一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量rt-pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型提供一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應液管、酶混合液管、引物探針混合液管、陰性對照品管、三個標準品管、三個陽性對照品管和盒體組成。標準品為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒標準品。對照品為陽性和陰性對照品。本實用新型試劑盒根據GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區序列設計特異性的引物和探針，設計合理，采用一步法三重實時熒光定量RT-PCR技術，從標本中準確檢測出三種人杯狀病毒，操作簡便、快速和準確。
【專利說明】—種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型屬生物【技術領域】，涉及一種檢測熒光定量RT-PCR試劑盒，具體涉及一種一步法檢測人杯狀病毒的三重實時熒光定量RT-PCR試劑盒。
【背景技術】
[0002]人杯狀病毒(Human calicivirus, HuCVs)是引起兒童和成人非菌性急性腹灣的主要病原之一，僅次于輪狀病毒。它傳染性強，在世界各地廣泛傳播，尤其是對嬰幼兒健康影響較大。最早發現的人杯狀病毒是由美國學者Kapikin于1972年采用免疫電鏡方法從俄亥俄州諾瓦克地區一所學校暴發的胃腸炎病人糞便標本中檢出，并以發現地將其命名為諾瓦克病毒。此后，人杯狀病毒在世界各地不斷被發現，根據病毒形態結構、抗原特性、宿主范圍和所致疾病的臨床癥狀，以及病毒基因組序列和和遺傳進化分析的結果進行病毒分類，2002年8月第八次ICTV確定人杯狀病毒包括兩個屬:諾如病毒屬(Norovirus，NV)和札如病毒屬(sapovirus, SV)。
[0003]諾如病毒毒株間具有很大核苷酸序列多樣性，依據基因結構ORFl和0RF2之間的差異，諾如病毒分為5個基因組(G1-GV)，其中GI (以nonvalk-like virus為代表)和GII (以Snow Mountain virus為代表)是感染人類的兩個最常見的基因組。
[0004]札如病毒即札幌病毒，為單股正鏈RNA病毒，其原型毒株最早為1977年日本學者Chiba等從札幌某托兒所一系列的腹瀉爆發研究中所證實。此類病毒所致疾病主要與人和動物的胃腸炎有關，不同年齡段人群都可感染，引起腹瀉，主要以嬰幼兒最為易感。札如病毒主要經糞-口途徑傳播，在有些地區，札如病毒逐漸成為僅次于諾如病毒引起病毒性腹瀉的主要病因。
[0005]由于人杯狀病毒不能進行細胞和組織培養，其檢測方法的發展受到了很大限制。傳統的杯狀病毒檢測方法主要有電鏡、放射免疫試驗、酶免疫試驗等，但這些方法均不夠敏感。隨著基因組測序技術的進展，據此建立的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測人杯狀病毒，使得檢測靈敏度大大提高。目前的方法學檢測中，RT-PCR方法已成為檢測人杯狀病毒最敏感、也是應用最廣泛的方法。
[0006]實時熒光定量PCR技術具有全封閉單管擴增、簡便快捷、重復性好、實時定量、污染少等優勢，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性和敏感性，為臨床診斷提供了準確可靠的實驗室依據，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測手段。但是單管實時熒光定量RT-PCR檢測一種病原，不僅耗時耗力，也浪費試劑耗材，因而建立可同時檢測多種病原的多重實時熒光定量RT-PCR診斷方法與診斷試劑尤其重要。
【發明內容】
[0007]本實用新型的目的是提供一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應液管、酶混合液管、引物探針混合液管、陰性對照品管、三個標準品管、三個陽性對照品管和盒體組成。其中定量RT-PCR反應液管包含有PCR反應緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管包含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉錄酶，引物探針混合液管包含三種病毒的特異性引物和相應的三種不同熒光標記的探針。三個標準品管分別放置GI型諾如病毒標準品、GII型諾如病毒標準品、札如病毒標準品；三個陽性對照品管分別放置GI型諾如病毒陽性對照品、GII型諾如病毒陽性對照品、札如病毒陽性對照品；陰性對照管包含高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，三個陽性對照品管分別為包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區基因序列的陽性質粒樣品。引物探針混合液管需為棕色管。
[0008]陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性質粒樣品。
[0009]三重熒光定量RT-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應的特異性探針序列如下:
[0010]上游引物NVG1-F: 5，-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
[0011]下游引物NVG1-R:5’ -TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’
[0012]特異性探針NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
[0013]上游引物NVGI1-F: 5’ -GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’
[0014]下游引物NVGI1-R:5’ -CGACGCCATCTTCATTCACA-3’
[0015]特異性探針NVGI1-P: 5’ -HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’
[0016]上游弓I 物 SV-F: 5，-CAGGCTCTCGCCACCTACA-3，
[0017]下游引物SV-R:5-TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3’
[0018]特異性探針SV-P: 5，-R0X-CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3 ’
[0019]上述標準品包括GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒標準品，其保守區基因序列如下:
[0020]GI型諾如病毒病毒標準品序列為:
[0021]ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA
[0022]CAGGAGATCG CAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA
[0023]GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAA
[0024]GII型諾如病毒病毒標準品序列為:
[0025]ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG
[0026]AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA
[0027]TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA
[0028]札如病毒標準品序列為:
[0029]AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG
[0030]TGGTACAGTA CCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG
[0031]TGTTTGAGAT GGAGGGCAAT GGCTCCAACT CAGA。
[0032]本實用新型提供的熒光定量試劑盒需保存于-20°C，盡量減少反復凍融；引物探針混合液需避光條件下保存。弓I物探針混合液管為棕色管。
[0033]本實用新型試劑盒的使用方法:在每次標本檢測中均應設立陽性對照和陰性對照。標準品用高溫高壓滅菌的DEPC水稀釋為I X IO3-1 X 108copies/ml。
[0034]糞便或肛拭子樣本核酸的提取:取0.2g或200 μ I糞便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置lOmin，以8000r/min離心5min。吸取200μ I上清加入到EP管中，進行核酸提取；肛拭子標本要在標本運輸(保存)液中充分攪動(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，可以直接吸取200ul上清加到EP管中，進行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acidextraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNA Stool Mini Kit,按照試劑盒說明書進行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。
[0035]核酸的檢測:取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。反應總體積為25μ 1，其中定量RT-PCR反應液12.5 μ 1，酶混合液I μ 1，引物探針混合液(20 μ mol/L，包含三種病毒的特異性引物和相應的三種熒光探針)共4.5 μ 1，模板5 μ 1，加水補足至25 μ I。在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀(或者其他三色熒光以上的PCR儀)上進行檢測，反應參數為:反轉錄50°C , 30min ；95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進行三重熒光檢測，共進行40個循環。
[0036]突光定量結果報告:①GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒檢測的各自CT值對應相應的熒光標記的病毒，檢測樣本CT值為40、0和無數值時，報告為陰性。②檢測樣本Ct值< 35時:報告為相應病毒陽性。③檢測樣本Ct值> 35且小于40的樣本,建議復檢，復檢結果Ct值< 37者，依據②的判斷標準報告為相應病毒陽性。根據所獲得的標準曲線，計算待測標本各種病毒的量(copies/ml)。
[0037]本實用新型的有益之處是:運用一步法實時熒光定量RT-PCR技術，采用GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒高度特異的引物和熒光標記探針，開發研制用于GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒三重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。該實用新型是通過一個PCR反應，可以從糞便或肛拭子標本中同時檢測出是否有GI型諾如病毒、GII型諾如病毒或札如病毒存在，比傳統的普通PCR和單重熒光定量PCR方法更便捷迅速。同時，對檢測的病毒進行實時準確定量，對臨床上病毒性腹瀉的患者，提供早期明確診斷，區分病毒感染的種類及滴度，為臨床治療方案的制定提供參考依據；同時還可應用于病毒性腹瀉中杯狀病毒分子流行病學的研究。本實用新型采用的單管一步法三重實時熒光定量RT-PCR，能夠一管內一次反應同時檢測出GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒，相比傳統的單管單病原實時熒光定量RT-PCR方法，不僅大大的節省了試劑耗材、檢測時間，而且同樣具備較高的特異性和靈敏度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1為本試劑盒結構示意圖。
[0039]圖2為本試劑盒同時檢測三種病毒陽性的實例，其中I為GI型諾如病毒、2為GII型諾如病毒、3為札如病毒。
[0040]圖3為本試劑盒檢測GI型諾如病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、IO7, IO6,ΙΟ5、104、103copies/ml。
[0041]圖4為本試劑盒GI型諾如病毒標準品實時熒光定量RT-PCR標準曲線。
[0042]圖5為本試劑盒檢測GII型諾如病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、ΙΟ6、ΙΟ5、104、103copies/ml。
[0043]圖6為本試劑盒GII型諾如病毒標準品實時熒光定量RT-PCR標準曲線。[0044]圖7為本試劑盒檢測札如病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、106、105、104、103copies/ml。
[0045]圖8為本試劑盒札如病毒標準品實時熒光定量RT-PCR標準曲線。
【具體實施方式】
[0046]本實用新型結合下面具體實施例和附圖作進一步說明，但這些實施例僅限于說明本實用新型而不限制本實用新型的范圍。
[0047]實施例1
[0048]參見圖1，一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應液管1、酶混合液管2、引物探針混合液管3、陰性對照品管4、三個標準品管5、三個陽性對照品管6和盒體7組成。
[0049]其中定量RT-PCR反應液管I包含有PCR反應緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物；酶混合物管2包含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉錄酶；引物探針混合液管3包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒三種病毒的特異性引物和相應的三種熒光標記的探針；三個標準品管5分別放置GI型諾如病毒標準品、GII型諾如病毒標準品、札如病毒標準品；三個陽性對照品管6分別放置GI型諾如病毒陽性對照品、GII型諾如病毒陽性對照品、札如病毒陽性對照品。
[0050]陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性質粒樣品。
[0051]本試劑盒需保存于-20°C，盡量減少反復凍融；引物探針混合液需避光條件下保存。引物探針混合液管為棕色管。
[0052]三重熒光定量PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應的特異性探針序列如下:
[0053]上游引物NVG1-F: 5，-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
[0054]下游引物NVG1-R:5’ -TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’
[0055]特異性探針NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
[0056]上游引物NVGI1-F: 5’ -GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’
[0057]下游引物NVGI1-R:5’ -CGACGCCATCTTCATTCACA-3’
[0058]特異性探針NVGI1-P: 5，-HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3，
[0059]上游引物SV-F: 5，-CAGGCTCTCGCCACCTACA-3 ’
[0060]下游引物SV-R: 5-TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3，
[0061 ]特異性探針 SV-P: 5，-R0X-CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3 ’
[0062]所述的三種標準品基因序列如下:
[0063]GI型諾如病毒病毒標準品序列為:
[0064]ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA
[0065]CAGGAGATCG CAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA
[0066]GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAA
[0067]GII型諾如病毒病毒標準品序列為:
[0068]ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG
[0069]AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA[0070]TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA
[0071]札如病毒標準品序列為:
[0072]AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG
[0073]TGGTACAGTA CCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG
[0074]TGTTTGAGAT GGAGGGCAAT GGCTCCAACT CAGA。
[0075]實施例2
[0076]I材料與方法
[0077]1.1臨床標本與病毒核酸:
[0078]GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的臨床樣本來源于浙江大學醫學院附屬第一醫院、浙江大學醫學院附屬兒童醫院以及浙江省內其他幾家醫院腹瀉患者的糞便或肛拭子標本，樣本采集后運送到實驗室。陽性核酸均通過基因測序確認。
[0079]1.2引物與探針
[0080]從美國的NCBI基因庫上下載了涵蓋國內外GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的多條基因序列。利用DNAman軟件對其進行了同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區。使用Primer Express3.0軟件在其保守區設計高度特異性的引物與Taqman探針，弓丨物和探針序列均通過Blast驗證，具有較好特異性。引物和探針序列如下，:
[0081 ]上游引物 NVG1-F: 5，-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
[0082]下游引物NVG1-R:5’ -TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3，
[0083]特異性探針NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
[0084]上游引物NVGI1-F: 5’ -GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’
[0085]下游引物NVGI1-R:5，-CGACGCCATCTTCATTCACA-3’
[0086]特異性探針NVGI1-P: 5，-HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3，
[0087]上游引物SV-F: 5，-CAGGCTCTCGCCACCTACA-3 ’
[0088]下游引物SV-R: 5-TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3，
[0089]特異性探針SV-P: 5，-R0X-CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3 ’
[0090]以上引物和探針委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0091]1.3病毒核酸的提取與標準品定量標準:
[0092]取0.2g或200 μ I糞便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置lOmin，以8000r/min離心5min。吸取200 μ I上清加入到EP管中，米用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAampDNA Stool Mini KU，按照試劑盒說明書進行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。合成各病毒基因標準品片段，將其連接到質粒載體PMDTM19-T Simple VectorCTaKaRa公司)上。轉化后培養。鑒定后提取質粒DNA,利用NanoDrop ND-2000Spectrophotometer測量質粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數作為標準品定量母液。根據實驗需要，將標準品定量母液稀釋至所需最高濃度，并做十倍稀釋至最低濃度，低溫保存備用。
[0093]1.4三重實時熒光定量RT-PCR反應體系和條件的優化:
[0094]反應總體積為25 μ 1，其中定量RT-PCR反應液12.5 μ 1，酶混合液I μ 1，引物探針混合液(20 μ mol/Ι，包含四種病毒的特異性引物和相應的三種種熒光探針)共4.5μ1，模板5μ 1，DEPC水補足至25μ I。在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀上進行檢測，反應參數為:反轉錄50°C , 30min ；95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進行三重熒光檢測，共進行40個循環。結果判斷:選擇熒光檢測模式FAM、HEX、ROX熒光基線調整取3_15個循環的熒光信號平均值，閾值設定以閾值線剛好超過陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優化試驗，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應體系中，引物濃度從I?20 μ Μ，探針濃度從I?20 μ Μ，采用矩陣法優選引物和探針的最佳濃度，根據最低Ct值和最高熒光強度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。
[0095]1.5三重實時熒光定量RT-PCR特異性、敏感性和重復性試驗
[0096]選擇GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)和近期來源于浙江省多家醫院的臨床樣本提取核酸，用GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒三重實時熒光定量RT-PCR方法驗證方法的特異性；利用傳染病診治國家重點實驗室分離保存的輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、CoxB病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等毒株，提取核酸后用本試劑盒檢測，驗證其是否存在交叉反應。對已標定拷貝數(copies/ml)的GI型諾如病毒(108copies/ml)、GII型諾如病毒(108copies/ml)和札如病毒(108COpieS/ml)分別稀釋后，平行進行熒光PCR反應，比較其靈敏度，并據此建立檢測的標準曲線。此外，對每一個指定濃度的陽性核酸稀釋液作6次重復檢測，得到的Ct值計算其標準差和變異系數，驗證該方法的重復性。
[0097]2 結果
[0098]2.1三重實時熒光定量RT-PCR反應體系及條件
[0099]該方法的反應總體積為25 μ 1，其中其中定量RT-PCR反應液12.5 μ 1，酶混合液I μ 1，引物探針混合液(20 μ mol/l，包含四種病毒的特異性引物和相應的四種種熒光探針)共4.5μl，模板5μl，DEPC水補足至25μl。在ABI7500熒光定量PCR儀上進行檢測，反應參數為:反轉錄50°C , 30min ；95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進行三重熒光檢測，共進行40個循環。可獲得最低Ct值和最高熒光強度。
[0100]2.2特異性試驗
[0101]本實用新型建立的一步法三重熒光定量RT-PCR方法對GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒具有較好的特異性，近期采集的臨床標本也檢測出陽性反應。GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒引物探針與其他病毒如輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒、EV71、CoxA16XoxB病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均無交叉反應。該方法同時檢測三種病毒陽性的結果參見圖2，其中I為GI型諾如病毒，2為GII型諾如病毒，3為札如病毒。
[0102]2.3敏感性試驗。
[0103]對GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒敏感性檢測試驗，將已標定拷貝數(copies/ml)的GI型諾如病毒(108copies/ml)、GII型諾如病毒(108copies/ml)和札如病毒(108COpieS/ml)分別十倍梯度稀釋后，用本試劑盒進行檢測，結果該方法檢測敏感性分別達到103、103、103和103copies/ml。結果參見圖3、圖5、圖7。取實時熒光定量RT-PCR產物5 μ 1，120V電壓電泳20min，凝膠成像系統拍照。根據其檢測靈敏度，建立各病毒檢測的標準曲線。其中圖4為檢測GI型諾如病毒的標準曲線(斜率=-3.745，R2=0.998)，圖6為檢測GII型諾如病毒的標準曲線(斜率=-4.306，R2=0.999)、圖8為檢測札如病毒的標準曲線(斜率=-3.717，R2=0.998)。[0104]2.4重復性試驗
[0105]分別取GI型諾如病毒(終濃度為106copies/ml)、GII型諾如病毒(106copies/ml )、札如病毒(106copies/ml),按10倍梯度稀釋成3個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作6個重復檢測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在0.155~0.363之間，變異系數均低于1.275%，具有較好的重復性(結果參見表1)。
[0106]表1三重實時熒光定量RT-PCR檢測病毒核酸的重復性試驗
【權利要求】
1.一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒由定量RT-PCR反應液管(I)、酶混合液管(2)、引物探針混合液管(3)、陰性對照品管(4)、三個標準品管(5)、三個陽性對照品管(6)和盒體(7)組成，三個標準品管(5)分別放置GI型諾如病毒標準品、GII型諾如病毒標準品、札如病毒標準品；三個陽性對照品管(6)分別放置GI型諾如病毒陽性對照品、GII型諾如病毒陽性對照品、札如病毒陽性對照品；陰性對照管(4)包含高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，三個陽性對照品管(6)分別為包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區基因序列的陽性質粒樣品。
2.根據權利要求1所述的一種檢測人杯狀病毒的三重熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，引物探針混合液管(3)為棕色管。
【文檔編號】C12Q1/70GK203382766SQ201220675431
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年12月10日 優先權日:2012年12月10日
【發明者】陳瑜, 李蘭娟, 謝國良, 崔大偉 申請人:浙江大學