADE2, lys2-/LYS2ScURA3/ScURA3)接菌到在釀酒酵母(S.cerevisiae)中使用的SPO培養基(l%w/v醋酸鉀，0.l%w/v酵母提取物，0.05%w/v葡萄糖)中使其形成孢子。
[0072]為了分離制作的孢子，獲得ura-lys-ade-的3重營養缺陷型株，向-A培養基(MM+尿嘧啶，色氨酸，組氨酸鹽酸鹽，蛋氨酸，亮氨酸，賴氨酸鹽酸鹽)，-K培養基(MM+尿嘧啶，色氨酸，組氨酸鹽酸鹽，蛋氨酸，亮氨酸，腺嘌呤硫酸鹽)，-U培養基(MM+色氨酸，組氨酸鹽酸鹽，蛋氨酸，亮氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，腺嘌呤硫酸鹽)復制，成功地從RAK4154株的孢子獲得了 3株在3種培養基中不能增殖的株。將該株命名為RAK4155株(ura3-lys2-ade2-)。通過同樣的方法使RAK4088株與RAK4155株接合，制作RAK4156株(ura3-/ura3-lys2-/LYS2ade2-/ADE21eu2-/LEU2ScURA3/ScURA3)。使該株形成孢子，制作RAK4174 株(Ieu2-ura3_)。
[0073]<Ku70破壞株的制作>
[0074]馬克斯克魯維酵母由于以高頻率發生非同源末端結合修復，因而不能像釀酒酵母(S.cerevisiae)那樣利用同源重組修復容易地進行基因破壞(Nonklang, S.etal., Appl.Environ.Microbiol.74, p.7514-7521 (2008))。因此，通過破壞非同源末端結合修復所需的KU70基因來進行高頻率地發生同源重組的株的制作。由RAK4174株制作破壞 7 KU70 的 RAK4736 株(leu2-ura3-Kmku70Δ::ScLEU2)(Abdel-Banat, B.M.etal., Yeast27, 29-39(2010))。
[0075]< ADHl破壞株的制作>
[0076]馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的ADHl基因中的推定開放閱讀框(openreading frame)用Genetyx ver.10(株式會社七 預測。馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的ADHl基因編碼由348個氨基酸組成的蛋白質。利用該堿基序列信息設計以下的一對引物。
[0077]
【權利要求】
1.突變體酵母，減弱了屬于克魯維酵母屬的酵母中的選自來源于馬克斯克魯維酵母的ADHl基因、與該ADHl基因在功能上等價的基因、來源于馬克斯克魯維酵母的ADH4基因、和與該ADH4基因在功能上等價的基因中的至少一種基因。
2.根據權利要求1所述的突變體酵母，其特征在于，所述屬于克魯維酵母屬的酵母是馬克斯克魯維酵母。
3.根據權利要求1所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADHl基因在功能上等價的基因來源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(C)的任一蛋白質， (a)包含序列號2的氨基酸序列的蛋白質， (b)包含相對于序列號2的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質， (c)包含相對于序列號2的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了I-多個氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質。
4.根據權利 要求1所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADH4基因在功能上等價的基因來源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(c)的任一蛋白質， (a)包含序列號4的氨基酸序列的蛋白質， (b)包含相對于序列號4的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質， (c)包含相對于序列號4的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了I-多個氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質。
5.乙醇的制造方法，其包括以下工序: 用含木糖的培養基來培養權利要求1-4的任一項所述的突變體酵母的培養工序，和 然后，從培養基回收乙醇的回收工序。
6.根據權利要求5所述的乙醇的制造方法，其特征在于，將所述培養工序在包含所述突變體酵母、含木素纖維素的生物質和糖化酶的反應體系中進行。
【文檔編號】C12N1/19GK103459588SQ201280015362
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月26日 優先權日:2011年3月30日
【發明者】志佐倫子, 赤田倫治, 星田尚司, 上村毅, 牟田口梢榮, 德弘健郎, 片平悟史 申請人:豐田自動車株式會社