一種重組腸激酶的制備方法

一種重組腸激酶的制備方法
【專利摘要】本發明一種重組腸激酶的制備方法屬于生物【技術領域】。本發明提供了包含腸激酶基因的表達載體和工程菌，還提供了腸激酶的制備方法，包括培養工程菌、收獲工程菌菌體、破碎得包涵體、洗滌和溶解包涵體、復性、酶原活化及純化腸激酶的步驟。本發明的方法是重組腸激酶制備工藝成熟、質量穩定、純度高、成本低，適合藥用蛋白生產。
【專利說明】一種重組腸激酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種重組腸激酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]腸激酶(Enterokinase, EK)是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然腸激酶分子量為150kDa，由I條115kDa重鏈和I條35kD輕鏈組成，重鏈負責在消化道細胞膜上的錨定以及與腸激酶融合蛋白的結合，輕鏈具有催化活性，可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割,將腸激酶融合蛋白活化為腸激酶，從而啟動消化道內各種酶原活化的級聯反應。
[0003]由于腸激酶識別位點的特異性和切割后在目標蛋白N末端不留任何氨基酸殘基，而且可以在pH 4.5~9.5、溫度4~45°C范圍內特異性水解蛋白底物，因此它已經成為基因工程制藥領域融合蛋白切割的的首選工具酶，廣泛應用于各種重組蛋白、多肽藥物的加工成熟。天然的腸激酶來源有限，需從動物組織分離提取，因為從動物組織提取的腸激酶易殘留其他的蛋白酶，對融合蛋白的產生降解；另外，來源于動物組織的腸激酶可能帶有未知病毒等動物源性污染，為藥物蛋白生產增加了額外的風險。通過基因工程的方法生產的腸激酶輕鏈，具有天然腸激酶的全酶活性和特異性，在融合蛋白切割中被廣泛應用。已有報道的重組腸激酶輕鏈多為實驗室級別，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質，而且作為原輔料進行藥物蛋白生產時，其殘留不能被有效檢測和控制，對藥用蛋白的生產中增加許多風險。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種重組腸激酶的制備方法，以克服現有技術中重組腸激酶輕鏈多為實驗室規模制備，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質的技術缺陷。
[0005]本發明的思路是這樣的:通過合成N端帶有腸激酶酶切位點的基因，連接到pET-32a(+)質粒中硫氧還蛋白后,在大腸桿菌宿主細胞內融合表達,表達的融合蛋白經外加少量腸激酶后，啟動自切割，從而生產具有正確結構的重組腸激酶輕鏈，分子量約為35KD，含有活性重組腸激酶(35KD)的溶液經陰離子交換層析、陽離子交換層析和疏水層析和冷凍干燥后，可得高純度、適合藥用蛋白生產的重組腸激酶產品。
[0006]發明人經過大量創造性勞動或得了本發明。
[0007]本發明所要解決的技術問題之一是:提供一種包含腸激酶基因的表達載體。
[0008]本發明所要解決的技術問題之二是:提供一種包含腸激酶基因的工程菌。
[0009]本發明所要解決的技術問題之三是:提供一種重組腸激酶的制備方法。
[0010]因此，本發明的技術方案如下: [0011]1.一種包含腸激酶基因的表達載體，其特征在于腸激酶基因序列為Seq ID N0.1。
[0012]2.根據1的表達載體，其特征在于，腸激酶基因Seq ID N0.1插入質粒pET_32a (+)的BglII和XhoI酶切位點之間。[0013]3.一種包含腸激酶基因的工程菌，其包含I或2所述的表達載體。
[0014]4.一種包含腸激酶基因的工程菌，其特征在于，由將2所述的表達載體轉化大腸桿菌BL21DE3而獲得。
[0015]5.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟:
[0016](I)培養3所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達；
[0017](2)收集菌體；
[0018](3)破碎菌體；
[0019](4)收集包涵體，洗滌包涵體；
[0020](5)包涵體復性；
[0021](6)腸激酶原活化；和，
[0022](7)活性腸激酶的純化。
[0023]6.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟:
[0024](I)培養4所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達；
[0025](2)收集菌體；
[0026](3)破碎菌體；
[0027](4)收集包涵體，洗滌包涵體；
[0028](5)包涵體復性；
[0029](6)腸激酶原活化；和，
[0030](7)活性腸激酶的純化。
[0031]7.根據5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為:接種重組工程菌陽性克隆到LB培養基中，于25-37°C下搖床振蕩培養過夜，按1-10%接種量接過夜菌于LB培養基中，37°C下搖床振蕩培養到對數期，按1-10%接種量接種到裝有發酵培養基的發酵罐中，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧在35%以上，發酵培養基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L,十二水合磷酸氫二鈉8g/L,磷酸二氫鉀4g/L,硫酸銨6g/L,七水硫酸鎂1.13g/L, 二水氯化鈣0.073g/L，補料培養基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發酵過程中PH調控，當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，調節補料速度、轉速、通氣控制溶氧在30%以上，補料4h后，降溫至23°C，調節pH至7.0,加入終濃度為
0.1-0.5mmol/L的IPTG進行有氧誘導，繼續培養6h放罐。
[0032]8.根據5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為:接種重組工程菌陽性克隆200 μ I到20ml的LB培養基中，于30°C下搖床振蕩培養過夜，按4%接種量接過夜菌于500ml的LB培養基中，37°C下搖床振蕩培養到對數期，接種到裝有6L發酵培養基的發酵罐中，初始參數為:發酵溫度37°C，攪拌速度200rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧始終在35 %以上，發酵培養基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補料培養基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發酵過程中pH調控；當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，通過控制泵的轉速合理控制補料速度，控制溶氧在30%以上，補料4h后，降溫至23°C，調節pH至7.0，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG進行有氧誘導，控制溶氧不低于20 %，6h后出罐。
[0033]9.根據5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)破碎菌體的緩沖液為 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。
[0034]10.根據5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟⑷中洗滌包涵體的緩沖液為2mol/L尿素+1.5% Triton。
[0035]11.根據5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)包涵體復性的緩沖液為 0.2mol/L 尿素 +1OmmoI/LEDTA+25mmoI/L Tis-HCL, GSH: GSSG = ImmoI/L: 0.3mmol/L, PH10。
[0036]12.根據5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(6)腸激酶原活化的條件是經腸激酶在室溫下酶解2-10小時，腸激酶/腸激酶原重量比為1/200。
[0037]13.根據5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(7)活性腸激酶的純化依次包括陰離子層析純化、陽離子層析純化和疏水層析純化步驟。
[0038]所述的“收集菌體”的方法包括但不限于離心包括連續離心、過濾等。[0039]所述的“破碎菌體”的方法，包括但不限于高壓勻漿、滲透壓沖擊、凍融、超聲波破碎等。
[0040]所述的“收集包涵體”的方法，包括但不限于離心。
[0041]所述的“洗滌包涵體”的方法，包括但不限于包涵體用純化用書或者合適的緩沖液重懸、離心、再重懸離心等2~3個循環操作。
[0042]包涵體變性和復性的方法可以按照本領域的技術人員公知的方法進行。
[0043]本發明所說的腸激酶融合蛋白基因是指與牛腸激酶輕鏈基因序列的一致的cDNA序列，通過檢索genebank數據庫獲得其序列，Seq ID N0.1,其中1-6位為BglII酶切位點，734-739位為XhoI酶切位點。
[0044]重組腸激酶輕鏈的氨基酸序列，Seq ID N0.2。，經腸激酶切除1_5位的DDDDK后，才變為有活性的腸激酶輕鏈。
[0045]本發明所述的腸激酶原和腸激酶融合蛋白有同樣的含義，其需要進一步經過酶切活化后才有腸激酶活性。
[0046]優選地,本發明腸激酶原(腸激酶融合蛋白)為Seq ID N0.2序列和硫氧還蛋白融合蛋白。
[0047]本發明的重組腸激酶的制備方法可大規模生產的腸激酶輕鏈，制備的腸激酶具有天然腸激酶的全酶活性和特異性，可被廣泛應用融合蛋白切割中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1重組質粒構建與酶切驗證圖。腸激酶(rEK)基因通過Bglll/Xhol酶切位點插入到質粒 pET-32a(+) ；line I 為 pET_32a(+)rEK ;line 2 為 pET_32a(+)rEK 的 BglII 和XhoI酶切片斷；line 3為分子量標準(kb)。
[0049]圖2重組腸激酶工程菌基因測序圖譜。
[0050]圖3重組腸激酶工程菌生長曲線圖。
[0051]圖4重組腸激酶工程菌表達，其中Linel為一級種子，Line2為二級種子，Line3為誘導前，Line4為出罐全菌。[0052]圖5重組腸激酶工程菌破碎后電泳圖，其中Linel為出罐全菌，Line2為破碎后上清，Line3為破碎后沉淀。
[0053]圖6腸激酶融合蛋白酶切圖，其中Linel為分子量標準，Line2為腸激酶原，Line3為腸激酶原酶切2Hr，Line4為腸激酶原酶切10Hr。
[0054]圖7腸激酶Q-FF純化洗脫峰。
[0055]圖8腸激酶Q-FF純化洗脫峰SDS-PAGE電泳，其中Linel為陰離子交換柱層析前，Line2為洗脫峰l，Line3為洗脫峰2，Line4為洗脫峰3，Line5為洗脫峰4，Line6為洗脫峰5。
[0056]圖9腸激酶Generic-SP純化洗脫圖。
[0057]圖10腸激酶Generic-SP純化電泳圖,其中其中Linel為陽離子交換柱層析前，Line2為洗脫峰l，Line3為洗脫峰2，Line4為洗脫峰3，Line5為洗脫峰4，Line6為洗脫峰5。
[0058]圖11腸激酶Phenyl-FF純化洗脫圖。
[0059]圖12腸激酶Phenyl-FF純化后電泳圖，其中其中Linel為疏水柱層析前，Line2為洗脫峰1，Line3為洗脫峰2，Line4為洗脫峰3。
[0060]圖13重組牛腸激酶酶切反應，其中Linel為分子量標準，Line2為底物Thioredoxin-NP-27 融合蛋 白，Line3 為 0.0008 單位 EK 反應后，Line4 為 0.0015 單位 EK反應后，Line5為0.003單位EK反應后，Line6為0.008單位EK反應后，Line7為0.015單位EK反應后，Line8為0.03單位EK反應后。
【具體實施方式】
[0061]以下結合具體實施例詳細說明本發明，這些具體實施例均為說明性的，不以任何方式限制本發明的保護范圍。
[0062]在以下具體實施例中，除有特別說明的之外，按照本領域技術人員熟知的技術手冊的教導或者試劑、設備提供商的說明書進行之。本領域的技術人員按照這些教導并結合本發明的公開的內容可以實現本發明。
[0063]實例I工程菌構建
[0064]通過合成得到以上序列cDNA，通過Bglll/Xhol酶切位點插入到質粒pET_32a(+)(購自invitrogen)相應酶切位點中，構建成的重組質粒構建圖與酶切后電泳圖如圖1所示。插入腸激酶輕鏈基因的重組質粒pET-32rEK通過化學轉化法轉化到宿主大腸桿菌BL2KDE3)中，構建重組腸激酶工程菌。經測序(圖2)，工程菌中的序列與設計一致。
[0065]實例2:工程菌高密度發酵
[0066]重組工程菌發酵，接種重組工程菌陽性克隆200 μ I到20ml的LB培養基中，于30°C下搖床振蕩培養過夜，按4%接種量接過夜菌于500ml的LB培養基中，37°C下搖床振蕩培養到對數期，接種到裝有6L培養基的發酵罐中，初始參數為:發酵溫度37°C，攪拌速度200rpm,通氣量15L/min，pH為6.7，不斷提高攪拌轉速與通氣量(轉速最大900rpm，通氣量最大30L/min)以維持溶氧始終在35%以上，培養基配方如下:
[0067]發酵培養基:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L,補料培養基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發酵過程中pH調控。
[0068]發酵數小時后，當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，通過控制泵的轉速合理控制補料速度，同時在補料速度、轉速、通氣三者的合理控制下，保證控制溶氧在30%以上。補料4h后，降溫至23°C，調節pH至7.0，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG進行有氧誘導(即保證溶氧不低于20% )6h后出罐。
[0069] 出罐后離心得菌體濕重160g/L，發酵過程中菌體生長曲線及相關取樣點電泳如圖
3、圖4所示。
[0070]實例3腸激酶純化
[0071] 發酵結束離心收集的菌體按重量體積比1: 10加入破碎緩沖液(25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA, PH7.5)，高壓均質機800bar破碎后收集沉淀和上清電泳如圖5。
[0072]將沉淀按重量體積比1: 10加入洗滌緩沖液(2mol/L尿素+1.5% Triton)，室溫磁力攪拌I小時，離心收集的沉淀用洗滌緩沖液洗滌兩次。再用包涵體溶解緩沖液(8mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, PH7.5)按重量體積比1: 10溶解過夜。溶解后的包涵體經離心、超濾去除雜質后，稀釋到蛋白濃度0.2mg/ml，在復性緩沖液(0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG= lmmol/L: 0.3mmol/L，PH10)中，4°C復性過夜，復性后的腸激酶融合蛋白經腸激酶(I: 200)在室溫下酶解2小時后即可得到具有活性的粗酶液(如圖4所示)。粗酶液分別經陰離子層析(Q-FF)純化、陽離子層析(Generic-SP)純化、疏水層析(Phenyl-FF)純化和冷凍干燥后，可獲得高純度重組腸激酶，分別見圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12所示。
[0073]實例3腸激酶活力測定方法
[0074]重組腸激酶的活力測定按每個反應含有15 μ g的Thioredoxin_NP-27和不同活力單位的腸激酶。在25°C經過16小時的反應后用SDS-PAGE膠檢測酶切效果，如圖13所示。
[0075]活性單位定義:
[0076]在25°C，8小時內將0.5毫克的Thioredoxin-NP-2795%降解為NP-27所需要的酶量定義為I個活性單位。
【權利要求】
1.一種包含腸激酶基因的表達載體，其特征在于腸激酶基因序列為Seq ID N0.1。
2.根據權利要求1的表達載體，其特征在于，腸激酶基因SeqID N0.1插入質粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位點之間。
3.一種包含腸激酶基因的工程菌，其包含權利要求1或2所述的表達載體。
4.一種包含腸激酶基因的工程菌，其特征在于，由將權利要求2所述的表達載體轉化大腸桿菌BL21DE3而獲得。
5.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟: (1)培養權利要求3所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達； (2)收集菌體； (3)破碎菌體； (4)收集包涵體，洗滌包涵體； (5)包涵體復性； (6)腸激酶原活化；和， (7)活性腸激酶的純化。
6.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟: (1)培養權利要求4所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達； (2)收集菌體； (3)破碎菌體； (4)收集包涵體，洗滌包涵體； (5)包涵體復性； (6)腸激酶原活化；和， (7)活性腸激酶的純化。
7.根據權利要求5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為:接種重組工程菌陽性克隆到LB培養基中，于25-37°C下搖床振蕩培養過夜，按1-10%接種量接過夜菌于LB培養基中，.37°C下搖床振蕩培養到對數期，按1-10%接種量接種到裝有發酵培養基的發酵罐中，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧在35%以上，發酵培養基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補料培養基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發酵過程中PH調控，當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，調節補料速度、轉速、通氣控制溶氧在30%以上，補料4h后，降溫至23°C，調節pH至7.0，加入終濃度為 .0.1-0.5mmol/L的IPTG進行有氧誘導，繼續培養6h放罐。
8.根據權利要求5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為:接種重組工程菌陽性克隆 .200 μ I到20ml的LB培養基中，于30°C下搖床振蕩培養過夜，按4%接種量接過夜菌于 .500ml的LB培養基中，37°C下搖床振蕩培養到對數期，接種到裝有6L發酵培養基的發酵罐中，初始參數為:發酵溫度37°C，攪拌速度200rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧始終在35%以上，發酵培養基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補料培養基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發酵過程中PH調控；當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，通過控制泵的轉速合理控制補料速度，控制溶氧在30%以上，補料4h后，降溫至23°C，調節pH至7.0，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG進行有氧誘導，控制溶氧不低于20%，6h后出罐。
9.根據權利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)破碎菌體的緩沖液為 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。
10.根據權利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)中洗滌包涵體的緩沖液為2mol/L尿素+1.5% Triton。
11.根據權利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)包涵體復性的緩沖液為 0.2mol/L 尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG=Immol/L: 0.3mmol/L, PH10。
12.根據權利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(6)腸激酶原活化的條件是經腸激酶在室溫下酶解2-10小時，腸激酶/腸激酶原重量比為1/200。
13.根據權利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(7)活性腸激酶的純化依次 包括陰離子層析純化、陽離子層析純化和疏水層析純化步驟。
【文檔編號】C12N15/57GK103898145SQ201210585576
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月31日 優先權日:2012年12月31日
【發明者】文良柱, 梅麗, 朱亮 申請人:江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司, 上海復星醫藥（集團）股份有限公司