真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防治劑、植物病害防治方法和植物病害真菌減毒方法

真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防治劑、植物病害防治方法和植物病害真菌減毒方法
【專利摘要】一種真菌病毒，其對植物病害真菌發揮更優異的防治效果。其特征在于：具有五種雙鏈RNA，該五種雙鏈RNA中，有四種雙鏈RNA分別相對于SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性。作為一個例子，使用新型真菌病毒MoCV3。
【專利說明】真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防治劑、植物病害防治方法和植物病害真菌減毒方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及抑制植物病害真菌對植物的感染力的新型真菌病毒，還涉及感染了該真菌病毒的植物病害真菌、利用了該真菌病毒的植物病害防治劑以及植物病害防治方法、和使用了該真菌病毒的植物病害真菌減毒方法。
【背景技術】
[0002]植物病害中，存在因氣象?土壤等環境因素發生的病害、因病毒?細菌?真菌(絲狀菌)等感染性因素發生的病害、由于生理性障礙而發生的病害、因這些復合性因素發生的病害等。目前，植物病害中包括許多對糧食、花卉、花木、樹木等的生產形成阻礙因素的病害，經濟上的影響大的病害也有很多。
[0003]植物病害中，真菌是最重要的病害因子之一。據說約80%的植物病害是由真菌引起的。
[0004]例如，稻瘟病是在世界各地發生的最重要的植物病害之一。其病原菌是霉(絲狀菌)的一種、即水稻稻痕病菌{學名“Magnaporthe orjzae (稻痕病菌)”)。25°C左右是水稻稻瘟病菌發育、胞子形成、感染的合適溫度，另外，其喜歡濕潤的環境。因此，由于夏季的低溫、多雨、日照不足等氣象因素而大量發生，導致水稻的歉收、品質下降，帶來經濟上的巨大打擊。
[0005]此外，還存在紋枯病、銹病、白粉病、炭疽病、菌核病、霜霉病、灰霉病等以真菌為病因、經濟上的影響也大的許多植物病害。因此，目前人們也在嘗試著開發新的農藥或改良品種等(關于稻瘟病的防治，例如參照專利文獻1、2)。
[0006]在此，下面對本發明所關聯的事項即真菌病毒進行說明。
[0007]將感染真菌類(Fungi，下同)的病毒稱為真菌病毒。其中，有人報道了以雙鏈RNA作為基因組的真菌病毒。這些真菌病毒中，潛在性地感染宿主菌、對宿主的形質幾乎沒有影響的真菌病毒較多。
[0008]以雙鏈RNA作為基因組的真菌病毒，目前分為分體病毒科(學名uParti ti viridae ”，下同)、全病毒科(學名“ Tb viridae ”，下同)、金色病毒科(學名
下同)等五科。分體病毒科病毒在其病毒顆粒中有兩個幾乎相同大小的直鏈狀雙鏈RNA，總基因量為4~6kbp。全病毒科病毒在其病毒顆粒中有4~7kbp的一條直鏈狀雙鏈RNA。此外,在栗疫病菌{學名“Cryphonectria parasitica,y)中，發現了菌內源性地存在、且具有9~13kbp的雙鏈RNA的病毒(低毒力病毒等)。
[0009]金色病毒科病毒具有球形的病毒樣顆粒，并具有四種成分的雙鏈RNA。另外，已知其與分體病毒科和全病毒科的病毒一樣，具有編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase ；RdRP)的區。作為屬于金色病毒科的病毒，例如已知有Hvl45SV(“長螺孢菌 145S 病毒{Helminthosporium victoriae 145S virus) ”,下同)、PcV ( “產毒青霉病毒iPenicillium chrysogenum virus) ”,下同)、AbVl (“雙抱蘑燕病毒 I (Agaricus bisporusvirus 1) ”,下同)等(參照非專利文獻I等)。
[0010]近年來，對于特定的植物病害，研究通過真菌病毒等將其病原菌減毒，之后使用該減毒菌來防治該病害的方法，一部分方法已經實際應用。例如，公開了下述方法:使用抑制栗疫病菌的毒性的病毒性雙鏈RNA的全長cDNA將該菌減毒，再將該菌應用于栗疫病的防治的方法(參照非專利文獻I等)；或者，發現了抑制紫紋羽病菌(學名“Heli—mompa”)的雙鏈RNA病毒，使用內含該雙鏈RNA的紫紋羽病菌減毒菌株來防治紫紋羽病的方法(參照非專利文獻2、專利文獻3等)等。
[0011]另外，在專利文獻4中，公開了感染水稻稻瘟病菌、并使水稻稻瘟病菌的感染力降低的真菌病毒、以及感染了該真菌病毒的植物病害真菌減毒株。通過使用專利文獻4中公開的真菌病毒，可以將植物病害真菌減毒，可以提供植物病害的新的防治方法。
[0012]現有技術文獻 專利文獻
專利文獻1:日本特開2004-143045號公報；
專利文獻2:日本特開2003-250370號公報；
專利文獻3:日本特開2001-78752號公報；
專利文獻4:國際公開W0/2009/093409號公報；
非專利文獻
非專利文獻 1:C.M.Fauquet, Mary Ann Mayo, J.Mani1ff, U.Desselberger,L.A.Ball, “Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses;Eighth Report Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses，，，ElsevierAcademic Press:第 591-595 頁；
非專利文獻2:Gil H.Choi和Donald L.Nuss, ^Hypovirulence of chestnut blightfungus conferred by an infectious viral cDNA.” Science.1992 Aug 7; 257(5071):800-3 ；
非專利文獻 3:H.0saki 等人,“Detection of Double-Stranded RNA Virus from aStrain of the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka，， Virus Genes25: 2， 139-145， 2002。

【發明內容】

[0013]發明所要解決的課題
上述專利文獻4中，雖然公開了將植物病害真菌減毒的真菌病毒，但使用該真菌病毒和感染了該真菌病毒的植物病害真菌減毒株時的防治效力還談不上充分，人們要求達到更高的防治效力。因此，本發明的目的在于提供:對植物病害真菌具有更優異的防治效果的真菌病毒、感染了該真菌病毒的植物病害真菌、包含該真菌病毒和/或該植物病害真菌的植物病害防治劑、使用該真菌病毒和/或該植物病害真菌的植物病害防治方法、以及植物病害真菌的減毒方法。
[0014]解決課題的方法
達成上述目的的本發明包含下述內容。
[0015](I)真菌病毒，其特征在于:具有五種雙鏈RNA，該五種雙鏈RNA中有四種雙鏈RNA分別相對于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性。
[0016](2) (I)所述的真菌病毒，其特征在于:該五種雙鏈RNA分別為包含SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所不的核苷酸序列的多核苷酸。
[0017](3)植物病害真菌，其中，上述(I)或上述(2)的真菌病毒感染了宿主。
[0018](4) (3)所述的植物病害真菌，其特征在于:上述宿主為水稻稻瘟病菌。
[0019](5)植物病害防治劑，其中包含上述(I)或上述⑵所述的真菌病毒或上述(3)或
(4)所述的植物病害真菌。
[0020](6)植物病害真菌防治方法，該方法包括:使上述(5)所述的植物病害防治劑與植物接觸的步驟。
[0021](7)植物病害真菌減毒方法，該方法包括:使上述(I)或上述(2)所述的真菌病毒感染植物病害真菌的步驟。
[0022](8) (7)所述的植物病害真菌減毒方法，其特征在于:上述植物病害真菌為水稻稻瘟病菌。
[0023] 本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本國專利申請2011-38951號的說明書和/或附圖中記載的內容。
[0024]發明效果
與以往的真菌病毒相比，本發明的真菌病毒對植物病害真菌的防治效力非常優異。因此，通過使用本發明的真菌病毒和該真菌病毒感染的植物病害真菌，可以以較以往優異的效率防治植物病害。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是顯示觀察PDA培養基中的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株的集落的結果的照片；
圖2是顯示在PDA培養基中觀察水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株的病毒治愈株的集落的結果的照片；
圖3中，(A)是顯示水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株及其病毒治愈株的菌絲產量的特性圖，(B)是顯示水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株及其病毒治愈株的菌絲產量的特性圖；
圖4是顯示噴霧接種水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株時的病斑數的柱形圖；
圖5是MoCV3顆粒的電子顯微鏡照片；
圖 6 是顯示通過 PCR 擴增 MoCV3 全長 cDNA 克隆 dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和dsRNA5后，再亞克隆到pUC19中的質粒的構成的圖；
圖7是顯示用于構建穿梭載體的pRSA313、pRSA314和pRSA315的構成的圖；
圖8是顯示用于構建穿梭載體的pRSA316和pRSA317的構成的圖；
圖9中，(a)是顯示通過蔗糖濃度梯度離心分餾重構建的MoCV3，再使用抗MoCV3抗血清對所得的組分進行蛋白質印跡分析的結果的圖；(b)是顯示使用電子顯微鏡觀察MoCV3病毒樣顆粒的結果的圖。
【具體實施方式】[0026]以下，詳細說明本發明。本發明的真菌病毒具有五種雙鏈RNA。這五種雙鏈RNA中，有四種雙鏈RNA分別包含相對于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性的核苷酸序列。本發明的真菌病毒具有感染水稻稻瘟病菌(學名“Magnaporthe oryzae (稻瘟病菌)”)、并將水稻稻瘟病菌等植物病害真菌減毒的功能。
[0027]作為本發明的真菌病毒的一個例子，具有包含SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的五種雙鏈RNA。需要說明的是，序列表中的SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5的核苷酸序列均以DNA序列的形式記載，但它們均還包含RNA情形的序列(胸腺嘧啶被取代成尿嘧啶的序列)。
[0028]本發明的真菌病毒可以以內含在水稻稻瘟病菌內的形式保存。作為本發明的真菌病毒的一個例子，可以列舉本發明人等鑒定、命名的MoCV3 (Magnaporthe oryzaechryso virus 3，稻溫病菌金色病毒屬3)。該MoCV3具有包含SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的五種雙鏈RNA，以內含在水稻稻瘟病菌內的形式保存。
[0029]內含該MoCV3的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株在獨立行政法人制品評價技術基礎機構特許微生物保藏中心，以內含病毒為理由，證明為不適于保藏。另外，本菌保存在國立大學法人東京農工大學農學部植物病理學研究室，在遵守各法令的條件下，可以轉讓給第三方。另外，將本菌保藏在美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection)的手續正在進行中。
[0030]需要說明的是，本菌株的原產地是越南。雙鏈RNA中，在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中包含編碼RdRp (RNA依存性RNA合成酶)的保守基序的區，并且該區的核苷酸序列與金色病毒科病毒具有同源性。因此，推測該真菌病毒是分類為金色病毒科的新型病毒。
`[0031]該MoCV3與國際公開W0/2009/093409號公報中公開的MoCVl非常類似，但與MoCVl相比不同點在于:其水稻稻瘟病菌的減毒能力優異。另外，MoCV3中的五種雙鏈RNA中，SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的四種雙鏈RNA相對于MoCVl的四種雙鏈RNA分別顯示出80.5%,74.5%、71.3%和72.5%的同源性。即，含有包含相對于SEQ ID NO:1~SEQID NO: 4所示的四種雙鏈RNA分別具有81%、75%、72%和73%以上的同源性的核苷酸序列的四種雙鏈RNA的真菌病毒作為新型真菌病毒包含在本發明的技術范圍內。
[0032]另外，本發明的真菌病毒具有相對于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列分別具有例如85%以上、優選90%以上、更優選95%以上、最優選97%以上的同源性的五種雙鏈RNA，可以是能夠將水稻稻瘟病菌等植物病害真菌減毒的真菌病毒。這里，“同源性”是指核苷酸序列完全一致，而“類似性”是指通過取代腺嘌呤和鳥嘌呤、或胸腺嘧啶(尿嘧啶)和胞嘧啶，核苷酸序列完全一致。
[0033]需要說明的是，本發明的真菌病毒不限于該MoCV3，還包含向MoCV3中人為或自然地導入突變的真菌病毒。即，本發明的真菌病毒可以是能夠將水稻稻瘟病菌等植物病害真菌減毒的突變體，是相對于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列有I個或多個(例如2~100個、優選2~50個、更優選2~25個、最優選2~10個)核苷酸被取代、缺失、添加或插入的核苷酸序列。
[0034]另外，在SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列中，分別包含蛋白的編碼區。由SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5包含的編碼區所編碼的推測蛋白的氨基酸序列分別見 SEQ ID NO: 6 ~SEQ ID NO: 10。
[0035] 本發明的真菌病毒具有抑制植物病害真菌的生長等的作用。因此，例如用該真菌病毒感染規定的植物病害真菌，使其內含在該植物病害真菌內，從而可以制作該植物病害真菌的減毒菌株。
[0036]另外，例如通過將含有本發明的真菌病毒和/或所制作的植物病害真菌的減毒菌株的植物病害防治劑附加(散布、涂布等)在植物(水稻等)上，有可能可以防治其植物病害。此外，本發明的真菌病毒具有以下特征。以往，真菌病毒是通過菌絲融合從宿主菌的細胞垂直傳播給細胞，認為在真菌病毒的生活鏈中不存在存在于宿主菌的細胞外的階段。相對于此，通過本發明人等的研究，可知本發明的真菌病毒還可以存在于細胞外。
[0037]因此，可以不依賴于菌絲融合而從細胞外感染宿主菌，所以即使在接合型的不同的菌主、菌株間，也可以廣泛地感染本發明的真菌病毒，而且，還可以高效率地感染宿主菌。即，由此可以簡易且高效率地進行植物病害真菌的減毒或植物病害的防治的可能性大。
[0038]另外，由于本發明的真菌病毒還存在于細胞外，所以例如通過在液體培養基中培養宿主菌,再從其培養上清中回收真菌病毒,可以簡易且較大量地生產真菌病毒。
[0039]當本發明的真菌病毒內源性地存在于規定的水稻稻瘟病菌中時，例如可以利用公知的方法從該水稻稻瘟病菌株中進行分離、回收。需要說明的是，內含本發明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌可以在與普通的水稻稻瘟病菌相同的培養基、培養條件下進行培養。
[0040]<關于本發明的基因、核酸、蛋白等>
本發明人等對本發明的一個真菌病毒進行序列分析，得到了全長的核苷酸序列(SEQID NO:1~SEQ ID NO: 5)。因此，該真菌病毒基因、具有其核苷酸序列或其中一部分序列的核酸、這些核苷酸序列所編碼的蛋白等均包含在本發明內。
[0041]本發明還包含所有的具有上述的全部或一部分核苷酸序列的核酸。核酸可以是雙鏈、單鏈中的任一種，另外還包含所有的DNA、cDNA、RNA等。
[0042]例如,SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5的全部或任意一個序列、該序列中具有規定功能的特定部分的序列、具有與這些序列同等的核苷酸序列的cDNA、插入了與這些序列同等的核苷酸序列的重組載體(質粒、病毒等)等也包含在本發明內。
[0043]序列分析的結果可知:在SEQ ID NO:1的序列部分中，存在RdRp (RNA依賴性RNA合成酶)的保守基序；以及在SEQ ID NO: 4的序列部分與法蘭西病病毒(La Francedisease virus)的雙鏈RNA片段具有同源性。因此，根據目的、用途，例如作為具有規定功能的特定部分，可以制作、使用至少具有上述序列部分的核酸、重組載體等。
[0044]需要說明的是，本發明的核酸(或基因)中，還廣泛包含與上述核苷酸序列具有同源性的核酸、例如和包含與其核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸在嚴格條件下雜交、且具有水稻稻瘟病菌抑制作用的核酸。這里，嚴格條件可以通過雙鏈核酸的Tm值等公知技術而獲得。
[0045]本發明還包含上述的真菌病毒基因和核酸所編碼的所有蛋白。本發明的蛋白的氨基酸序列見 SEQ ID NO: 6 ~SEQ ID NO: 10。
[0046]SEQ ID NO: 6是SEQ ID NO:1記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQID NO: 7是SEQ ID NO: 2記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8是SEQ ID NO: 3記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQ ID NO: 9是SEQ ID NO:4記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQ ID NO: 10是SEQ ID NO: 5記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列。
[0047]需要說明的是，本發明的蛋白除了包含具有SEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 10的任意一個氨基酸序列的蛋白，還包含所有的與這些蛋白具有同源性且保持其功能的蛋白。
[0048]例如，通過在重組載體中插入上述的核酸、并使之在該宿主中強制表達，有可能可以大量制備這些蛋白。認為宿主可以使用大腸桿菌類、酵母類、培養細胞等公知的宿主。若考慮到真菌病毒感染真菌、以及酵母類具有高增殖性且利用也比較簡便等，作為宿主，酵母類有可能最適合。關于重組載體，認為可以使用公知的重組載體。
[0049]另外，例如通過使用多個插入有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO: 5中的任意一個的載體，使這五種基因中的多個共表達，可以重建真菌病毒。這種情況下，也可以使用公知的宿主和公知的重組載體，在可以同時導入多個載體方面，酵母類成為最適合的宿主。需要說明的是，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO: 5所示的五種核酸片段，可以通過以從真菌病毒中提取的dsRNA為模板的RT-PCR法來獲得。另外，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO: 5所示的五種核酸片段還可以根據其序列信息進行全合成。換言之，即使本發明的真菌病毒本身和/或內含該真菌病毒的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株沒有保藏在保藏機關，本領域技術人員也可以使用上述重組載體來制造該真菌病毒。
[0050]<關于植物病害真菌減毒菌株>
本發明的植物病害真菌減毒菌株包含所有的內含本發明的真菌病毒的菌株。即，例如包含已經內含該真菌病毒的水稻稻瘟病菌等菌株和感染了該真菌病毒的植物病害真菌的菌株兩者。
[0051]作為使真菌病毒感染植物病害真菌等的方法，例如有如以往所述在菌絲融合時使宿主菌感染的方法。另外，如上所述，本發明的真菌病毒還能夠存在于細胞外，因此例如還可以從細胞外直接感染宿主菌。
[0052]作為該植物病害真菌減毒菌株的例子，可以列舉上述的S-0412-1I 2a株。該菌株是感染了本發明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌的菌株。因此，其形態的性質、培養的性質、胞子形成、生理學?化學分類學的性質基本上與公知的水稻稻瘟病菌相同。但是，其較普通的水稻稻瘟病菌生長快，菌絲成長成非同心圓狀，色素沉著也不均勻。另外，發現氣生菌絲異常發達，觀察到扇形面形成或溶菌。
[0053]<關于植物病害防治劑>
本發明的植物病害防治劑包含所有的至少含有本發明的真菌病毒或本發明的植物病害真菌減毒菌株的任意一方的植物病害防治劑。另外，可以含有該真菌病毒和該植物病害真菌減毒菌株兩者，也可以含有其他成分。
[0054]作為其他成分，例如可以含有規定的載體、粘合劑、增稠劑、固著劑、防腐防霉劑、溶劑、穩定化劑、抗氧劑、防紫外線劑、防晶體析出劑、消泡劑、物性提高劑、著色劑等。另外，還可以含有其他農藥成分、例如殺螨劑、殺線蟲劑、殺菌劑、抗病毒劑、誘導劑、除草劑、植物生長調節劑、增效劑等。
[0055]作為載體，例如可以使用固體載體和/或液體載體。作為固體載體,例如可以列舉:淀粉、活性炭、大豆粉、小麥粉、木粉、魚粉、奶粉等動植物性粉末；滑石粉、高嶺土、膨潤土、沸石、硅藻土、白炭黑、粘土、氧化鋁、碳酸鈣、氯化鉀、硫胺等礦物性粉末。作為液體載體，例如可以列舉:水、異丙醇、乙二醇等醇類；環己酮、丁酮等酮類；丙二醇單甲醚、二甘醇單正丁醚等醚類；煤油、輕油等脂肪族烴類；二甲苯、三甲基苯、四甲基苯、甲基萘、溶劑石腦油等芳族烴類；N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺類；脂肪酸的甘油酯等酯類；大豆油、菜籽油等植物油。
[0056]作為粘合劑、增稠劑、固著劑，例如可以列舉:淀粉、糊精、纖維素、甲基纖維素、乙
基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基淀粉、普魯蘭多糖、海藻酸鈉、海藻酸銨、海藻酸丙二醇酯、瓜爾膠、刺槐豆膠、阿拉伯膠、黃原膠、明膠、酪蛋白、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇、乙烯?丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸鈉、聚乙稀批略燒麗等。
[0057]對本防治劑的劑型沒有特別限定。例如可以使用乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、片劑、水合劑、水溶劑、液劑、流動劑、顆粒水合劑、氣溶膠劑、糊劑、油劑、乳濁劑等形式。
[0058]<關于植物病害真菌抑制性真菌病毒生產方法>
本發明的植物病害真菌抑制性真菌病毒生產方法，其包含所有的至少包含下述步驟的方法，所述步驟是指用液體培養基等培養含有真菌病毒的植物病害真菌，并從其培養上清中回收真菌病毒的步驟。
[0059]如上所述，本發明的真菌病毒還能夠存在于宿主菌的細胞外。因此，例如用液體培養基等培養感染了真菌病毒的植物病害真菌，通過離心分離來分離菌體，之后從其培養上清中分離、回收病毒，從而可以簡易且較大量地回收病毒。
[0060]但是，本發明的真菌病毒并不局限于利用該生產方法得到的真菌病毒。即，本發明還廣泛包含例如從內含真菌病毒的水稻稻瘟病菌中分離、回收而獲得的真菌病毒。
[0061]另一方面，作為本發明的植物病害真菌抑制性真菌病毒生產方法，還包括下述方法:如上所述，使用多個插入有SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5的任一個核酸片段的載體，使這五種基因中的多個在宿主細胞內共表達，回收在該宿主細胞內重建的真菌病毒的方法。作為宿主細胞，可以使用酵母。作為用于插入上述五種基因的載體，只要是可以使所插入的基因在宿主細胞內表達的載體即可，沒有特別限定，可以使用任何載體。另外，關于插入到載體中的核酸片段，可以根據SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列進行全合成。
[0062]<關于植物病害真菌減毒方法>
如上所述，例如通過使本發明的真菌病毒感染特定的植物病害真菌等，可以抑制該宿主菌的生長等，將該菌減毒。關于真菌病毒的感染方法，可以采用與上述相同的方法。
[0063]<關于植物病害防治方法>
本發明的植物病害防治方法，其包含所有的至少包含下述步驟的方法，所述步驟是指將上述的水稻稻瘟病防治劑附加在特定的植物(水稻等)上的步驟。
[0064]作為在植物上附加防治劑的方法，例如可以列舉:在葉的表面或背面涂布防治劑的方法、使用規定的載體等使防治劑附著在葉的表面或背面的方法、向葉上散布或供給防治劑的方法等。
[0065]關于防治劑的涂布量或散布量，根據有效成分的濃度、制劑的形態、對象病害或作物的種類、病害所引起的被害的程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用?并用的藥劑或肥料等的使用量、種類等各種條件，可以適當選擇。
[0066]例如，通過向每片葉子噴灑或供給I~1，OOOmL調整至IX IO3~IX 101°個/mL的水稻稻痕病菌減毒菌株的分生孢子(conidia)含有液，另外通過在每Imm2的葉子上，在葉表面或背面涂布或附著IXlO3~IXIOki個水稻稻瘟病菌減毒菌株的分生孢子，有可能可以抑制植物病害。
[0067]另外，將培養上清中存在的MoCV3適度稀釋得到的病毒溶液(原液的10倍~100倍左右)、或者將由水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株的菌體提取的MoCV3病毒顆粒成分適度稀釋，直接散布在水稻葉上，從而可以實現具有對水稻稻瘟病菌的防治效果、或治愈效果的水稻稻瘟病菌的防治法。作為實際的防治效力，使用MoCV3作為病毒散布劑時，得到了 63.6以上的防治效力的結果，可以得到國際公開W0/2009/093409號公報中公開的MoCVl的防治效力即56.8以上的優異的結果。
[0068]本發明有可能可以適用于以真菌作為主要病因的所有的植物病害。作為具有應用可能性的植物病害，例如可以列舉下述植物病害(并不限于這些)。
[0069]作為水稻科植物的植物病害，例如有:水稻稻瘟病(病原菌為“稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) ”)、水稻芝麻葉枯病(病原菌為“宮部旋孢腔菌iCochliobolusmiyabeanus) ”)、紋枯病(病原菌為“水稻紋枯病菌(Jhanatephorus cucumeris) ”)、惡苗病(病原菌為“騰倉赤霉{Gibberella”)、立枯病(病原菌為“鐮刀菌(Fusarium菌)”、“根霉{Rhizopus)菌”、“腐霉(Pythium)菌”、“綠色木霉 ijrichoderma viride) ”)、稻曲病(病原菌為“麥角菌屬菌{Claviers Kirez7l5) ”)、麥類的赤霉病(病原菌為“玉米赤霉{Gibberella zeae) ”、“燕麥鍵刀菌 ipusarium avenaceum) ”、“大刀鍵刀菌 ifusariumcu Imorum) Monographella nivale” )、雪腐病(病原菌為“腐霉菌(Pythium 菌)”、“瑚菌{Typhula菌)”、“雪腐明梭孢iMonographella ni valis) ”、“小麥雪霉葉枯病有性(Myriosclerotinia AoreaJi1S) ”)、散黑穗病(病原菌為“裸黑粉菌 iUstilago /wt/a)”)、小麥矮腥黑穗病(病原菌為“小麥矮腥黑穗菌UilletiamrM) ”)、眼斑病(病原菌為“小麥基腐病菌(Pseudocerco sporella AerjDotricAoiofe1S) ”)、葉斑病(病原菌為殼針孢類葉枯病菌“ tritici) ”)、穎枯病(病原菌為“小麥穎枯病菌{Phaeosphaerianodorum) ”)、白粉病(病原菌為“小麥白粉病菌iBlumeria graminis) ” )。
[0070]作為其他的植物病害，例如有:柑桔類的黑點病(病原菌為“柑橘間座殼菌Wiaporthe ci tri) ”)、小黑點病(病原菌為“ QJiaporthe medusa) ”、“柑桔鏈格孢菌(Alternaria ci tri) ” )、瘡痂病(病原菌為“柑桔痂囊腔菌 iBlsinoe fawcettii) ”)、褐色腐敗病(病原菌為“柑橘褐腐疫霉{Phytophthora citrophthraTUm'm (病原菌為“指狀青霉iPenicillium digitatum) ”、、著霉病(病原菌為“意大利青霉菌iPenicillium
蘋果的花腐病(病原菌為“蘋果鏈核盤菌(Monilinia黑星病(病
原菌為“蘋果黑星菌iyenturiei”)、斑點落葉病(病原菌為“蘋果斑點落葉
病病菌ternaria mali) ”)、黑點病(病原菌為“蘋果斑點小球殼菌iMycosphaerelIapomi) ”)、煤斑病(病原菌為“仁果粘殼孢{Gloeodes pomigena) ”)、煤點病(病原菌為“ (^ygophiala jamaicensis) ”)、輪紋病(病原菌為“蘋果輪紋病菌{BotryosphaeriaAereflgeriaaa) ”)、褐斑病(病原菌為“蘋果雙殼菌(Piplocarpon /mJ/) ”)、赤星病(病原菌為“蘋果赤星病菌iGymnosporangium yamadae)”、)、腐1 爛鬼(病原菌為“蘋果樹腐爛病菌(VaIsa C6?ra(05776?/m3) ”)、梨的黑星病(病原菌為“梨黑星病菌(Jenturia nashicola)”、、赤星病(病原菌為“梨膠銹菌{Gymnosporangium asiaticum)”)、輪級病(病原菌為“輪紋病菌(Botryosphaeria Aereflgeriaaa) ”)、胴枯病(病原菌為“梨褐腐病菌(Phomopsis/i/ksAii) ”)、桃的縮葉病(病原菌為“桃縮葉病菌{Taphrina ofe/h/mms) ”)、灰星病(病原菌為“桃褐腐菌(Monilinia />Y/c(ico7a) ”、“蘋果褐腐菌(Monilinia fructigenay,)星病(病原菌為“嗜果枝孢霉{Cleidosporium carmphiluniY")、褐腐病(病原菌為“擬莖點霉{Phomopsis sp.) ”)、黃桃的灰星病(病原菌為“桃褐腐病菌(Monilinia fructicola) ”、“蘋果褐腐菌(Monilinia fructigena) ”)、幼果菌核病(病原菌為“ (Moniliniakusanoi) ”)、梅子的黑星病(病原菌為“嗜果枝孢菌{Cladosporium carpophilum) ”)、葡萄的黑痘病(病原菌為“葡萄黑痘病菌msinoe ampema)”)、晚腐病(病原菌為“尖孢炭疽菌{Colletotrichum”、“杉木炭疽病菌{Glomerella”)、褐斑
病(病原菌為“葡萄擬尾孢菌(Pseudocercospora”)、蔓割病(病原菌為“擬莖點
霉病菌(Phomopsis”)、柿的角斑落葉病(病原菌為“柿角斑病菌{Cercospora
”)、圓星落葉病(病原菌為“柿葉球腔菌iMycosphaerella flawae) ”)、茶的輪斑病(病原菌為 “”、“茶輪斑病菌 iPestalotiopsis theae) ”)、
揭色圓星病(病原菌為 “ {Pseudocercospora ocellata) ”、“ {Cercospora chaae) ”)、茶餅病(病原菌為“壞損外擔菌iBxdmsidium J^raz7lS) ”)、茶網餅病(病原菌為“網狀外擔菌Qixobasi di um re ti cula turn) ”)、瓜類的蔓枯病(病原菌為“蔓枯病菌 iMycosphaerellame1nis) ”)、蔓割病(病原菌為“尖孢鐮刀菌iFusarium oxysporum) ”)、黑星病(病原菌為“黃瓜黑星病菌{Cladosporium cucumerinum) ”)、褐斑病(病原菌為“多主棒孢菌{pjrynespora cassiicola) ”)、西紅柿的葉霉病(病原菌為“番爺葉霉病菌{Fulvia/Wra)”)、輪紋病(病原菌為“番茄早疫病菌{AltGnrnvia茄子的褐紋
病(病原菌為“茄褐紋病菌iPhomo`psis vexans) ”)、煤霉病(病原菌為“灰毛茄菌絨孢菌(Mycovollosiollei”)、十字花科野菜的白點病(病原菌為“大孢白銹菌
(Albugo ?acras77ora) ”)、白斑病(病原菌為“白斑病菌{Cercosporella brassicae)”、“蕓苔假小尾孢{Pseudocercosporella”)、洋蔥的灰色腐敗病(病原菌為“蔥
腐葡萄孢切。trytis allii) ”)、草莓蛇眼病(病原菌為“草莓球腔菌(Mycosphaerella/ragariae) ”)、馬鈴薯的夏疫病(病原菌為“馬鈴薯早疫病菌iAltorrmri3 solanf)”、、欠豆的莖疫病(病原菌為“大豆疫霉菌iPhytophthora”)、紫斑病(病原菌為“大豆
紫斑病菌{Cercospora AitocAii) ”)、赤豆的莖疫病(病原菌為“紅豆疫霉iphytophthora”)、落花生的褐斑病(病原菌為“落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidis)”)、甜菜的褐斑病(病原菌為“甜菜褐斑病菌{Cercospora知(icoh) ”)、葉腐病(病原菌為“水稻紋枯病菌iJhanatephorus”)、矮草的彎孢霉葉枯病(病原菌為“彎孢
菌 iCurvularia 菌)”)、銀圓斑病(病原菌為“核盤菌{Sclerotinia homoeocarpa) ”)、螺孢屬葉枯病(病原菌為“旋孢腔菌菌)”)、薔薇的黑星病(病原菌為“薔薇雙殼菌(Piplocarpon rosae) ”)、菊花的白銹病(病原菌為“堀氏菊柄銹菌{Pucciniahoriana) ”)、各種作物的霜霉病(病原菌為“霜霉病菌iPeronospora菌)”、“假雙霉屬菌iPseudoperonospora 菌)”、“單軸霉屬菌 QjIasmopara 菌)”、“盤梗霉屬菌(Bremia 菌)”)、疫病(病原菌為“疫霉菌(Phytophthora菌)”)、白粉病(病原菌為“白粉菌{Erysiphe菌)”、“布氏白粉菌屬菌Qilumeria菌)”、“單絲殼屬菌{Sphaerotheca菌)”、“叉絲單囊殼屬{Podosphaera 菌)”、“球針殼屬菌(Phyllactinia 菌)”、“鉤絲殼屬菌 Wncinula 菌)”、“擬粉孢屬菌{Oidiopsis菌)”)、銹病(病原菌為“柄銹菌屬菌iPuccinia菌)”、“單孢銹菌屬菌Wromyces菌)”、“銹菌iPhysopella菌)”)、黑斑病(病原菌為“鏈格孢屬菌(AlternariaMy,)、灰霉病(病原菌為“灰霉菌lBotrytis cinerea)，，)、菌核病(病原菌為“菌盤菌{Sclerotinia”)、白紋羽病(病原菌為“褐座堅殼菌{RoselIinia
necatrix)，，)、紫紋羽病(病原菌為“桑卷擔菌iBelicobasidium mompa)，，)、白絹病(病原菌為“白絹病菌ISclerotium rWAii) ”)、其他各種土壤病害(病原菌為“鐮刀菌(Fusarium菌)”、“絲核菌{Rhizoctonia 菌)”、“腐霉菌{Pythium 菌)”、“絲囊霉菌{Aphanomyces 菌)”、“莖點霉菌{Phoma 菌)”、“輪枝菌{VerticilIium 菌)”、“蕓藍根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)，，等)。
實施例
[0071]下面，利用實施例來更詳細地說明本發明，但本發明的技術范圍并不限于下述實施例。
[0072]〔實施例1〕
在本實施例中，根據國際公開W0/2009/093409號公報中公開的方法，分離鑒定內含新型真菌病毒的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株。具體而言，分別培養本實施例中分離鑒定的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株和國際公開W0/2009/093409號公報中鑒定的內含真菌病毒的水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株，觀察集落。在這些水稻稻瘟病菌的培養中使用PDA培
養基。結果見圖1。
[0073]如圖1所示，本實施例中鑒定的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株顯示出白化的菌叢，觀察到生長抑制。另外，還完全觀察不到分生孢子形成。另外，水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株不同于水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株，其在PDA培養基上形成了集落，該集落的特征在于:不會發生色素沉著(黑色素化)，顯示出氣生菌絲的生長抑制、濕化等異常的生長不良。
[0074]另外，制作上述水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌株S-0412-1IIa株的病毒治愈株，同樣進行集落觀察。結果見圖2。需要說明的是，病毒的治愈方法根據國際公開W0/2009/093409號公報中公開的方法來進行。如圖2所示，兩個菌株均通過病毒治愈而形成了與普通的稻瘟病菌相同的集落。
[0075]而且，比較水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株以及它們的病毒治愈株的生長速度。作為比較的方法，測定從培養基的中心到菌絲頂端的距離。需要說明的是，所有菌株的生長條件如下:使用PDA培養基，以明期12小時和暗期12小時作為循環，培養天數為9天。結果見圖3A和3B。圖3A是水稻稻瘟病菌株S-0412-1I2a株及其病毒治愈株的測定結果。圖3B是水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株及其病毒治愈株的測定結果。如圖3A和3B所示，關于水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株，即使通過病毒治愈，在生長速度上也沒有發現顯著的差異，但在水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中，生長速度存在顯著的差異，可知病毒感染株的生長速度降低。
[0076]由上述圖1和圖2的結果可知:兩菌株均因內含真菌病毒而出現生長抑制。另外，如圖3所示，在本實施例中，與水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株中內含的真菌病毒(MoCVl)相比，水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中內含的真菌病毒對水稻稻瘟病菌具有更強效的生長抑制能力。
[0077]將本實施例中分離鑒定的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中內含的真菌病毒命名為MoCV3。結論是:該MoCV3是水稻稻瘟病菌的強效的生長抑制因子(減毒因子)。
[0078]〔實施例2〕
在本實施例中，研究實施例1中分離鑒定的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中內含的MoCV3是否還存在于菌體外。
[0079]在實施例1中在2.8~3.6kb檢測到五種成分的內源性雙鏈RNA的譜帶的菌株中，將3株移植到液體培養基中進行培養，之后將培養液離心，回收其培養上清。接下來，將所得的培養上清在1%瓊脂糖凝膠中、20V下電泳18小時，用溴化乙錠進行染色。
[0080]其結果，在上述菌株的培養上清中，在與菌內源性雙鏈RNA相同的位置也檢測到雙鏈RNA的譜帶。該結果顯示:本發明的真菌病毒不僅存在于水稻稻瘟病菌的菌體內還存在于菌體外。
[0081] 〔實施例3〕
在本實施例中，研究存在于菌體外的真菌病毒MoCV3是否具有對正常菌株(未保有真菌病毒的菌株)感染能力。
[0082]首先，將水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株移植到液體培養基中，培養4周后，將培養液離心，回收其培養上清。對于該培養上清，按照與實施例2相同的步驟，在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，結果可以確認到雙鏈RNA的譜帶。對于所得的培養上清，使用0.22 y L的濾器進行過濾滅菌。
[0083]接下來，將50ml YG培養基裝入100ml的燒瓶(Kolben)中，在其中接種水稻稻瘟病菌的正常菌株(未保有真菌病毒的菌株)，培養3天后，添加500 u L所得的培養上清，觀察菌體的生長。
[0084]其結果，在觀察的第3天，在沒有添加培養上清的菌株中，菌絲的頂端筆直地伸展，顯示出正常的生長，相對于此，在添加了培養上清的菌株中，菌絲的頂端不太伸展，形成纏繞狀態。
[0085]認為該結果是由于:存在于培養上清中的真菌病毒感染了水稻稻瘟病菌正常菌株，抑制了其生長的緣故。即，本實驗結果顯示:存在于菌體外的真菌病毒具有對正常菌株的感染能力。
[0086]〔實施例4〕
在本實施例中，對于感染了真菌病毒的水稻稻瘟病菌株，測定其分生孢子數。
[0087]將水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株移植到YG板上，培養兩周后，用直徑為4mm的打孔器(cork ball)選取、采集菌體。接下來,在1.5ml試管中加入5%的甘油,再加入采集的菌體，混和5分鐘使其懸浮。然后，使用血細胞計算盤測量懸浮液中存在的分生孢子數。
[0088]其結果，在水稻稻瘟病菌的正常菌株(對照，未保有真菌病毒的菌株)中，分生孢子數為33X IO4個/mL，相對于此，在水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中，分生孢子數為
IX104f/mL 以下。
[0089]該結果顯示:本發明的真菌病毒抑制宿主菌的分生孢子形成。即，MoCV3抑制植物病害菌的增殖，同時還可以抑制其傳播、感染擴大等。
[0090]〔實施例5〕
在本實施例中，分析從水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中提取的雙鏈RNA的核苷酸序列。來自水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株的雙鏈RNA的提取、純化、以所得的雙鏈RNA為模板的cDNA的合成、接著利用5’ RACE法進行的兩末端序列的分析，均按照國際公開W0/2009/093409號公報中公開的方法來進行。
[0091]其結果，明確了 MoCV3中包含五種雙鏈RNA。這五種雙鏈RNA的核苷酸序列見SEQID NO:1~SEQ ID NO: 5。需要說明的是，為了將雙鏈RNA取代成cDNA進行序列測定，在序列表中“尿嘧啶”被取代成“胸腺嘧啶”。
[0092]需要說明的是，對所得的核苷酸序列進行分析，其結果，在SEQ ID NO:1所示的RNA序列中，不包含存在于全病毒及其近緣病毒等中的RdRp (RNA依賴性RNA合成酶)的保守基序。另外，在SEQ ID NO: 4所示的RNA序列中，包含與法蘭西病病毒的L3雙鏈RNA片段具有同源性的區域。
[0093]該結果顯示:本發明的五種雙鏈RNA是新型真菌病毒的基因信息。
[0094]〔實施例6〕
在本實施例中，利用噴霧接種法研究水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株對植物病害真菌的防治是否有效。
[0095]將水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株接種在燕麥培養基板上，在25°C的室內培養。接種后第15天，在分生孢子沒有充分形成的情況下，向板上注入2mL左右的滅菌蒸餾水，用筆蹭(C + c 7:)培養基表`面，去除氣生菌絲，將該板在不可見光下放置3天，誘導分生孢子形成，再注入ImL左右的滅菌蒸餾水，再次用筆蹭培養基表面，連氣生菌絲一起回收分生孢子，得到分生孢子含有液。接種后第15天，在分生孢子沒有充分形成的情況下，向板上注入2mL左右的滅菌蒸餾水，用筆蹭培養基表面，連氣生菌絲一起回收分生孢子，得到分生孢子含有液。另外，作為對照，按照與實施例1相同的步驟制作水稻稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株，按照相同的步驟由該菌得到分生孢子含有液。
[0096]接下來,用Kimwipe或紗布過濾上述的分生孢子含有液,將分生孢子濃度調節至
2X IO6個/mL，再加入0.02%(v/v)的吐溫20，制成分生孢子懸浮液。
[0097]接下來，使用噴嘴向水稻苗(考慮到稻瘟病真性抵抗性基因型和菌的種族(race)而適當選擇的品種，接種后第2~3周的水稻苗)均勻地噴灑分生孢子懸浮液，將植物體在26°C、相對濕度為100%的接種箱中靜置24小時，之后將容器移到溫室中，維持室溫在23~300C，噴霧接種后培養7天。然后，在噴霧接種后第7天，測量每個一定葉面積上的達到3~4mm的罹病性病斑的數目。
[0098]結果見圖4。圖4是顯示接種了水稻稻瘟病菌的葉上的病斑數的柱形圖。圖中，縱軸表示接種了水稻稻瘟病菌的葉上的病斑數。圖中，“混合感染株”表示噴灑由感染了本發明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌制備的分生孢子懸浮液時的病斑數，“完全治愈株”表示噴灑由水稻稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株制備的分生孢子懸浮液時的病斑數(對照)。
[0099]如圖4所示，噴灑由感染了本發明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌制備的分生孢子懸浮液時，與對照相比，病斑數明顯減少。該結果顯示:水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株對植物病害真菌的防治有效。[0100]〔實施例7〕
在本實施例中，通過沖孔帶傷接種法(付傷接種法)研究水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株對植物病害真菌的防治是否有效。
[0101]按照與實施例6相同的步驟制備分生孢子懸浮液，使該懸浮液附著在3%普通瓊脂膜上，切下邊長為約2mm的正方形瓊脂膜，制作瓊脂片。使用接種用沖頭剪下在23~30°C的溫室中栽培的水稻的第4片葉，造成浸潤狀的傷，將瓊脂片放在其帶傷部分，將植物體在26°C、相對濕度為100%的接種箱中靜置24小時，之后將箱(pot)移到溫室中，維持室溫在23~30°C，接種后培養14天。然后，在接種后第14天測量病斑的大小。
[0102]其結果，接種由水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株制備的分生孢子懸浮液時，與對照相比，病斑的大小明顯小。該結果顯示:與實施例6 —樣，本發明對植物病害真菌的防治有效。
[0103]〔實施例8〕
在本實施例中，通過電子顯微鏡鑒定存在于菌體外的MoCV3顆粒。在這之前，與公開的方法一樣，對MoCV3的病毒顆粒進行生化學特性分析。其結果，通過SDS-PAGE明確了病毒蛋白的主要成分(外皮蛋白)的分子量為約70kDa的大小。即，可以確認MoCV3顆粒的存在。
[0104]在電子顯微鏡觀察中，首先，在YG培養基(0.5%的酵母提取物，2%的葡萄糖)中培養水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株，從其培養上清中分離病毒顆粒。將該培養上清離心(10，000 X g、5分鐘)，再將該上清超離心(100，000 X g、30分鐘)，得到包含病毒顆粒的沉淀物。將該沉淀物溶解在0.05M的磷酸緩沖液(pH7.0)中，使用磷鎢酸或乙酸鈾進行負染色，在電子顯微鏡(倍率:X 20，000~40，000)下觀察。
[0105]結果見圖5。圖5是由水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株的培養上清得到的病毒顆粒的電子顯微鏡照片。如圖5所示，利用電子顯微鏡可以鑒定本發明的真菌病毒的病毒顆粒。該病毒顆粒呈邊長為約30~40nm的正六邊形形狀,包含在被膜樣(envelope-like)的結構中。
[0106]〔實施例9〕
在本實施例中，將所分尚的MoCV3作為散布劑直接散布在水稻葉上,研究其對水稻稻瘟病菌的防治效果和治愈效果。
[0107]具體而言，準備將存在于培養上清中的MoCV3適度稀釋而得到的病毒溶液(原液的10倍~100倍左右)作為病毒噴霧液。接下來，對從發芽起經過2周~3周的水稻苗噴灑稀釋了的來自培養上清的病毒溶液后，接下來使其感染水稻稻瘟病菌，然后算出各試驗區的防治效力。按照與用于特定防治物資(特定農藥)指定的評價有關的準則，以防治效力=100 —(處理區的被害/未處理區的被害)XlOO的形式算出防治效力。
[0108]其結果，使用MoCV3作為病毒散布劑時，得到了 63.6以上的防治效力的結果。另外，利用相同的方法，計算國際公開W0/2009/093409號公報中公開的MoCVl的防治效力時，防治效力為56.8。由該結果可知:與以往公知的真菌病毒相比，水稻稻瘟病菌株S-0412-1I2a株中內含的MoCV3對水稻稻瘟病菌的防治效果、或者由治愈效果產生的水稻稻瘟病菌的防治效果極其優異。
[0109]〔實施例10〕在本實施例中，研究酵母細胞內的MoCV3病毒顆粒的重建。即，為了在面包酵母(釀酒酵母cerevisiae))的細胞內重建MoCV3病毒,制作以MoCV3所具有的五個dsRNA基因組為模板的完全長cDNA克隆，分別與具有五種標記基因的穿梭載體(以下參照)連接，使MoCV3基因產物在面包酵母細胞內表達，進行MoCV3病毒顆粒的重建。
[0110]<酵母基因表達用穿梭載體的構建>
作為基本載體的 pRS313、pRS314、pRS315、pRS316 從 National BioResource (http://yeast, lab.nig.ac.jp/nig/index, html)購入，pRS317、pRS412、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426 從 ATCC (http://www.atcc.0rg/)購入。[0111]使用BamHI從pAUR123 (TaKaRa Bio公司制)中切出ADHl (醇脫氫酶I)組件(cassette) (ADH1啟動子+MCS+ADH1終止子)，將其亞克隆到pUC19中。為了構建TDH3(甘油醒_3_磷酸脫氫酶)組件,通過以面包酵母株W303-1A (Mat a ura3 leu2 his3 trplade2 can I)的基因組DNA為模板的PCR，亞克隆在TDH3上游600bp的3’側添加有MCS (多克隆位點)的二分之一的擴增產物、和在TDH3下游350bp的5’側添加有MCS的剩下的二分之一的擴增產物。連接所得的兩個結構物，使形成TDH3上游600bp+MCS+TDH3下游350bp，作為TDH3組件。
[0112]除去上述基本載體的MCS，在該位點重新插入ADHl組件或TDH3組件。將插入了ADHl 的 pRS313、pRS314、pRS315、pRS316 和 pRS317 分別作為 pRSA313、pRSA314、pRSA315、PRSA316 和 pRSA317。將插入了 TDH3 的 pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS317、pRS423、pRS424、pRS425 和 pRS426 分別作為 pRST313、pRST314、pRST315、pRST316、pRST317、PRST423、pRST424、pRST425 和 pRST426。
[0113]<表達來自 MoCV3 的基因(dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和 dsRNA5)的穿梭載體結構物的制作>
以 MoCV3 全長 cDNA 克隆 dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和 dsRNA5 為模板，通過 PCR擴增全長序列。將所得的DNA片段亞克隆到pUC19中，之后進行序列分析，篩選正確的克隆(圖6)。使用限制酶從所得的克隆中切出目標區域，進行純化，之后插入到上述的穿梭載體中。最后，根據序列測定確認插入序列及其周邊序列是否有變化。
[0114]< MoCV3 全長 cDNA 的制作>
<dsRNAl >
以通過天然的PAGE分離成各區段(成分r i )的dsRNAl或純化MoCV3 dsRNA為模板進行RT-PCR，得到全長的DNA片段。在溶解于蒸餾水中的模板雙鏈RNA (約50ng-100ng)中加入各 20pmol 的 dsRNAl 特異性引物(MoCV3-cDNA-dsRNAl-5end_SmaI和MoCV3-cDNA-dsRNAl-3end-XbaI)，在98°C下溫育5分鐘，之后在冰上驟冷3分鐘。之后，在40ii I的反應系統中，在IX第一鏈合成緩沖液(IXfirst strand synthesisbuffer) (invitrogen 公司制)、lmM 的 CH3Hg0H、10mM 的 DDT、ImM 的 dNTPmix、40U 的RNase OUT Recombinant (invitrogen 公司制)、200U 的 Super Script III 逆轉錄酶的條件下，在42°C下溫育30分鐘，之后在70°C下溫育15分鐘，然后添加5U的RNase H。在37 °C下溫育10分鐘、之后在70 °C下溫育15分鐘后，使用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit) (QIAGEN 公司制)純化、濃縮 cDNA。以該 cDNA 溶液為模板，在PCR中使用2U的Pfu-x (Greiner公司制)和其所附帶的緩沖液、磷酸化引物(MoCV3-cDNA-dsRNAl-5end-SmaI:GCC CCG GGG CAA AM AGA GM TAA AGC TTT CTC C (SEQID NO: 11)和 MoCV3-cDNA-dsRNAl-3end-XbaI:GTT CTA GAG GTA CTT ACA CCT CAC AGCGTA AGA A (SEQ ID NO: 12))。反應條件如下:在95°C下反應2分鐘后，以95°C下30秒、55°C下30秒和68°C下3分30秒作為I個循環，進行30個循環，之后在68°C下反應7分鐘。瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠中提取、純化目標cDNA擴增片段，使用DNA連接試劑盒第
2.1 版(DNA Ligation kit Ver.2.1) (TaKaRa Bio 公司制)，將其插入到質粒載體 pUC19DNA SmaI (MBI Fermentas公司制)中。根據序列測定獲得通過青白篩選得到的克隆的插入片段的全長序列，選擇與MoCV3 dsRNA I的序列完全一致的克隆。
[0115]< dsRNA2 >
使用 dsRNA2 特異性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA2-5end-SacI: GCG AGC TCG CAA AAA AGAGAA TAA AGC ATT CCC T (SEQ ID NO: 13)和MoCV3-cDNA-dsRNA2-3end_Hpal:GTG TTA ACGGTA CTT ACG TTG TCA CGT AAG AAG T (SEQ ID NO: 14))，按照與 dsRNAl 的全長 cDNA 的制作相同的方法，得到與MoCV13dsRNA 4的序列完全一致的克隆。
[0116]< dsRNA3 >
使用 dsRNA3 特異性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA3-5end-Sall:GCG TCG ACG CAA AAA AGAGAA TM AGC TTT CTC C (SEQ ID NO: 15)和MoCV3-cDNA-dsRNA3-3end_Xbal:GTT CTA GAGGTA CTT GTT GGG ACC CTA CGT CCG A (SEQ ID NO: 16))，按照與 dsRNAl 的全長 cDNA 的制作相同的方法，得到與MoCV13dsRNA 4的序列完全一致的克隆。
[0117]< dsRNA4 >
使用 dsRNA4 特異性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA4-5end-Sall:GCG TCG ACG CAA AAA AGAGAA TM AGC TTT CTC C (SEQ ID NO: 17)和MoCV3-cDNA-dsRNA4-3end_Xbal:GTT CTA GAGGTA CTT GTT GAA GCC CCA TGC TCA A (SEQ ID NO: 18))，按照與 dsRNAl 的全長 cDNA 的制作相同的方法，得到與MoCV13dsRNA 4的序列完全一致的克隆。
[0118]< dsRNA5 >
使用 dsRNA5 特異性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA5-5end-Smal:GCC CCG GGG CAA AAA AGAGAA TM AGC ATT CTC C (SEQ ID NO: 19)和MoCV3-cDNA-dsRNA5-3end_Xbal:GTT CTA GAGGTA CTT ACG TCA TCA CGT AAG AAG T (SEQ ID NO: 20))，按照與 dsRNAl 的全長 cDNA 的制作相同的方法，得到與MoCV13dsRNA 5的序列完全一致的克隆。
[0119]<用質粒DNA轉化酵母>
<乙酸鋰法>
通過乙酸鋰法進行的轉化如下進行。首先，將酵母種菌在5ml的液體培養基中，在30°C下進行10~16小時的預培養。培養后，將其種菌在50ml的液體培養基中，使測定吸光度(OD600)時達到OD600=0.1~0.2。在30°C、IOOrpm下培養,直至OD600=0.8,通過離心分離回收細胞，之后用蒸餾水懸浮、清洗。將已沉淀的細胞懸浮于Sol A (0.1M的乙酸鋰、IOmM的Tris-HCl pH7.8、lmM的EDTA)中，進行離心分離，向沉淀物中再次加入Sol A進行懸浮，作為酵母溶液。將其在30°C下溫育50分鐘后，依次加入IOiU進行了熱處理的ssDNA (lmg/ml、來自鮭睪丸)、50iil酵母溶液、IOiil穿梭載體、20iil Sol A,750u I 50%的聚乙烯甘油，之后在30°C下溫育30分鐘，然后在42°C下溫育15分鐘。離心分離后，向沉淀物中加入蒸餾水，之后涂布在SC瓊脂平板培養基(根據穿梭載體的選擇標記選擇撤除成分培養基)上，在30°C下培養。
[0120]<原生質球法>
通過原生質球法進行的轉化如下進行。首先，與上述的乙酸鋰法一樣，培養、回收酵母細胞，將細胞懸浮在1.2M的山梨醇溶液中，通過離心分離(2500rpm、5分鐘)回收細胞。將已沉淀的細胞再次懸浮于1.2M的山梨醇溶液中，添加Zymorase (20TU/10容積量)。在30°C下溫育，直至大多數的細胞發生原生質球化。用1.2M的山梨醇溶液清洗細胞3次，之后將其懸浮于STC溶液中。向100 ill該原生質球懸浮液中加入23 u I質粒溶液和I 進行了熱處理的ssDNA (I mg/ml、來自鮭睪丸)、4ml PEG溶液，充分混和。靜置10分鐘后，通過離心分離(1200rpm、5分鐘)使原生質球沉淀，將其懸浮于150 U I的SOS溶液中。在30°C下培養I小時后，與5ml的SD山梨醇-低融點瓊脂糖溶液混和，涂布在SD山梨醇板上。
[0121]<電穿孔法>
通過電穿孔法進行的轉化如下進行。首先，與乙酸鋰法一樣，培養、回收酵母細胞，通過離心分離回收細胞，之后用蒸餾水進行懸浮、清洗。懸浮于12.5ml的LiAC/DTT/TE溶液中，在室溫下靜置I小時，之后通過離心分離(6，000rpm、5分鐘)使細胞沉淀。將該沉淀用12.5ml的冰冷水懸浮，清洗2次。將細胞懸浮于5ml IM的山梨醇溶液中，通過離心分離(6, 000 rpm、5分鐘)使細胞沉淀。將該沉淀懸浮于50 IM的山梨醇溶液中，作為細胞懸浮液。向70 ill細胞懸浮液中加入5 u I質粒溶液，在冰上靜置5分鐘。將其加入到0.2cm的透明試管中，在1.5kV、25ii FD、200 ohms下進行電穿孔。立即添加Iml IM的山梨醇溶液，涂布在IM的山梨醇板培養基上。
[0122]<通過導入 MoCV3 dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和 dsRNA5 在酵母內重建 MoCV3 > 為了制作 pRSAA313-dsRN`Al、pRSA314_dsRNA2、pRSA315_dsRNA3、pRSA316_dsRNA4 和
pRSA317-dsRNA5以表達MoCV3 dsRNAl~5，將按照上述方法制作的從dsRNAl到dsRNA5的完全長cDNA克隆分別與pRSA313、pRSA314、pRSA315、pRSA316、pRSA317的限制酶切位點連接，構建穿梭載體(圖7和8)。將dsRNAl的完全長cDNA與pRSA313連接時，使用限制酶切位點SmaI和XbaI (圖7a)，將dsRNA2的完全長cDNA與pRSA314連接時，使用限制酶切位點SacI和HpaI位點(圖7b)，將dsRNA3的完全長cDNA與pRSA315連接時，使用限制酶切位點SalI和XbaI (圖7c)，將dsRNA4的完全長cDNA與pRSA316連接時，使用限制酶切位點SalI和XbaI (圖8a)，將dsRNA5的完全長cDNA與pRSA317連接時，使用限制酶切位點SmaI和XbaI (圖8b)。利用乙酸鋰法，將通過連接得到的表達各dsRNAl~dsRNA5基因的穿梭載體導入到面包酵母YPH499株(Mat a ura3 lys2 ade2 leu2 his3 trpl)中。
[0123]將所得的轉化集落在微生物培養裝置中培養，嘗試著進行病毒樣顆粒的純化。使用弗氏壓碎器將酵母細胞破碎，之后利用與MoCV3病毒顆粒純化法相同的方法進行純化，通過蔗糖濃度梯度離心進行分餾。對于得到的組分，使用抗MoCV3抗血清進行蛋白質印跡分析(圖9a)。其結果，在導入了 MoCV3 dsRNAl_5的酵母樣品的24%蔗糖濃度附近檢測到認為是來自MoCV3蛋白的信號。進行電子顯微鏡觀察時，觀察到MoCV3病毒樣顆粒(圖9b)。
[0124]本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請，直接作為參考而納入本說明書中。
【權利要求】
1.真菌病毒，其特征在于:具有五種雙鏈RNA，該五種雙鏈RNA中，有四種雙鏈RNA分別相對于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性。
2.權利要求1所述的真菌病毒，其特征在于:該五種雙鏈RNA分別是包含SEQID NO:1~SEQ ID NO: 5所不的核苷酸序列的多核苷酸。
3.植物病害真菌，其中，權利要求1或2所示的真菌病毒感染宿主。
4.權利要求3所述的植物病害真菌，其特征在于:上述宿主是水稻稻瘟病菌。
5.植物病害防治劑，其中包含權利要求1或2所述的真菌病毒或權利要求3或4所述的植物病害真菌。
6.植物病害真菌防治方法，該方法包括:使權利要求5所述的植物病害防治劑與植物接觸的步驟。
7.植物病害真菌減毒方法，該方法包括:使權利要求1或2所述的真菌病毒感染植物病害真菌的步驟。
8.權利要求7所述的植物病害真菌減毒方法，其特征在于:上述植物病害真菌是水稻稻瘟病菌。`
【文檔編號】C12N7/00GK103492556SQ201280010278
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年2月24日 優先權日:2011年2月24日
【發明者】森山裕充, 福原敏行, 有江力, 寺岡徹 申請人:國立大學法人東京農工大學