體外確定個體患結直腸癌概率的方法及試劑盒的制作方法

體外確定個體患結直腸癌概率的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及在外周血樣品中體外確定個體患結直腸癌概率的方法，使用待測個體基因的核酸表達產物的量與得自組成陽性對照的CRC患者組的相同基因的核酸表達產物的量及與得自組成陰性對照的CNC個體組的相同基因的核酸表達產物的量的比較；還涉及包含所述表達產物的特異性結合配偶體的試劑盒。
【專利說明】體外確定個體患結直腸癌概率的方法及試劑盒
發明領域
[0001]本發明涉及檢測結直腸癌，特別涉及用于確定患這種癌癥的概率的方法及試劑盒。
[0002]背景
[0003]結直腸癌(CRC)也稱為結腸癌或大腸癌，是美國第五最常見癌癥形式，中國第四位常見癌癥及歐洲癌癥相關死亡的第三位因素。CRC早期檢測是成功治療及患者存活的關鍵，代表主要公共健康挑戰。事實上，CRC經常是可治愈的，特別是當在早期診斷時。在各個國家已有一些篩查策略。傳統CRC篩查測試包括大便潛血試驗(F0BT)、乙狀結腸鏡檢測結腸鏡檢查、雙重對比鋇劑灌腸、或者直腸指檢。所有這些均具有優點和限制，但是依從性仍低于預期，主要由于患者的不便或者不適。
[0004]尋找目的在于CRC早期檢測的外周血生物學標記物幾年來成為焦點，特別是因為其方便性。同時，只有極少研究支持基于血液的測試的可行性，這些研究發現血液中的基因生物學標記物可以區分CRC患者和對照。這些研究基于流式細胞術，其是計數和檢查顯微顆粒如細胞的技術，所述技術通過將它們懸浮在液流中并用電子檢測裝置分析它們。
[0005]本發明人發現，在外周血樣品中，差異表達的基因代表重要的生物學標記物。它們不使用經典流式細胞術技術，而是確定來自全血的基因的差異表達。通過分析全血中的轉錄物來確定基因表達水平是不尋常的，因為本領域技術人員普遍承認，當無特異性純化步驟時，非常難以獲取稀釋于RNA復雜混合物(總RNA)中的特異信息。本發明方法的優勢還包括避免RNA純化步驟。
[0006]因此，本發明涉 及在外周血樣品中體外確定個體患結直腸癌概率的方法，所述方法包括步驟:
[0007]a)在外周血樣品中確定來自至少一種核酸序列且不超過7種核酸序列的至少一種表達產物的量，所述核酸序列選自SEQ ID NO: 1-11的序列，
[0008]b)將步驟a)中確定的所述表達產物的量與一組先前診斷為結直腸癌患者的個體的表達產物的參考量以及與一組先前確認為非結直腸癌個體的個體的表達產物的參考量進行比較，
[0009]c)進行步驟b)結果的分析，其中:
[0010]-如果測試個體的結果接近或等于得自先前診斷為結直腸癌患者的個體組的結果，則該測試個體被分類為結直腸癌患者，而
[0011]-如果測試個體的結果接近或等于得自先前確認為非結直腸癌個體的個體組的結果，則該測試個體被分類為非結直腸癌個體。
[0012]表達產物的量直接與由其核酸序列限定的基因的表達水平相關。
[0013]至少一種上述核酸的表達水平是確定個體是否是CRC的足夠信息。但是，在本發明優選實施方案中，在步驟a)中，來自選自下組的核酸序列的表達產物的量被確定:SEQ IDN0:USEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:11。[0014]來自核酸的表達產物的量通過將所述表達產物與特異于每種表達產物的至少一種結合配偶體接觸而確定。
[0015]表達產物是指RNA轉錄物或多肽。因此，在本發明方法中，至少一種RNA轉錄物或至少一種多肽的量被確定。
[0016]術語RNA轉錄物是指總RNA，即直接得自外周血樣品或細胞裂解后間接得自血液樣品的編碼或非編碼RNA。特別地，總RNA包含轉移RNA (tRNA)，信使RNA (mRNA)，如從靶基因轉錄也從其他基因轉錄的mRNA，以及核糖體RNA。
[0017]具體說明，當RNA是胞內RNA時，其可以通過裂解步驟從血液樣品中存在的細胞提取，以釋放待測個體細胞中含有的核酸。例如，可以使用如下專利申請中描述的裂解方法:W000/05338，涉及混合磁性及機械裂解，W099/53304,涉及電裂解，W099/15321，涉及機械裂解。本領域技術人員可以使用其它熟知裂解方法，例如熱休克或滲透壓休克，或者使用離液劑如胍鹽的化學裂解(美國專利號5，234，809)。還可以提供額外步驟以從裂解步驟釋放的其它細胞組分分離核酸。這通常能夠濃縮核酸。
[0018]在本發明方法中，RNA轉錄物可以通過雜交、擴增或測序檢測及量化。特別地，為檢測及量化，RNA轉錄物與至少一種探針或至少一種引物在預定條件下接觸，所述預定條件使得所述探針和/或所述引物與所述RNA轉錄物雜交。但是在本發明另一個實施方案中，制備RNA轉錄物的DNA拷貝，通過與至少一種探針或至少一種引物在預定條件下接觸，所述預定條件使得所述探針和/或所述引物與所述DNA拷貝雜交而確定所述DNA拷貝。
[0019]更精確地，在上述方法中，RNA轉錄物或DNA拷貝與至少一種雜交探針和至少一種引物接觸，更特別與至少一種雜交探 針和兩種引物接觸。
[0020]術語“雜交”是指這樣的過程，其中在合適條件下，兩個核苷酸片段以穩定和特異性氫鍵結合以形成雙鏈復合物。這些氫鍵在互補腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))堿基之間形成(稱為A-T鍵)或者在互補的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)堿基之間形成(稱為G-C鍵)。兩個核苷酸片段的雜交可以是完全的(稱為互補核苷酸片段或序列)，即在這個雜交過程中獲得的雙鏈復合物僅包含A-T鍵及C-G鍵。這個雜交可以是部分的(稱為足夠互補的核苷酸片段或序列)，即獲得的雙鏈復合物包含使得能形成雙鏈復合物的A-T鍵和C-G鍵，也包含不結合互補堿基的堿基。兩個核苷酸片段之間的雜交取決于使用的工作條件，特別取決于嚴格性。嚴格性特別定義為兩個核苷酸片段的堿基組成的函數，也通過兩個核苷酸片段之間的錯配程度限定。嚴格性也可以取決于反應參數，例如雜交溶液中存在的離子種類的濃度及類型，變性劑的性質及濃度，和/或雜交溫度。所有這些數據均是熟知的并且本領域技術人員可以確定合適的條件。通常，根據要雜交核苷酸片段的長度，雜交溫度在大約20和70°C之間，特別是在35和65°C之間，在濃度大約0.5-1M的鹽水溶液中。序列或核苷酸片段或寡核苷酸或多核苷酸是通過磷酸酯鍵組裝在一起的一系列核苷酸基序，特征在于天然核酸的信息序列，能夠與核苷酸片段雜交，該系列可以含有不同結構的單體，可以得自天然核酸分子和/或通過遺傳重組和/或通過化學合成獲得。基序是單體衍生物，其可以是核酸的天然核苷酸，其組成元件是糖、磷酸基團和含氮堿基；在0嫩中，糖是脫氧-2-核糖，在RNA中，糖是核糖；根據涉及DNA或RNA，含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或者單體是在三種組成元件中的至少一種中被修飾的核苷酸；例如，修飾可以發生在堿基水平，修飾的堿基例如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或者任何其它能雜交的修飾堿基，或者修飾可以發生在糖水平，例如用聚酰胺置換至少一個脫氧核糖(P.E.Nielsen et al, Science, 254,1497-1500(1991))，或者修飾可以發生在磷酸基團水平，例如其用酯特別選自二磷酸酯、烷基膦酸酯和芳基膦酸酯及硫代磷酸酯置換。
[0021]為本發明目的，術語“擴增引物”是指包含5-100個核苷酸、優選15-30個核苷酸的核苷酸片段，其允許起始酶促聚合，例如酶促擴增反應。術語“酶促擴增反應”是指通過至少一種酶的作用產生核苷酸片段的多個拷貝的過程。這種擴增反應是本領域技術人員熟知的，可特別提及的是下述技術:PCR(聚合酶鏈反應)，如美國專利號4，683，195和美國專利號4，683，202所述，LCR(連接酶鏈反應)，如專利申請EP0201184中所述，RCR(修復鏈反應)，如專利申請W090/01069所述，專利申請W090/06995的3SR(自持續(self sustained)序列復制)，專利申請W091/02818的NASBA (基于核酸序列的擴增)，美國專利號5，399，491的TMA (轉錄介導的擴增)及RT-PCR。
[0022]當酶促擴增是PCR時，其使用至少兩種特異于靶基因的擴增引物，使得特異于靶基因的擴增材料。特異于靶基因的材料優選包含經衍生自靶基因的信使RNA的逆轉錄獲得的互補DNA (稱為cDNA)，或者經特異于靶基因的cDNA的轉錄獲得的互補RNA (稱為cRNA)。當酶促擴增是在逆轉錄反應后進行的PCR時，稱為RT-PCR。
[0023]術語“雜交探針”是指包含至少5個核苷酸、如5-100個核苷酸、特別是10-75個核苷酸、如15-35個核苷酸和60-70個核苷酸的核苷酸片段，在給定條件下具有雜交特異性，從而與特異于靶基因的材料形成雜交復合物。在本發明中，特異于靶基因的材料可以是包括在衍生自靶基因的信使RNA中的核苷酸序列(稱為靶基因特異性mRNA)，包括在通過所述信使RNA的逆轉錄獲得的互補DNA中的核苷酸序列(稱為靶基因特異性cDNA)，或者包括在通過如上所述cDNA的轉錄獲得的互補RNA中的核苷酸序列(稱為靶基因特異性cRNA)。雜交探針可以包括標記物用于其檢測。術語“檢`測”是指直接檢測如計數法，或者通過使用標記物的檢測方法間接檢測。現有許多檢測方法用于檢測核酸(參見例如Kricka et al.，Clinical Chemistry,1999, no45(4), p.453-458or Keller G.H.et al., DNA Probes,2ndEd.，Stockton Press, 1993, sections5and6, p.173-249)。術語“標記物”是指能產生可被檢測信號的示蹤劑。這些示蹤劑的非限制性列表包括酶，其產生可以通過例如比色法、熒光或發光檢測的信號，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；生色團如熒光、發光或染料化合物；電子致密基團，可被電子顯微鏡或通過它們的電學性質如導電性檢測，通過電流分析法或伏特計方法、或通過阻抗測量檢測；可以通過光學方法或物理方法檢測的基團，所述光學方法例如衍射、表面等離子體共振或接觸角變化，所述物理方法例如原子力光譜學、隧道效應等；放射活性分子如32P，35S或1251。
[0024]為本發明目的，雜交探針可以是“檢測”探針。在這種情況中，“檢測”探針由標記物標記。檢測探針可以特別是“分子信標”檢測探針，如Tyagi&Kramer所述(Nature biotech,1996,14:303-308)。這些“分子信標”在雜交期間發熒光。它們具有莖-環型結構，含有熒光團和“猝滅”基團。特異的環序列與其互補靶核酸序列的結合導致莖解開及在合適波長激發期間發射熒光信號。檢測探針特別可以是“報道探針”，包含根據NanoString?技術的“顏色編碼的條碼”。
[0025]為檢測雜交反應，可以利用具有直接(特別是通過在靶序列內摻入標記物)或間接(特別是使用上述檢測探針)標記的靶序列。特別是可以在雜交步驟之前進行標記和/或裂解靶序列的步驟，例如在酶促擴增反應期間使用標記的脫氧核糖核苷酸三磷酸。裂解可以特別是通過咪唑或者氯化錳的作用而進行。靶序列也可以在擴增步驟之后標記，例如通過文件W091/19812中所述的夾心雜交技術雜交檢測探針。另一個特別優選的標記核酸的方法在申請FR2780059中描述。
[0026]根據本發明的優選實施方案，檢測探針包含熒光團及猝滅劑。根據本發明更優選的實施方案雜交探針在其5’末端包含FAM (6-羧基-熒光素)或ROX (6-羧基-X-若丹明)熒光團及在其3’末端包含猝滅劑(Dabsyl )。
[0027]雜交探針也可以是“捕獲”探針。在這種情況中，“捕獲”探針通過任何合適方式即直接或間接固定化或者可以固定化在固相基質上，例如通過共價或吸附。作為固相基質，可以使用合成材料或天然材料，任選化學修飾的，特別是多糖如基于纖維素的材料，例如紙、纖維素衍生物如醋酸纖維素和硝基纖維素或葡聚糖、聚合物、共聚物，特別是基于苯乙烯型單體、天然纖維如棉花及合成纖維如尼龍；無機材料如二氧化硅、石英、玻璃或陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金屬衍生物，凝膠等。固相基質可以是微滴定板形式，如申請W0-A-94/12670描述的膜形式或者顆粒形式。還可以在基質上固定化一些不同的捕獲探針，每個特異于靶基因。特別地，可以使用其上可以固定化大量探針的生物芯片作為基質。術語“生物芯片”是指尺寸小的固相基質，許多捕獲探針可以附著于其上的預定位置。生物芯片或DNA芯片概念從1990年開始。其基于多學科技術，集成了微電子學、核酸化學、成像分析及信息技術。運行原理是基于分子生物學基礎:雜交現象，即兩個DNA和/或RNA序列的堿基的互補配對。生物芯片方法基于利用附著于固相基質的捕獲探針，在探針上使得用熒光染料直接或間接標記的靶核苷酸片段樣品起作用。捕獲探針特殊定位在基質或芯片上，每個雜交給出與靶核苷酸片段相關的特定信息。所獲得的信息是累積的，使得可以例如量化一或多種靶基因的表達水平。為了分析靶基因的表達，可以制備包含多個探針的基質，其相應于被轉錄成mRNA的靶基因的全部或部分。為本發明目的，術語“低密度基質”是指包含少于50個探針的基質。為本發明目的，術語“中等密度基質”是指包含50-10000個探針的基質。為本發明目的，術語“高密度基質”是指包含超過10000個探針的基質。
[0028]特異于希望去分析的靶基因的核酸的cRNA或cDNA然后與例如特異性捕獲探針雜交。雜交后，洗滌基質或芯片，通過結合于例如熒光染料型標記物的高親和性配體揭示標記的cDNA或cRNA/捕獲探針復合物。例如用掃描儀讀取熒光，熒光分析用信息技術加工。例如，可以提及由Affymetrix公司開發的DNA芯片("Accessing GeneticInformation with High-Density DNA arrays"，M.Chee et al.，Science，1996，274，610-614.Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequenceanalysis"，A.Caviani Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，1994，91，5022-5026)，用于分子診斷。在這個技術中，捕獲探針通常尺寸小，大約25個核苷酸。生物芯片的其它例子在如下出版物中給出:G.Ramsay，Nature Biotechnology，1998，N0.16，p.40-44;F.Ginot，Human Mutation，1997，N0.10，p.1-10;J.Cheng et al, Molecular diagnosis，1996, N0.1 (3), p.183-200;T.Livache et al，Nucleic Acids Research，1994，N0.22(15)，p.2915-2921J.Cheng et al, Nature Biotechnology，1998，N0.16，p.541-546，或者美國專利號4，981，783，美國專利號5，700，637，美國專利號5，445，934，美國專利號5，744，305及美國專利號5，807，522。固相基質的主要特征應該是保持捕獲探針在靶核苷酸片段上的雜交特征，同時產生檢測方法的最小背景噪聲。可以分成三種主要制造類型用于將探針固定化在基質上。
[0029]首先，第一種技術是沉積預合成的探針。探針的附著是通過微量移液器或微點(microdot)或通過噴墨裝置直接轉移而進行。這項技術允許附著尺寸為幾個堿基(5-10個)直至相對較大尺寸60個堿基(印刷)至幾百個堿基(微沉積)的探針。
[0030]印刷是噴墨打印機使用的方法的適應。其基于以可達到4000滴/秒的速率推進非常小的液滴(體積〈lnl)。印刷不涉及釋放液體的系統與其沉積的表面的任何接觸。
[0031]微沉積是將幾十至幾百個堿基的長探針附著于玻片表面。這些探針通常從數據庫中提取并且呈擴增及純化產物形式。這個技術使得可以產生被稱為微陣列的芯片，其在小于4cm2的表面積上攜帶大約I萬個DNA斑點，稱為識別區。然而不能忘記的是使用尼龍膜，被稱為“大陣列(macroarray)”,其攜帶通常被PCR擴增的產物,直徑為0.最大密度為25個斑點/cm2。這種非常靈活的技術被許多實驗室使用。在本發明中，后一技術被認為包括在生物芯片中。但是一定體積的樣品可以沉積在微滴定板每個孔的底部，如專利申請W0-A-00/71750和FR00/14896所述，或者一定數目的彼此分離的液滴可以沉積在同一皮氏皿的底部，如另一個專利申請FROO/14691所述。
[0032]將探針附著于基質或芯片的第二種技術成為原位合成。這個技術導致在芯片表面直接產生短探針。其基于原位寡核苷酸合成(特別參見專利申請W089/10977和W090/03382)及基于寡核苷酸合成儀方法。其包括沿玻璃表面移動反應室，其中發生寡核苷酸延伸反應。
[0033]最后，第三種技術成為光刻，其是Affymetrix開發的生物芯片的方法。其也是一種原位合成。光刻衍生自微處理器技術。芯片表面通過附著可以被光激活的光不穩定化學基團而修飾。一旦被照射， 這些基團能夠與寡核苷酸的3’末端反應。通過用限定形狀的掩飾(mask)保護這個表面，可以選擇性照射，因此激活芯片上希望附著4種核苷酸的一種或另一種的區域。相繼使用不同掩飾使得可以交替保護/反應循環，因此在大約幾十平方微米(μπι2)的斑點上產生寡核苷酸探針。這個分辨率使得可以在幾平方厘米(cm2)的表面積上產生幾十萬個斑點。光刻具有優勢:以大批平行的方式，其能夠僅通過4χΝ個循環便產生N聚體芯片。所有這些技術均可以用于本發明。根據本發明優選實施方案，上述步驟b)的至少一種特異性試劑包含至少一種雜交探針，其優選固定化在基質上。這個基質優選是如上所述的低、高或中等密度基質。
[0034]在包含多個探針的基質上的這些雜交步驟之前可以是如上所述酶促擴增反應步驟，以增加靶遺傳物質的量。
[0035]確定靶基因的表達水平可以通過本領域技術人員已知的任何方案進行。通常，靶基因的表達可以通過在給定時間檢測從靶基因轉錄的mRNA (信使RNA)而分析。
[0036]本發明優選涉及通過根據本領域技術人員已知的任何方案檢測衍生自靶基因的mRNA而確定靶基因的表達水平。根據本發明的特定實施方案，一些靶基因的表達水平通過檢測一些不同mRNA而被同時確定,每種mRNA衍生自一種祀基因。
[0037]通過擴增，可以如下確定靶基因表達水平:1)在從全血中提取總RNA (包含轉移RNA (tRNA)、核糖體RNA (rRNA)和信使RNA (mRNA))之后，進行逆轉錄步驟以獲得所述mRNA的互補DNA (cDNA).例如，這種逆轉錄反應可以用逆轉錄酶進行，可以從RNA片段獲得互補DNA片段。可以特別使用來自AMV (禽類成髓細胞瘤病毒)或來自MMLV (莫羅尼鼠白血病病毒)的逆轉錄酶。當更希望僅獲得mRNA的cDNA時，這個逆轉錄步驟在包含僅胸腺嘧啶堿基(polyT)的核苷酸片段存在下進行,polyT通過互補性與mRNA的polyA序列雜交，以形成polyT-polyA復合物，作為由逆轉錄酶進行的逆轉錄反應的起始點。然后獲得與衍生自靶基因的mRNA互補的cDNA (靶基因特異性cDNA)及與衍生自非靶基因的基因的mRNA互補的cDNA (非特異于靶基因的cDNA)。2)特異于靶基因的擴增引物與靶基因特異性cDNA及非特異于靶基因的cDNA接觸。特異于靶基因的擴增引物與靶基因特異性cDNA雜交，來自靶基因的mRNA來源的cDNA的已知長度的預定區域被特別擴增。非特異于靶基因的cDNA不被擴增，然后獲得大量靶基因特異性cDNA。為本發明目的，可提及“靶基因特異性cDNA”或“來自革巴基因的mRNA來源的 cDNA(cDNAs originating from the mRNAs derived from thetarget gene)”，兩者并無差別。這個步驟可以特別通過PCR型擴增反應或通過上述任何其它擴增技術進行。通過PCR，還可以同時擴增一些不同的cDNA，每個cDNA特異于不同靶基因，使用一些不同擴增引物，每個引物特異于一個靶基因，然后進行多重擴增。3)靶基因的表達通過檢測及量化上述步驟2)中獲得的靶基因特異性cDNA確定。這個檢測可以在靶基因特異性cDNA根據它們的大小電泳遷移后進行。遷移的凝膠及介質可以包括溴化乙錠以允許在給定遷移時間后將凝膠置于UV (紫外)線桌臺上通過光信號發射而直接檢測靶基因特異性cDNA。靶基因特異性cDNA量越大，光信號越亮。這些電泳技術是本領域技術人員熟知的。靶基因特異性cDNA也可以用進行直至飽和的擴增反應獲得的量化范圍而檢測及量化。為了考慮可能在各個步驟期間觀測到的酶效率的差異(逆轉錄、PCR等)，各組患者的靶基因的表達可以通過同時確 定“管豕”基因的表達而標準化，管豕基因的表達在各組患者中是相似的。通過獲得靶基因表達與管家基因表達的比率，即通過獲得靶基因特異性cDNA的量與管家基因特異性cDNA的量的比率，由此可以校正各個實驗間的任何差異。本領域技術人員可以特別參考下列出版物:Bustin S A, J Mol Endocrinol, 2002, 29:23-39;GiuliettiA Methods，2001，25:386-401。
[0038]通過雜交，靶基因的表達可以通過如下方式確定:1)在從全血中提取總RNA之后，進行如上述逆轉錄步驟，以獲得與衍生自靶基因的mRNA互補的cDNA(靶基因特異性cDNA)和與衍生自除了靶基因之外的基因的mRNA互補的cDNA(非特異于靶基因的cDNA)。2)將所有cDNA均與其上固定了特異于其表達希望被分析的靶基因的捕獲探針的底物接觸，以進行靶基因特異性cDNA與捕獲探針之間的雜交反應，非特異于靶基因的cDNA與捕獲探針不雜交。雜交反應可以在固體底物上進行，包括上述所有材料。根據一個優選的實施方案，將雜交探針固定在底物上。優選地，底物是如上文定義的低_、高-或中等密度的底物。雜交反應也可以在如上述靶基因特異性cDNA的酶擴增組成的步驟之后進行，以獲得大量的靶基因特異性cDNA及增加靶基因特異性cDNA與特異于靶基因的捕獲探針雜交的可能性。雜交反應也可以在如上述標記和/或裂解靶基因特異性cDNA的步驟之后進行，例如使用標記的脫氧核糖核苷酸三磷酸進行擴增反應。裂解可以特別通過咪唑和二氯化錳的作用而進行。靶基因特異性cDNAye可以在擴增步驟之后標記，例如根據如文獻W0-A-91/19812中所述夾心雜交技術與標記的探針 雜交而進行。其它優選的標記和/或裂解核酸的特定方法在專利申請 W099/65926、W001/44507、W001/44506、W002/090584、W002/090319 中描述。3)隨后進行檢測雜交反應的步驟。所述檢測通過將其上特異于靶基因的捕獲探針與靶基因特異性cDNA雜交的底物與用標記物標記的“檢測”探針接觸，并檢測由該標記物發出的信號而進行。當靶基因特異性cDNA已經預先用標記物標記時，直接檢測該標記物發出的信號。
[0039]靶基因的表達也可以通過如下方式確定:1)在從全血中提取總RNA之后，進行如上述逆轉錄步驟，以獲得所述生物材料的mRNA的cDNA。隨后使用T7聚合酶進行該cDNA的互補RNA的聚合化，所述聚合酶在啟動子的控制下，使得可以從DNA模板中獲得互補RNA。然后獲得特異于靶基因的mRNA的cDNA的cRNA (稱作靶基因特異性cRNA)和非特異于靶基因的mRNA的cDNA的cRNA。2)將所有cRNA均與其上固定了特異于其表達希望被分析的靶基因的捕獲探針的底物接觸，以進行靶基因特異性cRNA與捕獲探針之間的雜交反應，非特異于靶基因的cRNA與捕獲探針不雜交。當需要同時分析一些靶基因的表達時，可以將一些不同的捕獲探針固定在底物上，每個探針均特異于一個靶基因。雜交反應也可以在如上述標記和/或裂解靶基因特異性cRNA組成的步驟之后進行。3)隨后進行由檢測雜交反應組成的步驟。所述檢測可以通過將其上特異于靶基因的捕獲探針與靶基因特異性cRNA雜交的底物與用標記物標記的“檢測”探針接觸，并檢測由所述標記物發出的信號而進行。當靶基因特異性cRNA已經預先用標記物標記時，直接檢測由該標記物發出的信號。當使用其上雜交了大量探針的生物芯片類型底物時，使用cRNA是特別有利的。
[0040]當表達產物是多肽時，可以通過將其與如下文定義的至少一種特異性配體接觸而進行檢測。在一個優選的實施方案中，將表達的多肽與如下文定義的至少兩種特異性配體接觸。特異性配體例如是指稱作“Nanofitin?”的抗體或親和性蛋白質。
[0041]Nanofitin是具有競爭特性的親和性蛋白質。其存在與看題相似的競爭性親和性。
[0042]術語“抗體”涵蓋了多克隆抗體，單克隆抗體，人源化抗體，重組抗體。其產生方法為本領域技術人員熟知。
[0043]本發明還包括在體外確定個體患有結腸癌的可能性的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種特異于至少一種核酸序列的結合配偶體且不超過7種特異于7種核酸序列的7種表達產物的結合配偶體，其中至少一種結合配偶體特異于選自SEQ ID NO: 1-11的至少一種核酸序列的至少一種表達產物。
[0044]特別地，所述試劑盒包含7種結合配偶體的組合，其特異于具有SEQ ID NO:SEQ IDNO:1、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6,SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 所示序列的 7 種核酸序列的表達產物。
[0045]在試劑盒中，特異性結合配偶體包含:
[0046]-至少一種雜交探針，
[0047]-或者至少一種雜交探針和至少一種引物，或者
·[0048]-至少一種雜交探針和兩種引物，或者
[0049]-至少一種特異性配體或至少兩種特異性配體，如抗體和/或親和性蛋白。
[0050]最后，本發明涉及至少一種針對至少一種核酸序列的至少一種表達產物的特異性結合配偶體且不超過7種針對7種核酸序列的7種表達產物的特異性結合配偶體在制備用于體外確定個體患結直腸癌概率的組合物中的用途，所述至少一種核酸序列具有選自SEQID NO: 1-11所示核酸序列的序列。[0051]特別地，使用7種特異性結合配偶體的組合，所述7種特異性結合配偶體特異于具有 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ IDNO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 及 SEQ ID NO: 11 所示序列的7種核酸序列的7種表達產物。
[0052]特異性結合配偶體包含:
[0053]-至少一種雜交探針，
[0054]-或至少一種雜交探針及至少一種引物，或
[0055]-至少一種雜交探針及兩種引物，或
[0056]-至少一種特異性配體或至少兩種特異性配體，如抗體和/或親和性蛋白。
實施例
[0057]I)材料及方法
[0058]1.患者及樣品收集
[0059]在2006年至2010年期間從161個結直腸癌患者(CRC)及148個結腸鏡陰性對照患者(CNC)收集外周血樣品。CRC患者在中國FDUSCC的結直腸外科募集。根據國際防癌聯盟(UICC)推薦的國際腫瘤-淋巴結-轉移(--Μ)系統對腫瘤分期。患者未接受手術前放療或化療。患有遺傳性結直腸癌或炎性腸病(克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)的患者被排除在本研究之外。已用結腸鏡證實無任何息肉或結直腸癌癥狀的CNC從上海地區社區醫院和FDUSCC登記加入。對于每個患者，將2.5ml外周血收集進PAXgene? Blood RNA試管(PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, CH)并根據廠商指導加工。
[0060]研究涉及兩個獨立的參加者群組。群組I由100個CRC患者和100個CNC組成。對于CRC患者，在結腸鏡后至少一周于手術前在FDUSCC收集血液樣品。對于CNC，在結腸鏡前一周在上海地區社區醫院收集血液樣品。分析來自這些樣品的基因表達譜作為訓練集以尋找與CRC相關的顯著基因及鑒別分子特征。群組2包括61個CRC患者和48個CNC。樣品以與群組I相同方式收集。群組2用作獨立測試集以證實群組I中觀測到的特征表現。
[0061]2.RNA提取及微陣列實驗
[0062]用PAXgene? Blood RNA系統(PreAnalytix)根據廠商指導提取總RNA。用分光光度計在260nm光密度測量總RNA數量，質量用RNA6000Nano LabChip? Kit在BioAnalyzer Agilent2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, U.S.A.)上評估。僅分析具有7-10的RNA完整性數目(RNA Integrity Number)的樣品。50ng總RNA然后經逆轉錄并且用Ribo-SPIA?技術用WT-0vation? RNA擴增系統(NuGEN TechnologiesInc., San Carlos, CA, U.S.A.)根據廠商標準方案線性擴增成單鏈cDNA,產物用QIAquick?PCR純化試劑盒(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)純化。2微克擴增純化的cDNA隨后用RQlRNase-Free DNase (Promega Corp., Fitchburg, WI, U.S.A.)片段化并且用生物素化脫氧核苷三憐酸經末端轉移酶(Roche Diagnostics Corp.，Indianapoli, IN, U.S.A.)和GeneChip? DNA 標記試劑(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, U.S.A)標記。標記的 cDNA在雜交爐640 (Agilent Technologies)中以每分鐘60轉、50°C、18小時雜交到GeneChipHG U133Plus2.0 陣列(Affymetrix)上。HG U133Plus2.0 陣列含有 54675 個探針集，代表大約39000個最佳鑒定的人基因。在雜交后，陣列被洗滌并用GeneChip? FluidicsStation450 (Affymetrix)根據 Affymetrix 方案 EukGE_WS2v4 染色。陣列用 GeneChip?
掃描儀 3000 (Affymetrix)掃描。
[0063]3.統計學分析
[0064]根據標準Affymetrix質量控制參數建議進行微陣列數據質量控制。Affymetrix表達陣列根據Robust Mult1-chip Average法(RMA)進行全局預加工,使用背景校正、分位點標準化及中位數平滑總結(median polish summarization) (Irizarry RA et al.，Biostatistics203;4:249-64)。
[0065]對于群組I數據，具有極端信號強度(低于log2(50)或高于2E14)的探針集被過濾掉。然后，用Entrez基因數據庫(Maglot D et al., Nucleic AcidsResearch2007;35:D26-31)的信息進行基于生物學知識的過濾。除去沒有Entrez基因ID注釋的探針集。對于作圖為相同Entrez基因ID的多個探針集，僅保留具有最大Inter Quantile Range值的探針集。在兩步過濾后，保留9859個探針集進行下游分析。為降低批次效應可能性，將Combat方法用于過濾的表達數據(Johnson WE et al.,Biostatistics2007; 8:118-27)。通過微陣列的顯著性分析(SAM)方法進行差異表達基因(DEG)分析(False Discovery Rate=0.05;Type= “Two class unpaired” ； teststatistic= “t-statistic，，;number of permutations=l, 000) (Tusher VG et al., PNASUSA2001,98:5116-21)。顯著性基因選擇及預測模型構建用RFE-SVM方法使用5倍交叉確認方法進行。在訓練集的200個樣品中，隨機選擇160個形成學習集；用RFE-SVM評分的范圍從I到100個基因的不同大小產生預測模型；模型表現用其余40個樣品評估。這個方法重復1000次。我們的結果提不用基于100個基因的SVM預測|旲型可實現最大97%精確度。特征大小優化考慮預測表現、特征復雜性及經濟性。最后，我們鑒別了 7種核心基因滿足我們的目標表現，整體精確度為90%。所述7種基因經t-檢驗P值、變化倍數、生物學功能選擇并且不與年齡或性別因素相關。`
[0066]II)結果
[0067]1.結直腸癌和對照患者群的特征
[0068]在兩個群組中的309個參加者中，有161個CRC患者和148個CNC。患者的人口統計學及臨床特征總結在表I中。
[0069]表1:患者的臨床特征
[0070]
【權利要求】
1.在外周血樣品中體外確定個體患結直腸癌概率的方法，所述方法包括步驟: a)在外周血樣品中確定來自至少一種核酸序列且不超過7種核酸序列的至少一種表達產物的量，所述核酸序列選自SEQ ID NO: 1-11， b)將步驟a)中確定的所述表達產物的量與一組先前診斷為結直腸癌患者的個體的所述表達產物的參考量以及與一組先前確認為非結直腸癌個體的個體的所述表達產物的參考量進行比較， c)對步驟b)的結果進行分析，其中: -如果測試個體的結果接近或等于得自先前診斷為結直腸癌患者的個體組的結果，則該測試個體被分類為結直腸癌患者，而 -如果測試個體的結果接近或等于得自先前確認為非結直腸癌個體的個體組的結果，則該測試個體被分類為非結直腸癌個體。
2.權利要求1的方法，其中在步驟a)中，來自所述至少一種核酸的至少一種表達產物的量通過將所述表達產物與特異于所述表達產物的至少一種結合配偶體接觸而確定。
3.權利要求1或2的方法，其中在步驟a)中，來自選自下組的核酸序列的表達產物的量被確定:SEQ ID NO:USEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11。
4.權利要求1的方法，其中所述表達產物是至少一種RNA轉錄物或者至少一種多肽。
5.權利要求4的方法，其中所述表達產物是至少一種mRNA。
6.權利要求5 的方法，其中所述RNA轉錄物通過雜交、通過擴增或通過測序檢測及量化。
7.權利要求4的方法，其中所述RNA轉錄物與至少一種探針和/或至少一種引物在預定條件下接觸，所述預定條件使得所述探針和/或所述引物與所述RNA轉錄物雜交。
8.權利要求6的方法，其中制備所述RNA轉錄物的DNA拷貝，且將所述DNA拷貝與至少一種探針和/或至少一種引物在預定條件下接觸，所述預定條件使得所述探針和/或所述引物與所述DNA拷貝雜交。
9.權利要求4的方法，其中通過與至少一種特異性配體，特別是抗體或親和性蛋白，接觸而檢測所表達的多肽。
10.權利要求9的方法，其中將所表達的多肽與至少兩種特異性配體，特別是兩種抗體或兩種親和性蛋白或一種抗體及一種親和性蛋白，接觸。
11.用于體外確定個體患結直腸癌概率的試劑盒，包含至少一種特異于至少一種核酸序列的至少一種表達產物的結合配偶體且不超過7種特異于7種核酸序列的7種表達產物的結合配偶體，其中所述至少一種結合配偶體特異于選自SEQ ID NO: 1-11所示核酸序列的至少一種核酸序列的表達產物。
12.權利要求11的試劑盒，其包含7種結合配偶體的組合，它們特異于具有SEQIDNO:1、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6,SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 所示序列的 7 種核酸序列的表達產物。
13.權利要求11的試劑盒，其中所述至少一種特異性結合配偶體包含至少一種雜交探針。
14.權利要求13的試劑盒，其中所述特異性結合配偶體包含至少一種雜交探針及至少一種引物。
15.權利要求13的試劑盒，其中所述特異性結合配偶體包含至少一種雜交探針及兩種引物。
16.權利要求11的試劑盒，其中所述至少一種特異性結合配偶體包含至少一種特異性配體、特別是一種抗體或一種親和性蛋白。
17.權利要求16的試劑盒，其中所述特異性結合配偶體包含至少兩種特異性配體、特別是兩種抗體或兩種親和性蛋白或一種抗體及一種親和性蛋白。
18.至少一種針對至少一種核酸序列的至少一種表達產物的特異性結合配偶體且不超過7種針對7種核酸序列的7種表達產物的特異性結合配偶體在制備用于體外確定個體患結直腸癌概率的組合物中的用途，所述至少一種核酸序列具有選自SEQ ID N0:1-11所示核酸序列的序列。
19.權利要求18的用途，其是7種特異性結合配偶體的組合的用途，所述7種特異性結合配偶體特異于具有 SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5或SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10和 SEQ IDNO: 11所示序列的7種核酸序列的表達產物。
20.權利要求18的用途，其中所述至少一種特異性結合配偶體包含至少一種雜交探針。
21.權利要求20的用途，其中所述特異性結合配偶體包含至少一種雜交探針及至少一種引物。
22.權利要求21的用途，其中所述特異性結合配偶體包含至少一種雜交探針及兩種引物。
23.權利要求18的用途，其中所述至少一種特異性結合配偶體包含至少一種特異性配體、特別是抗體或親和性蛋白。
24.權利要求23的用途，其中所述特異性結合配偶體包含至少兩種特異性配體、特別是兩種抗體或兩種親和性蛋白或一種抗體及一種親和性蛋白。
【文檔編號】C12Q1/68GK103443295SQ201280015168
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年3月23日 優先權日:2011年3月25日
【發明者】葉迅, 吳非, 徐清華, 劉芳, 孟夏, B·穆然 申請人:生物梅里埃公司