重組人IFN-β-1a及其生產和純化方法

重組人IFN-β-1a及其生產和純化方法
【專利摘要】本發明提供了編碼重組人IFN-β-1a的核酸序列，包含該核酸序列的表達質粒和轉染有該質粒的穩定細胞系以及利用該細胞系大規模生產重組人IFN-β-1a的發酵方法。使用所述發酵方法生產重組人IFN-β-1a的產量可達60.52mg/L，比活為282,000MIU/mg。此外，本發明還提供了從穩定細胞系獲得高純度的人重組IFN-β-1a的的純化方法，純化后的重組人重組IFN-β-1a蛋白的純度在98%以上，且具有同市售商品化人重組IFN-β-1a相當的體外活性。相對于以往的純化方法，本發明的純化方法保持了蛋白樣品的活性，簡化了后續的純化步驟，并可以獲得更高的產率，更適于工業的大規模生產。
【專利說明】重組人IFN-PHa及其生產和純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制品【技術領域】，涉及一種重組人IFN-β-1a穩定細胞系的構建、重組人IFN-β -1a的大規模生產及其純化。
【背景技術】
[0002]1957年,英國病毒生物學家Alick Isaacs和瑞士研究人員Jean Lindenmann在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現象時了解到，病毒感染的細胞能產生一種因子，后者作用于其他細胞，干擾病毒的復制，故將其命名為干擾素(IFN)。1966-1971年，Friedman發現了干擾素的抗病毒機制，引起了人們對干擾素抗病毒作用的關注。而后，干擾素的免疫調控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗腫瘤作用逐漸被人們認識(A.Yabrov.Medical Hypotheses,Vo15，Issue7:769-797，1n Bresser.Biochimie, Vo189，Issue6_7:723-728)。[0003]目前在人類身上共發現α、β、Y三種類型的干擾素:α型干擾素(IFN-α)是由白細胞產生的(Wolf Peter Hofmann et.Al, Journal of Clinical Virology,Vol32, Issue2:86-91) ；β型干擾素(IFN-β )是由成纖維細胞(纖維母細胞)產生的；Y型干擾素是(IFN-Y)由免疫系統中的T細胞和自然殺傷細胞產生的(Alfons Billiauet.al, Cytokin&Growth Factor Reviews, Vol20, Issue2, 97-113)。人干擾素 β ( β 型人干擾素)是一種天然的可溶糖蛋白。有廣泛的生物學活性，如抗病毒、抗增殖及免疫調節作用(Robert J.Fox, TREND in Immunology, Vol25, N0.12:632-636)。
[0004]多發性硬化癥(Multiple Sclerosis)是中樞神經系統和免疫有關的發炎及去髓鞘(demyelinatin)疾病。可引起各種癥狀，包括感覺改變、視覺障礙、肌肉無力、憂郁、協調與講話困難、嚴重的疲勞、認知障礙、平衡障礙、體熱和疼痛等，嚴重的可以導致活動性障礙和殘疾。歐美地區為該疾病的高發區，是年輕人除了外傷之外導致神經障礙最常見的疾病(G.Rosati，Neurol Sci (2001) 22:117-139)。近年來，隨著診斷水平的提高以及對該病認識程度的增加，亞洲國家如日本、中國等，多發性硬化癥的發病率呈現上升趨勢(吉良潤一，中華神經科雜志，2009年6月，第42卷，第6期，422-424)。由于我國人口基數巨大，因此國內市場對于有效藥物的需求龐大。
[0005]目前，多發性硬化癥在臨床上難以治愈，但是免疫調節療法在緩解疾病癥狀以及預防疾病的反復發作方面效果顯著。常用的免疫調節藥物包括重組人干擾素β(IFN- β )，合成小妝 Glatiramer 乙酸鹽及單抗藥物 Natalizumab (Oliver Neuhauset.al, Journal of Neurological Sciences259 (2007):27-37)。根據多年的臨床試驗結果表明，重組人IFN-β不僅可以降低復發緩解型多發性硬化癥患者的急性發作次數，而且還能有效延遲復發緩解型和繼發緩解型多發性硬化癥患者的病程進展(Ayman Tourbahet.al，Biochimie, Vol89:899-902)。人IFN-β用于多發性硬化癥的治療，主要是通過以下作用方式:一為抗病毒作用；二為抑制生長、誘導凋亡的作用；三為免疫調節的作用。目前，重組人IFN-β為治療多發性硬化癥的一線用藥。主要的商品包括Merck Serono公司生產的Rebif ;以及Biogen Idec公司生產的Avonex ;僅此兩個藥品在2010年的銷售額就達到47億美元，市場前景非常巨大。
[0006]IFN-β -1a
[0007]IFN-β由166個氨基酸組成，相對分子質量為20Κ Da，是一種糖蛋白，由兩個單海藻糖的寡糖鏈組成(Conradt et.al, Journal of Biological Chemistry,Vol262，14600-14605)。糖基化對其可溶性有重要作用，用糖肽酶F處理后，IFN-β發生沉淀。在大腸桿菌中表達的IFN-β也由于缺少糖基化而在折疊中產生錯誤。經人工改造過的可以在大腸桿菌中表達的突變型IFN-β，被稱為IFN-13-lb，而天然形式的IFN-β稱為IFN-β-la。IFN-β-1b的N端減少一位氨基酸，并且17位氨基酸由半胱氨酸突變為絲氨酸，這種人工改造的突變體雖然可以在大腸桿菌中表達，但是卻缺乏糖基化修飾，活性僅為天然形式IFN-β-1a的十分之一(Rudick RA et.al, Experimental CellResearch, 317 (2011): 1301-1311)。天然形式IFN-β-1a通常使用真核細胞進行表達，如人胚腎細胞ΒΗΚ21，小鼠結締組織纖維細胞LTK，中國倉鼠卵巢細胞CHO等(Reiser Wet.at, Drug Research, 37 (I):482-485 ；Chernajovsky et.al, DNA, Vol3, 297-308 ；InnisMA et.al, Methods Enzymol, 1986:397-403)。
[0008]美國專利US4966843公開了一種人IFN-β -1a表達載體，以及利用這種載體在CHO細胞中表達人IFN-β -la，但該方法得到的表達量僅為2.2mg/L。另外，W02007/022799專利也公開了一種生產人IFN-P-1a的方法，該方法得到的穩定細胞系在反應器中僅能得到20mg/L的產量；其在生物反應器中采用了微載體的培養方法，該方法對微載體及血清的消耗非常巨大，增加了生產成本；同時，該方法在生產中采用了三步降溫的方式，在實際生產過程中操作繁瑣；另外，在生長期向生產期轉換過程中需要對生長期血清進行沖洗，不可避免的造成終產物的 血清殘留；再次，微載體的生產方法對于工業化生產的規模放大比較困難。
[0009]IFN-β-1a 的純化
[0010]已有一些文章和專利報道了 IFN-β-1a的純化方法，如親和色譜(U.S.Pat.N0.4，278，661，U.S.Pat.N0.4，289，689 和 U.S.Pat.N0.4，521，952)，可控多孔玻璃色譜(U.S.Pat.N0.4，359，389，U.S.Pat.N0.5，066，786 和 U.S.Pat.N0.5，244，665)，金屬螯合色譜(U.S.Pat.N0.5，244，665，U.S.Pat.N0.4，257，938，U.S.Pat.N0.4，359，389 和 U.S.Pat.N0.4，541,952)常被用于IFN-β-1a的樣品捕獲；而陽離子色譜(CIEX)和反相色譜(RP-HPLC)常被用于IFN-β -1a的中度純化；分子排阻色譜(SEC)常被用于IFN-β -1a的精細純化(U.S.Pat.N0.0, 305，669 和 U.S.Pat.N0.0, 93，649)。
[0011]在親和層析色譜中，Blue Sepharose FF由于其良好的分辨率和較高的動態載量被更多地用于IFN-P-1a的樣品捕獲。在使用Blue Sepharose FF對IFN-進行純化時，往往需要使用有機溶劑如乙二醇、丙二醇或者利用降低緩沖液的PH值對樣品進行洗脫；并在應用下一步柱層析前需要對洗脫樣品進行透析換液以去掉有機溶劑或者提高洗脫溶液的PH值。但是在從高濃度的有機溶劑透析入低濃度有機溶劑，或者從低pH換液進入高pH時，IFN-13-la會不穩定，甚至會造成活性的喪失(Y.K.Tan et al.，J.Biol.Chem.，1979，254:8067-8073)。另外，在中度純化過程中，一些專利(U.S.Pat.N0.0, 305，669，U.S.Pat.N0.0, 093，649等)利用了 RP-HPLC對樣品進行純化，并使用有機溶劑如乙腈、乙醇等對樣品進行洗脫，而在純化過程中反復使用有機溶劑有可能會對樣品IFN-β-1a的活性產生影響。
[0012]因此，本領域需要高產率、便捷、低成本地生產和高活性地純化重組人IFN-P-1a的方法。

【發明內容】

[0013]本發明的目的是提供一種表達重組人IFN-β -1a的穩定細胞系，并大規模生產和純化重組人IFN-β-la。
[0014]因此，第一方面，本發明提供了一種核酸，其編碼人IFN-13-la且包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列。
[0015] 特別地，本發明還提供了包含所述核酸的表達質粒和用所述表達質粒轉染的哺乳動物細胞系。
[0016]第二方面，本發明提供了構建表達重組人IFN-P-1a的穩定哺乳動物細胞系的方法，所述方法包括；
[0017]使用G418硫酸鹽進行篩選并選擇甲氨蝶呤(MTX)加壓擴增系統，其中MTX的濃度為 10-?000ηΜ，優選為 10~20ηΜ，例如 10ηΜ、15ηΜ 或 20ηΜ ；
[0018]其中，所述重組人IFN-β -1a由所述核酸編碼。
[0019]第三方面，本發明提供了大規模生產重組人IFN-P-1a的方法，其中所述方法使用表達重組人IFN-β -1a的穩定哺乳動物細胞系，且所述方法包括:
[0020]使用具有雙層濾網的旋轉過濾器的生物反應器，濾網的孔徑為5 μ m-?ο μ m,例如5μπι、8μπι和10 μ m，優選使用5μπι和10 μ m組成的雙層濾網，通過雙層濾網截留細胞，收獲發酵液。
[0021]第四方面，本發明還提供了純化哺乳動物細胞系表達的重組人IFN-13_la的方法，所述方法依次使用親和層析色譜、金屬離子螯合色譜和陽離子交換色譜對重組人IFN-P-1a進行純化。
[0022]現通過以下實施方式并且結合附圖來進一步描述本發明，應理解，這些實施方式僅用于例證的目的，不限制本發明的范圍，同時本領域普通技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發明范圍之內。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為XOGC-1fn β Ia質粒構建流程圖。
[0024]圖2為PCR擴增SEQ ID N0.1所示的重組人IFN- β -1a編碼序列的結果，泳道1:DNA分子量標記；泳道2為PCR擴增的重組人IFN- β -1a序列。
[0025]圖3為PCR和酶切鑒定陽性XOGC-1fn β Ia質粒的結果，泳道1:DNA分子量標記；泳道2:PCR擴增的結果；泳道3:酶切鑒定結果。
[0026]圖4為從中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達產物中制備具有高純度的重組人IFN-β-1a的純化工藝的一個【具體實施方式】的流程圖。
[0027]圖5為使用親和色譜柱Blue Sepharose6Fast Flow對前期處理過的CHO發酵液進行純化后所得的洗脫曲線圖。
[0028]圖6為使用金屬鋒離子螯合色譜柱IMAC HP-Zinc對Blue Sepharose6Fast Flow的洗脫液進行純化所得的洗脫曲線圖。
[0029]圖7為使用強陽離子交換色譜柱Source S對IMAC-Zinc洗脫液進行純化所得的洗脫曲線圖。
[0030]圖8為使用SDS-PAGE對所得的IFN-β -1a蛋白樣品的純度檢測結果。
[0031]圖9為使用RP-HPLC對所得的IFN-β -1a蛋白樣品的純度檢測結果。
[0032]圖10為對所得IFN-β -1a蛋白樣品進行體外抗增殖活性實驗的測定結果。
[0033]圖11為使用所得的IFN-β -1a蛋白樣品進行體外抗病毒活性實驗的測定結果。
[0034]圖12 為 SEQ ID N0.1、2 和 3 的序列。
【具體實施方式】
[0035]本發明的第一方面提供了一種核酸，其編碼人IFN-β -1a且包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列。
[0036]特別地，本發明還提供了包含所述核酸的表達質粒和用所述表達質粒轉染的哺乳動物細胞系。
[0037]所述表達質粒可以是任何適用于在哺乳動物細胞系中進行目的蛋白的表達的表達質粒，包括 pcMV、 pEGFP、pcDNA、pUB6、pVAX 和 XOGC 等，優選 X0GC。
[0038]所述哺乳動物細胞系可以是任何經修飾以表達IFN-P-1a的哺乳動物細胞，包括動物細胞和人細胞，任選分泌表達IFN-β -1a的動物細胞，例如3Τ3細胞、COS細胞、人骨肉瘤細胞、MRC-5細胞、BHK細胞，VERO細胞、包括CH0/DG44 (dhfr_)的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、CHO-S細胞、HEK293細胞、常人纖維母細胞、基質細胞、肝細胞和PER.C6細胞等。優選地，所述細胞為CHO細胞，更優選為CH0/DG44 (dhfr_)細胞系。
[0039]本發明的第二方面提供了構建表達重組人IFN-P-1a的穩定哺乳動物細胞系的方法，所述方法包括:
[0040]使用G418硫酸鹽進行篩選并選擇甲氨蝶呤(MTX)加壓擴增系統，其中MTX的濃度為 10-?000ηΜ，優選為 10~20ηΜ，例如 ΙΟηΜ、15ηΜ 或 20ηΜ ；
[0041]其中，所述重組人IFN-β -1a由包含SEQ ID N0.1的核酸序列編碼。
[0042]在一個實施方式中，其中使用XOGC作為表達質粒，使用CH0/DG44(dhfr_)細胞系作為宿主細胞系。
[0043]本發明的第三方面提供了大規模生產重組人IFN-P-1a的方法，其中所述方法使用表達重組人IFN-β -1a的穩定哺乳動物細胞系，且所述方法包括:
[0044]使用具有雙層濾網的過濾器的生物反應器，通過雙層濾網截留細胞，收獲發酵液，其中所述濾網的孔徑為5 μ m-ΙΟ μ m,例如5μηι、8μηι或10 μ m,優選使用5μηι和10 μ η!組成的雙層濾網。
[0045]在一個實施方式中，所述大規模生產重組人IFN-β -1a的方法還包括:
[0046]在大規模生產前將表達重組人IFN-β -1a的穩定哺乳動物細胞系進行無血清懸浮適應培養，并使最初的貼壁細胞適應無血清懸浮生長。
[0047]在一個實施方式中，采用直接降低血清的方法進行無血清懸浮適應培養。例如，向貼壁細胞中直接加入無血清培養基，在37°C、5%C02的細胞培養箱里靜置培養，待2至3天后，部分細胞在培養基中懸浮起來，將此部分細胞收集起來，放入三角搖瓶中，在搖床上震蕩培養。
[0048]在一個實施方式中，無血清懸浮適應也可以采用逐步降低血清的方法。例如，將血清濃度由最初的10%，逐步下降至5%，2%，1%，0.5%，0.1%，至最終為0%，每個血清濃度適應3至5代次，待細胞恢復至正常生長狀態即可下降至下一個濃度。經過無血清懸浮適應后的細胞，其活力應保持在95%以上，倍增時間在20至30小時左右。
[0049]在一個實施方式中，在大規模生產重組人IFN-P-1a的過程中使用的培養液為無血清培養液。
[0050]在一個實施方式中，所述生物反應器為改造的生物反應器，即在其原有濾筒的基礎上再加上一層不銹鋼濾網，其孔徑為5 μ m-10 μ m,例如5 μ m、8 μ m和10 μ m,優選為5 μ m。
[0051]在一個實施方式中，所述大規模生產重組人IFN-β -1a的方法還包括:
[0052]采用灌注培養的方式，每天灌注體積為f 10倍罐體積，優選f 1.5倍罐體積；
[0053]生產的過程包括兩個階段，第一階段為生長期，在37°C溫度下進行，第二階段為生產期，溫度低于37°C，優選在30°C溫度下進行。
[0054]在一個實施方式中，所述大規模生產重組人IFN-β -1a的方法還包括:
[0055]在所述第二階段生產期，培養液中加入濃度為0.rimM的丁酸鈉，例如濃度為0.lmM、0.3mM 或 ImM，優選 0.3mM 的丁酸鈉。
[0056]在一個實施方式中，其中所述溫度降低為連續降溫，如每半小時降0.5°C，如降低至小于37。。，如33°C或30°C。
[0057]在一個實施方式中，在大規模生產重組人IFN-P-1a的過程中將細胞培養液的pH控制在7.1至7.4之間。所述控制可以通過例如加入7.5%的NaHCO3溶液實現。
[0058]在一個實施方式中，在大規模生產重組人IFN-P-1a的過程中向細胞培養液中加入消泡劑。
[0059]所述消泡劑可以為適用于重組人IFN-β -1a的生產的任何消泡劑，例如anti foamSE-15 (Sigma, A8582-500P)。
[0060]在一個實施方式中，在生長期時細胞培養液的溶氧(DO)為40-60%，例如約50% ;在生產期時細胞培養液的溶氧(DO)為20~40%，例如約30%。
[0061]在一個實施方式中，在生產期降低培養液中的葡萄糖和谷氨酰胺濃度，例如將濃度降低為生長期使用的培養液的25~50%，例如降低為50%，如將葡萄糖和谷氨酰胺的濃度分別降為2g/L和0.15g/L。
[0062]在一個實施方式中，在細胞生長期的中后期即活細胞密度達到30X105時，開始補加植物蛋白水解物并隨著密度的增加逐步增加其濃度，由起始的lg/L提高到3g/L。
[0063]在一個實施方式中，在細胞密度為20X105時開始灌注。起初以0.2WV (工作體積)的速率開始灌注，之后每天逐步提 高0.2WV的灌注速率，當活細胞密度達到140X105時灌注速率達1.5WV/天，在活率大于95%時開始降溫將細胞轉入生產期。進入生產期的第三天，活細胞密度達到最高值200-250X105時，逐步調低灌注速率。為使細胞密度和活率長期維持最高值，最低灌注速率為IWV/天。在生產的中后期活細胞密度開始減少、活率下降，逐步降低灌注速率，當活細胞密度小于100X105、活率低于70%時停止該批次培養。
[0064]在一個實施方式中，所使用的表達重組人IFN-P-1a的穩定哺乳動物細胞系為本發明第二方面獲得的細胞系。[0065]在一個實施方式中，其還包括純化所述重組人IFN-β -la。
[0066]在一個實施方式中，所述純化可以按照如下所述的純化方法來進行。
[0067]本發明的第四方面提供了純化哺乳動物細胞表達的重組人IFN-β-1a的方法，所述方法包括依次使用親和層析色譜、金屬離子螯合色譜和陽離子交換色譜對重組人IFN-P-1a進行純化。
[0068]在一個實施方式中，所述純化方法包括:
[0069]1)應用親和層析色譜對經過前期處理后的IFN-β -1a進行純化；
[0070]2)應用金屬離子螯合色譜對親和層析色譜的洗脫液進行純化；
[0071]3)應用陽離子交換色譜對IFN-β -1a進行進一步的純化。
[0072]在一個實施方式中，所述純化還包括:
[0073]將金屬離子螯合色譜的洗脫液進行稀釋。
[0074]在一個實施方式中，所述純化還包括將含有IFN-β -1a的細胞上清進行過濾、濃縮、換液的前期處理。
[0075]在一個實施方式中，在親和層析色譜和金屬離子螯合色譜之間不需要置換緩沖液、調整pH。
[0076]在一個實施方式中,所使用的親和層析色譜填料為Blue Sepharose系列,優選為Blue Sepharose6Fast Flow。
[0077]在一個實施方式中，所使用的金屬離子螯合色譜填料為IMAC Sepharose系列，優選為 IMAC Sepharose High Performance。
[0078]在一個實施方式中，所述金屬離子螯合色譜填料所螯合的金屬離子包括Cu2+、Me2+、Zn2+、N1.和 Fe3+，優選為 Zn2+。
[0079]在一個實施方式中，所用的陽離子交換色譜填料為強陽離子性離子交換吸附劑，優選磺丙基型。
[0080]在一個實施方式中，將所述親和層析色譜的洗脫組分直接進行金屬離子螯合色譜。例如，中間不需要置換緩沖液、調整pH。
[0081]更具體地，本發明所述的純化方法是指在IFN-β-1a樣品的捕獲階段和中度純化階段分別使用親和層析色譜和金屬離子螯合色譜進行純化，并且中間沒有透析換液步驟；然后應用陽離子色譜對金屬離子螯合色譜的洗脫液進行精細純化，不需要調整PH即可上樣。
[0082]在本發明中，對含有IFN-P-1a的細胞上清進行前期處理主要是指:將細胞上清用孔徑為0.45微米的微濾膜包(Sartorius Stedim biotech)進行過濾；然后用孔徑為5KDa的超濾膜包(Sartorius Stedim biotech)進行濃縮及透析換液,并使換液后IFN-P-la的濃度小于0.5mg/ml。此過程中所應用的緩沖液為磷酸緩沖液，pH范圍可以為7.0-7.6，優選為7.4 ;樣品經透析換液處理后調整NaCl濃度為0.8-1.2M，優選為1M，調整鹽濃度所用母液為5M NaCl ;調整完樣品的NaCl濃度后，對樣品進行離心，轉速范圍為5000-10000rpm，時間范圍為20-40分鐘，優選為7000rpm，30分鐘。
[0083]在本發明中，對含有IFN-P-1a的細胞上清進行前期處理后，應用親和層析色譜Blue Sepharose6Fast Flow對含IFN-β-1a的樣品進行純化。純化過程包括層析柱的平衡、上樣、雜質蛋白的洗脫以及含IFN-P-1a樣品的洗脫過程，緩沖液為磷酸緩沖液，pH范圍為7.0-7.6，優選為7.4。 平衡緩沖液為含有IMNaCl的磷酸緩沖液，平衡過程應不少于3個柱體積，流速為50-80cm/hr ;樣品上樣流速為50-80cm/hr，上樣結束后，用平衡緩沖液沖洗2-4個柱體積，優選為3個柱體積；雜質洗脫緩沖液I為含有2M NaCl的磷酸緩沖液，洗脫過程為1-3個柱體積,優選為2個柱體積，洗脫流速為50-80cm/hr ;雜質洗脫緩沖液II為含有IM NaCl,25-35%乙二醇(優選30%乙二醇)的磷酸緩沖液，洗脫過程為1_3個柱體積，優選為2個柱體積，洗脫流速為50-80cm/hr ;IFN_ β -1a的蛋白洗脫緩沖液為含有2M NaCl,40-60%乙二醇(優選50%乙二醇)的緩沖液，洗脫過程為1.5-2.5個柱體積，優選為2個柱體積，洗脫流速為30-60ml/min。
[0084]在本發明中，樣品經Blue Sepharose6Fast Flow純化后,將含IFN-β-1a的洗脫組分用金屬離子螯合色譜進行純化。純化過程主要包括:將含IFN-P-1a的洗脫組分混合后泵入層析柱中，洗去雜蛋白，然后用線性PH梯度洗脫目的蛋白。色譜柱的平衡緩沖液為含有0.5-1M NaCl (優選為IM NaCl)的磷酸緩沖液，pH范圍為7.0-7.6，優選為7.4 ;上樣結束后，用平衡緩沖液沖洗兩個柱體積，然后用PH范圍為5.8-6.2、含IM NaCl的醋酸緩沖液洗脫雜質蛋白，洗脫過程為1-3個柱體積，優選為2個柱體積；目的蛋白的洗脫液為含IM NaCl的醋酸緩沖液，以線性pH梯度對含IFN-β -1a的組分進行洗脫，pH梯度范圍為
6.0-4.0，梯度長度為8-15個柱體積。
[0085]在本發明中，所用的金屬離子螯合色譜的基質可為IMAC-HP (GE)，也可為Metal-Chelating Sepharose Fast Flow(GE),優選為 IMAC-HP。螯合過程中所用的金屬離子可為 Cu2+、Me2+、Zn2+、Ni+、Fe3+，優選為 Zn2+。
[0086]在本發明中，經過金屬離子螯合色譜純化后收集的含IFN-β -1a的洗脫組分可經降低NaCl濃度，然后用于后續的陽離子色譜純化。在此過程中可應用稀釋、凝膠色譜換液、透析等方法以降低樣品中NaCl的濃度。經過處理后的含IFN-P-1a的組分在常溫下電導應低于25ms/cm,優選為低于20ms/cm。
[0087]在本發明中，應用陽離子色譜純化經金屬離子螯合色譜純化后的含IFN-β -1a的洗脫組分。所用緩沖液為含有1-20%乙二醇的磷酸緩沖液，磷酸緩沖液濃度為5-20mM，pH范圍為5.0-6.0，優選為5.5。A相緩沖液為不含有NaCl的磷酸緩沖液，B相緩沖液含有IMNaCl的磷酸緩沖液。用線性梯度對含IFN- β -1a的組分進行洗脫，線性梯度范圍為0_70%Β，優選為10-60%Β，更優選為20-50%Β，最優選為20_50%Β。梯度長度為10-30個柱體積。
[0088]在本發明中，所用的強陽離子色譜為Sourcel5S、Source30S、SP Sepharose HP,優選為 Sourcel5S。
[0089]在本發明中，陽離子色譜純化操作所在的環境溫度應低于10°C，優選為4°C。
[0090]在一個實施方式中，所述表達重組人IFN-P-1a的哺乳動物細胞系是由本發明的構建表達重組人IFN-β -1a的穩定細胞系的方法獲得的。
[0091]在一個實施方式中，其中所述表達重組人IFN-13_la的哺乳動物細胞系為CHO/DG44 (dhfr-)細胞系，所述細胞系轉染了表達包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列的表達質粒。
[0092]在一個實施方式中，所述質粒為X0GC。
[0093]在一個實施方式中，用于所述大規模生產重組人IFN-P-1a的方法中的所述表達人IFN-β -1a的穩定細胞系可以為任何表達重組人IFN-β -1a的哺乳動物細胞系。[0094]在一個實施方式中，所述表達重組人IFN-β -1a的穩定細胞系是表達重組人IFN-P-1a 的 CHO 克隆。
[0095]在一個實施方式中，所述方法還包括對重組人IFN-β-1a抗病毒活性的測定。所述測定方法可以是使用人肺癌細胞系(Α549)及腦心肌炎病毒(EMCV)，通過測定Α549細胞的增殖來檢測干擾素抗EMCV病毒的活性。
[0096]在一個具體的實施方式中，本發明涉及:
[0097]I)構建一種XOGC-1fn β Ia的載體，該載體構建的流程如圖1所示，主要包括:
[0098] 1-1)優化的適用于CHO細胞的重組人IFN-β -1a的編碼基因(SEQ ID N0.1)；CH0細胞為中國倉鼠卵巢來源的細胞系，相對于來源于人的IFN-13_la的編碼基因，經過優化的基因序列更加適合CHO細胞聞效的表達目的蛋白；
[0099]1-2)通過PCR的方法將上述基因擴增，并利用Hind III和EcoR I限制酶識別位點將重組人IFN-β -1a的編碼基因連接到表達質粒XOGC中，得到表達質粒XOGC-1fn β la。
[0100]2)使用XOGC-1fn β Ia表達質粒轉染CH0/DG44 (dhfr-)細胞，并使用G418篩選標記篩選穩定整合細胞，之后利用MTX作為基因擴增的篩選標記，基因擴增后目的蛋白表達量得到了有效的提高，人IFN-β -1a的表達水平提高了約200倍，目的基因的快速、有效擴增為表達量提高提供有力保障，也使得基因擴增所消耗的時間減少；最后通過單克隆化的過程得到穩定表達重組人IFN-β -1a的細胞系，細胞系表達水平最高為7mg/L。
[0101]3)將穩定細胞系使用無血清培養基進行懸浮適應培養，并使最初的貼壁細胞適應無血清懸浮生長，表達水平最高可達17mg/L，且倍增時間約20小時，倍增時間的縮短將有利于提聞生廣效率。
[0102]4)在生物反應器中利于懸浮培養的方式進行重組人IFN-β -1a的生產，主要包含以下方面:
[0103]4-1)開創性的使用一種雙層的濾筒，這樣處理過的濾筒在灌注培養中的細胞截留率達到97%以上，顯著的減少了活細胞的浪費，為生產期時長期維持高的活細胞密度提供了重要的基礎；
[0104]4-2)使用無血清培養基，降低生產成本,減少終產品的血清殘留；
[0105]4-3)分兩個階段進行生產，第一階段為生長期，使用37°C培養條件；第二階段為生產期，連續降溫至30°C，并在生產培養基中加入0.3mM濃度的丁酸鈉；
[0106]4-4)收獲重組人IFN-β-1a的產量可達60mg/L，表達水平高，非常有利于大規模工業化的生產重組人IFN-β -la。
[0107]上述優點表明，使用XOGC-1fn β Ia的載體轉染CH0/DG44細胞，經過篩選加壓得到單克隆細胞株，在生物反應器中進行大規模生產，可以獲得重組人IFN-β-1a的產量達到60.52mg/L，產量高于現有報道水平；比活性達到282，000MIU/mg,高于商品化產品Rebif(272，000MIU/mg)。因此，成功得到了可以高表達重組人IFN-β-1a的穩定細胞系，并應用于大規模生產。
[0108]進一步地，本發明提供了一種改進的重組人IFN-P-1a的純化方法，在利用BlueSepharose FF對樣品進行初步純化以后,不需要進行透析換液,直接將Blue Sepharose FF的洗脫液利用金屬螯合色譜進行純化。這樣不僅省去了透析換液的步驟，精簡了工藝，提高了收率，而且在金屬螯合色譜上樣前后樣品的PH沒有變化，有利于保持IFN-P-1a的穩定性和活性。同時在本發明所提出的方法中，樣品經過金屬螯合色譜純化以后，應用了陽離子色譜作為IFN-P-1a的精細純化方法。在本發明中，從金屬螯合色譜洗脫下來的樣品，在酸性的PH環境中，不需要調整pH，即可用于陽離子色譜的純化，從而最大程度地保證了IFN-β -1a樣品的穩定性和活性。應用本發明提出的制備方法，所獲得的IFN-β -1a經反相色譜和SDS-PAGE鑒定的純度在97%以上，活性與市場化的IFN-β -1a相當，并且內毒素亦可滿足藥典的要求。因此本方法可用于規模制備重組人IFN-β -la。
[0109]通過以下實施例中更好地理解本發明，然而這些實施例僅為舉例說明，而不應被認為是對本發明的限制。
[0110]如無特別說明，在以下實施例中所用原料均為市售產品。
[0111]實施例
[0112]以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明并不限于此。
[0113]實施例中所使用的試劑及儀器:
[0114]試劑:
[0115]1.PCR 擴增 IOXbuffer, New England Biolabs, M0273V ；
[0116]2.酶切 IOXEcoR buffer, New England Biolabs, ROlOlV ；
[0117]3.連接 IOX Ligation buffer, New England Biolabs, M0202V ；
[0118]4.連接酶 Ligase, New England Biolabs, M0202V ；
[0119]5.Wizard plus SV Minipreps 質粒提取試劑盒，Promega;
[0120]6.Lipofectamine2000 轉染試劑，Invitrogen, 11668019;
[0121]7.培養基 a-MEM, SAFC, 51451C;
[0122]8.10% 透析胎牛血清，Gibco, 30067-334;
[0123]9.G418, Cellgro, 61-234RG;
[0124]10.甲氨蝶呤 MTX，Sigma，M-8407;
[0125]11.培養基 SFM4-CH0，Hyclone, SH3O^8.04;
[0126]12.培養基 Excel 1-CH0，SAFC，63225C ;
[0127]13.培養基 Lonza2, Lonza, CD PR02 ；
[0128]14.培養基 1640，Gibco, 22400-089 ；
[0129]15.ELISA 試劑盒，Human IFN-beta ELISA 試劑盒，R&D，41410-2 ；
[0130]16.1FN- β -1a 蛋白 Rebif, Merck Serono 公司；
[0131]儀器:
[0132]1.5L 生物反應器，Sartorius, Bplus twin5L ；
[0133]2.微濾膜包系統，Sartorius ；
[0134]3.超濾系統，Sartorius, Cross flow Systerm ；
[0135]4.AKTA explorerlOO 型蛋白純化系統，GE Healthcare, AKTA (C) 1480077 ；
[0136]5.親和層析色譜柱，GE Healthcare, Blue Sepharose6Fast Flow (16mm 1.D.,30ml)；
[0137]6.金屬離子螯合色譜柱，GE Healthcare, IMAC Sepharose High Performance(16mm 1.D., 30ml)；
[0138]7.陽離子色譜柱，GE Healthcare, Sourcel5S (10mm 1.D., 15ml);[0139]8.C02 培養箱，Thermo fisher，Heracell 150i。
[0140]實施例1.編碼人IFN- β -1a的核苷酸序列的密碼子優化
[0141]成熟的人IFN- β -1a多肽序列來源于NCBI蛋白質數據庫參考序列(NCBIReference Sequence:NP_002167),具體序列如下:
[0142]mtnkcllqia lllcfsttal smsynllgfI qrssnfqcqk llwqlngrle yclkdrmnfdipeeikqlqq fqkedaalti yemlqnifai frqdssstgw netivenlla nvyhqinhlk tvleeklekedftrgklmss lhlkryygri lhylkakeys hcawtivrve ilrnfyfinr ltgylrn
[0143]優化后的編碼序列如SEQ ID N0.1所示。
[0144] 實施例2.重組質粒XOGC-1fn β Ia的構建
[0145]重組質粒XOGC-1fn β Ia的構建流程如圖1所示。
[0146]1.優化的人IFN-β-1a編碼序列(SEQ ID N0.1)由南京金斯瑞公司合成，產物以pUC57-1fn β Ia質粒的形式交付。
[0147]以pUC57-1fn@Ia重組質粒為模板，用 ifnP la-F(SEQ ID N0.2)和 ifnP Ia-RCSEQID N0.3)為引物進行PCR擴增。反應體系為H2034.7 μ 1，10Xbuffer(New England Biolabs公司的 M0273V)6y l，lmM dNTP12 μ 1，10 μ M ifn β la_F3 μ 1，10 μ M ifn β la_F3 μ 1，TaqDNA聚合酶 0.3 μ l，pUC57-1fnP Ia質粒 I μ I。擴增條件為:94°C 2min ；94°C 30s, 50°C 30s,72°C 30s，共30個循環；94°C 5min。如圖2所示，擴增產物大小為585bp，經瓊脂糖凝膠回收后溶于30 μ I無菌水中，并儲藏在-20°c備用。
[0148]2.人IFN-β -1a編碼序列的酶切、連接和轉化大腸桿菌
[0149]上述PCR擴增所用引物帶有Hind III和EcoR I限制酶識別位點，將擴增回收的產物進行酶切反應，反應體系為:Η20 6 μ I, IOXEcoR buffer (New England Biolabs公司的R0101V) 2μ 1，Hind III I μ 1，EcoR I I μ 1，由上述制備的擴增產物10 μ I。反應條件為:37°C3hr。用同樣的體系和條件酶切2yg XOGC表達載體。反應結束后用瓊脂糖電泳膠回收經酶切的基因片段和表達載體，分別溶于30 μ I無菌水。
[0150]將表達載體和基因片段進行連接，反應體系為:Η204μ 1，IOXLigation buffer(New England Biolabs公司的M0202V)2 μ 1，酶切回收的基因片段10 μ 1，酶切回收的XOGC表達載體 3 μ I,Ligase (New England Biolabs 公司的 M0202V) I μ I。室溫放置 2hrs。將連接產物電轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，涂布于含有氨芐青霉素50 μ g/ml的LB平板，37 °C倒置培養過夜。
[0151]3.重組質粒XOGC-1fn β Ia的鑒定
[0152]挑取在含有氨芐青霉素50 μ g/ml的LB上生長的陽性菌落至含有氨芐青霉素50μg/ml的5ml LB液體培養基，37°C、180rpm振蕩培養過夜。按照Wizard plus SVMinipreps質粒提取試劑盒(Promega)操作說明提取質粒,并進行PCR和酶切鑒定,反應體系和條件與上述擴增和酶切人IFN-P-1a編碼序列的條件相同，結果如圖3所示。將鑒定結果正確的克隆進一步進行DNA測序。測序結果無誤的質粒用于哺乳動物細胞的轉染。
[0153]實施例3.CH0/DG44(dhfr-)細胞的培養、轉染及篩選、加壓
[0154]1.CH0/DG44 (dhfr-)細胞培養
[0155]CH0/DG44 (dhfr-)細胞為 DHFR 缺陷型的 CHO 細胞(以下簡稱為 CH0/DG44 (dhfr-)或CH0/DG44)，細胞復蘇之后傳2-3代，當其存活率達到95%時，可以用于轉染實驗。[0156]2.細胞轉染
[0157]利用Lipofectamine2000 轉染試劑(Invitrogen, 11668019)按照說明書進行 CHO/DG44細胞的轉染。具體地，將質粒5ug和a -MEM培養基3mL在一個離心管中混合，同時在另一個離心管里混合轉染劑20uL和a -MEM培養基3mL。在潔凈工作臺里室溫靜置5分鐘后將上述稀釋的質粒和轉染劑混合，繼續靜置30分鐘。然后輕柔的將6mL混合物加入75cm2的細胞培養方瓶(含匯合度為70-80%的CH0/DG44細胞)中，然后將方瓶置于37°C、5%C02的細胞培養箱里培養。培養過夜之后，移去轉染試劑混合物，加入新鮮培養基α-ΜΕΜ(SAFC, Cat.N0.51451C)，并添加 10% 透析胎牛血清(Gibco, Cat.N0.30067-334)。然后將方瓶置于37°C、5%C02的細胞培養箱里培養f 2天。之后將新鮮培養基中加入lmg/mL G418(Cellgro, Cat.N0.61-234RG)，以此培養基對細胞進行培養，持續2周時間。
[0158]3.擴增目的基因拷貝數以提高蛋白表達水平
[0159]使用含甲氨蝶呤(MTX，Sigma, Cat.N0.M-8407)的選擇培養基來培養細胞。一般以IOnM MTX為起始濃度。傳代5次之后檢測目的蛋白的表達水平。在此過程中，監控細胞生長狀態，包括細胞數、活率、倍增時間、細胞直徑等。細胞生長狀態恢復正常之后進行20nMMTX的加壓。當目的蛋白表達水平不再提高之后，不再繼續提高MTX的加壓濃度。
[0160]在此過程中，使用ELISA的方法檢測人IFN- β -1a的表達量，并且使用抗病毒增殖的方法檢測(可參見實施例10的方法)人IFN- β -1a的活性，結果如表1所示。
[0161]表1.不同的混合細胞庫中人IFN-β -1a的表達量及活性
[0162]
【權利要求】
1.核酸，其編碼人IFN-β-1a且包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列。
2.表達質粒,其中包含權利要求1所述的核酸。
3.如權利要求2所述的表達質粒，其包括pcMV、pEGFP、pcDNA、pUB6、pVAX、XOGC,優選為 XOGC。
4.用權利要求2或3所述的表達質粒轉染的哺乳動物細胞系。
5.如權利要求4所述的細胞系，其中，所述細胞系選自3T3細胞、COS細胞、人骨肉瘤細胞、MRC-5細胞、BHK細胞、VERO細胞、包括CH0/DG44 (dhfr_)的中國倉鼠卵巢細胞(CH0)、CHO-S細胞、HEK293細胞、常人纖維母細胞、基質細胞、肝細胞和PER.C6細胞中的一種，優選為中國倉鼠卵巢細胞(CH0)，更優選為CH0/DG44 (dhfr_)細胞系。
6.—種構建表達重組人IFN-P-1a的穩定哺乳動物細胞系的方法，所述方法包括； 使用G418硫酸鹽進行篩選并選擇甲氨蝶呤(MTX)加壓擴增系統，其中MTX的濃度為10-?000ηΜ，優選為 10~20ηΜ，例如 ΙΟηΜ、15ηΜ 或 20ηΜ ； 其中，所述重組人IFN-P-1a由權利要求1所述的核酸編碼。
7.如權利要求6所述的方法，其中使用XOGC作為表達質粒，使用CH0/DG44(dhfr_)細胞系作為宿主細胞系。
8.大規模生產重組人IFN-P-1a的方法，其中所述方法使用表達重組人IFN-β-1a的穩定哺乳動物細胞系，且所述方法包括: 使用具有雙層濾網的過濾器的生物反應器，通過雙層濾網截留細胞，收獲發酵液，其中所述濾網的孔徑為5 μ m-10 μ m,例如5 μ m、8 μ m或10 μ m,優選使用5 μ m和10 μ m組成的雙層濾網。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述方法還包括: 在大規模生產前將表達重組人IFN-β -1a的穩定哺乳動物細胞系進行無血清懸浮適應培養，并使最初的貼壁細胞適應無血清懸浮生長。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述懸浮適應培養可以通過直接加入無血清培養液或者逐步降低血清的方法而進行。
11.如權利要求8至10中任一項所述的方法，其中在大規模生產重組人IFN-0-la的過程中使用的培養液為無血清培養液。
12.如權利要求8至11中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括: 采用灌注培養的方式，每天灌注體積為廣10倍罐體積，優選廣1.5倍罐體積； 生產的過程包括兩個階段，第一階段為生長期，在37°C溫度下進行，第二階段為生產期，溫度低于37°C，優選在30°C溫度下進行。
13.如權利要求8-12中任一項所述的方法，其中所述表達重組人IFN-P-1a的穩定細胞系為權利要求4或5所述的細胞系或由權利要求6或7所述的方法獲得的細胞系。
14.純化哺乳動物細胞表達的重組人IFN-β-1a的方法，其包括依次使用親和層析色譜、金屬離子螯合色譜和陽離子交換色譜對重組人IFN- β -1a進行純化。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述純化還包括: 將金屬離子螯合色譜的洗脫液進行稀釋。
16.如權利要求14或15所述的方法，其中，在親和層析色譜和金屬離子螯合色譜之間不需要置換緩沖液和調整pH。
17.如權利要求14-16中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞系為權利要求6或7所述的方法獲得的或為權利要求4或5所述的細胞系。
18.如權利要求8-13所述的方法，其還包括一個純化步驟，所述純化步驟是按照權利要求14-17中任一 項所述的方法進行的。
【文檔編號】C12R1/91GK103898123SQ201210587363
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】宋楠萌, 涂祁鵬, 杜伯雨, 張磊, 薛劍峰, 劉家望, 趙娟, 金孟燮 申請人:北京韓美藥品有限公司