微小隱孢子蟲的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種微小隱孢子蟲的檢測方法和檢測試劑盒。所述檢測方法包括以下步驟：1）免疫磁珠分離純化待檢測樣品，制得含有微小隱孢子蟲的懸液；2）熒光定量PCR檢測步驟1）制得的含有微小隱孢子蟲的懸液；所述檢測試劑盒包括所述檢測方法中的含有生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體包被的鏈霉素磁珠的反應體系、微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物。本發明所述的微小隱孢子蟲檢測方法，敏感度比傳統的方法高出了將近100倍，遠遠超過了傳統方法。
【專利說明】微小隱孢子蟲的檢測方法及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境監測及免疫診斷領域，涉及一種檢測方法及檢測試劑盒，尤其涉及一種微小隱孢子蟲的檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]微小隱孢子蟲(Cryptosporidium Tyzzer, 1907)廣泛存在于動物中，亦為人體的重要寄生孢子蟲，可引起微小隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)。寄生于人體的種類主要是微小隱孢子蟲(C.parvum),該蟲是機會致病原蟲,但也是一種重要的腹灣病原。該病的臨床癥狀和嚴重程度取決于宿主的免疫功能與營養狀況。免疫功能正常人的感染后，主要表現為急性水樣腹瀉，一般無膿血，日排便2~20余次，嚴重感染的幼兒可出現噴射性水樣瀉，排便量多。腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、食欲減退或厭食、口渴和發熱亦較常見。病程長短不一，短者I~2天，長者數年，20天至2個月上下占多數，由急性轉為慢性，進而反復發作者并不少見。該病在國外的研究報道日趨增多，國內近幾年也逐漸引起人們的注意。
[0003]目前對微小隱孢子蟲病早期檢測所采用的方法主要還是直接涂片或組織切片法查出確診。水樣的檢測方法為過濾純化富集后進行涂片染色。直接涂片或組織切片法雖然簡單快速，但漏診率高；組織培養和動物發明最真實可靠，但操作煩瑣，耗時長，成本高；ELISA方法簡便，快速，敏感性尚可，但由于個體免疫系統的差異，有時指標不能真實反映蟲體感染的情況，可能造成漏診或誤診。PCR作為一種新型的分子生物學技術，自誕生以來，由于它的特異性、敏感性，能在短時間內得到大量的目的片段，使之成為當今發明研究的重要手段之一。但常規的PCR在操作中容易造成污染，假陽性較高，使之在臨床診斷上受到一些限制。
[0004]近些年，已有應用于微小隱孢子蟲的研究報道和相關專利。例如，申請號為200880126847專利申請公開了一種檢測隱孢子蟲的方法及其專用試劑盒；申請號為200710094101的專利申請公開了隱孢子蟲快速檢測試劑盒；申請號為200510042527.1的專利申請公開了隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體ELISA檢測方法及試劑盒；申請號為200810051728的專利申請公開了用于隱孢子蟲種屬與藍氏賈第蟲檢測的多重懸浮芯片及其制備方法；申請號為03126895.1的專利申請公開了隱孢子蟲屬及隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒及檢測方法；申請號為200510009966的專利申請公開了飲用水處理過程中隱孢子蟲的在線檢測與反饋處理方法；申請號為200610030137的專利申請公開了水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲的檢測方法；申請號為200910306998的專利申請公開了提高隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲檢測回收率的過濾濃縮方法。
[0005]上述專利多在檢測水中或動物血清、組織、排泄物中是否含有隱孢子蟲，但并沒有一種可以對水體樣品和糞便 樣品中微小隱孢子蟲快速分離純化及定量檢測鑒定的方法。
[0006]本發明旨在提供一種微小隱孢子蟲的檢測方法及檢測試劑盒，能夠對水體樣品(包括飲用水)、生鮮食品及糞便樣品進行快速診斷和檢測。
【發明內容】
[0007]因此，本發明的目的是針對目前無法快速靈敏地檢測微小隱孢子蟲的不足，提供一種微小隱孢子蟲的檢測方法和檢測試劑盒，能夠快速、有效地檢測待測樣品如水體樣品、生鮮食品及糞便樣品中的微小隱孢子蟲。
[0008] 本發明采用了分離純化技術-免疫磁珠分離技術(Immunomagneticbead-basedseparation)。免疫磁珠(Immonumagnetic beads, IMB簡稱磁珠),是近年來發展起來的一項新的免疫學技術，它將固化試劑特有的優點與免疫學反應的高度特異性結合于一體，以免疫學為基礎，滲透到病理、生理、藥理、微生物、生化以及分子遺傳學等各個領域，其在免疫檢測、細胞分離、生物大分子純化和分子生物學等方面得到了越來越廣泛的應用。磁性微球的優點是:(I)粒徑小；(2)懸浮穩定性好；(3)具有超順磁性；(4)操作簡便；(5)有良好的物相容性；(6)磁性微粒具有一定的機械強度和化學穩定性。免疫磁珠分離技術(Immunomagnetic bead-based separation), IMS是一種免疫學檢測和分離技術，它是以高均一性的磁性微球為固相支持物，免疫基(如抗體，抗原等)通過功能基團結合到磁性載體上形成免疫磁性微球，利用特性的免疫學反應，在磁力作用下，發生力學移動，從混合溶液中分離檢測靶物質。
[0009]定量檢測技術-實時熒光定量PCR (Real-time PCR),該方法(Real-timePCR)與傳統方法不同，它的優點:一是單管封閉操作，有效解決了 PCR污染問題；二是自動化程度高；三是特異性更強；四是PCR反應的實時監控。有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果；五是絕對定量，由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行絕對定量測定。Real-time PCR技術自產生以來，不斷發展完善，到目前為止已經非常成熟了。標記方法由最初單一的染料法，發展到了特異性更高的探針法，如Taqman、Molecular Beacon等。SYBRGreen染料法己是較完善的檢測體系，且反應體系中SYBRGreen染料的使用濃度亦不用進行調整優化，整個檢測體系簡單易行，但用SYBRGreen染料法進行Real-timePCR也存在著一定的弊端，如結果需要進行熔解曲線分析，特別是進行多重基因檢測或引物質量不好時，其擴增的原始圖則不能直觀反映真實的擴增效率，必需經熔解曲線分析來確定最終的發明結果。熒光TaqMan技術是美國PE公司開發的，目前已經用于基因檢測。該方法具有以下的優點:在閉管狀態下進行擴增產物檢測，避免了擴增產物污染而致的假陽性；探針雜交特異性更強；無需酶切位點存在；PCR后無需后續處理，操作更簡單快速；安全無污染。DNA測序表明該方法準確性很高。Real-timePCR，是提高微小隱孢子蟲診斷靈敏度的最佳方法之一。
[0010]具體的針對上述目的，本發明提供的技術方案如下:
[0011]一方面，本發明提供一種微小隱孢子蟲的檢測方法，所述方法包括以下步驟:
[0012]1)通過免疫磁珠分離純化待檢測樣品，制得分離純化后的微小隱孢子蟲懸液；
[0013]2)熒光定量PCR檢測步驟I)制得的分離純化后的微小隱孢子蟲懸液，優選地，所述熒光定量PCR為Taqman探針法熒光定量PCR。
[0014]優選地，所述步驟I)具體包括以下步驟:
[0015]al)將待檢測樣品制成微小隱孢子蟲懸液；
[0016]bl)制得含有生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體包被的鏈霉素磁珠(Streptavidin Particles Plus-DM)的反應體系；
[0017]Cl)將步驟al)制得的微小隱孢子蟲懸液加入步驟bl)制得的反應體系中，于室溫
孵育；
[0018]dl)將孵育后的樣品洗滌后，用無菌水重懸，制得分離純化后的微小隱孢子蟲懸液。
[0019]優選地，在步驟bl)中，在反應體系中，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的終濃度為2-50ng/ml，所述鏈霉素磁珠的終濃度為20μ g/ml。
[0020]優選地，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的終濃度為20_50ng/ml，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的終濃度優選20ng/ml。
[0021]還優選地，所述反應體系通過包括將生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體和鏈霉素磁珠加入流式細胞管中孵育15-60min的方法制得。
[0022]優選地，孵育30_60min，最優選孵育30min。
[0023]優選地，所述步驟2)具體包括以下步驟:
[0024]a2)提取步驟I)制得的分離純化后的微小隱孢子蟲懸液的基因組DNA ；
[0025]b2)通過微小隱孢子蟲重組質粒標準品制定微小隱孢子蟲標準曲線；
[0026]c2)通過微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物，以步驟a2)制得的微小隱孢子蟲DNA為模板進行Taqman探針法熒光定量PCR擴增；
[0027]d2)將步驟c2) Taqman探針法熒光定量PCR擴增的結果與步驟b2)制得的微小隱孢子蟲標準曲線對比，得出待測樣品中所含的微小隱孢子蟲數。
[0028]優選地，所述步驟b2)包括以下步驟:
[0029]b21)制備微小隱孢子蟲重組質粒標準品；
[0030]b22)通過微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物，以步驟b21)制得的微小隱孢子蟲重組質粒標準品為模板進行Taqman探針法熒光定量PCR擴增，優選地，反應體系為:
[0031]
【權利要求】
1.一種微小隱孢子蟲的檢測方法，所述方法包括以下步驟: 1)通過免疫磁珠分離純化待檢測樣品，制得分離純化后的微小隱孢子蟲懸液； 2)熒光定量PCR檢測步驟I)制得的分離純化后的微小隱孢子蟲懸液，優選地，所述熒光定量PCR為Taqman探針法熒光定量PCR。
2.根據權利要求1所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，所述步驟I)具體包括以下步驟: al)將待檢測樣品制成微小隱孢子蟲懸液； bl)制得含有生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體包被的鏈霉素磁珠的反應體系； Cl)將步驟al)制得的微小隱孢子蟲懸液加入步驟bl)制得的反應體系中，于室溫孵育； dl)將孵育后的樣品洗滌后，用無菌水重懸，制得分離純化后的微小隱孢子蟲懸液。
3.根據權利要求1或2所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，在步驟Cl)中，于室溫孵育15_60min,優選地,孵育30min。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，在步驟bl)中，在反應體系中，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的終濃度為2-50ng/ml，所述鏈霉素磁珠的終濃度為20μ g/ml，優選地，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的終濃度為20-5 0ng/ml，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的終濃度優選20ng/ml ;還優選地，所述反應體系通過包括將生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體和鏈霉素磁珠加入流式細胞管中孵育15-60min的方法制得；優選孵育30_60min，最優選孵育 30min。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，所述步驟2)具體包括以下步驟: a2)提取步驟I)制得的分離純化后的微小隱孢子蟲懸液，制得微小隱孢子蟲懸液的基因組DNA ； b2)通過微小隱孢子蟲重組質粒標準品制定微小隱孢子蟲標準曲線；c2)通過微小隱孢子蟲的特異上游引物和特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物，以步驟a2)制得的微小隱孢子蟲DNA為模板進行熒光定量PCR擴增； d2)將步驟c2)熒光定量PCR擴增的結果與微小隱孢子蟲標準曲線對比，出待測樣品中所含的微小隱孢子蟲數。
6.根據權利要求5所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，所述步驟b2)包括以下步驟: b21)制備微小隱孢子蟲重組質粒標準品； b22)通過微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物，以步驟b21)制得的微小隱孢子蟲重組質粒標準品為模板進行熒光定量PCR擴增；b23)以模板拷貝數的對數為X軸，以Ct值為y軸繪制標準曲線。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，所述待檢測樣品包括水體樣品、糞便樣品和生鮮食品；優選地，當待檢測樣品為糞便時，通過包括將糞便樣品加適量滅菌水混勻制成糞便混懸液，并經80目金屬篩網過濾的步驟制成微小隱孢子蟲懸液；還優選地，所述水體樣品為飲用水或生活污水。
8.根據權利要求5至7中任一項所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，所述微小隱孢子蟲的特異上游引物的序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或所述微小隱孢子蟲的特異下游引物的序列為SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列；或所述微小隱孢子蟲Taqman熒光定量探針引物的序列為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，并且其兩端分別標記的一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
9.根據權利要求5至8中任一項所述的微小隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法還包括，在d2)步驟后，對微小隱孢子蟲檢測方法敏感性和特異性的檢測，其步驟包括: d21)微小隱孢子蟲檢測方法的敏感性檢測； d22)微小隱孢子蟲檢測方法的特異性檢測。 優選地，所述步驟d21)包括以下步驟: d211)將待測樣品制成濃度梯度為KT1-1O6個/ml的微小隱孢子懸液，更優選地，當待測樣品為糞便樣品時，通過包括將糞便樣品加適量滅菌水混勻制成糞便混懸液并經80目金屬篩網過濾的步驟制成微小隱孢子懸液；再按照步驟I)分離純化待檢測樣品，制得分離純化后的微小隱孢子蟲懸液； d212)提取步驟d211)制得的微小隱孢子蟲懸液的基因組DNA ；d213)通過微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物，以步驟d212)制得的微小隱孢子蟲DNA為模板進行Taqman探針法熒光定量PCR擴增；或 優選地，所述步驟d22)包括以下步驟: d221)將待測樣品制成濃度為IO3個/ml的微小隱孢子蟲懸液，所述待測樣品還包括103CFU/ml的大腸桿菌懸液，優選地，當待測樣品為糞便樣品時，通過包括將糞便樣品適量滅菌水混勻制成糞便混懸液并經80目金屬篩網過濾的步驟制成微小隱孢子懸液或大腸桿菌懸液； d222)提取步驟d221)制得的微小隱孢子蟲的懸液及大腸桿菌懸液的基因組DNA，并分別提取IO3個/ml的微小隱孢子懸液和103CFU/ml的大腸桿菌懸液的基因組DNA作為陽性對照樣品，無菌水作為陰性對照樣品； d223)通過微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物，以步驟d222)制得的微小隱孢子蟲DNA為模板進行PCR擴增； d224)通過大腸桿菌的特異上游引物、特異下游引物，以步驟d222)制得的大腸桿菌DNA為模板進行PCR擴增。
10.一種微小隱孢子蟲的檢測試劑盒，所述試劑盒包括權利要求1至9任一項所述檢測方法中的含有生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體包被的鏈霉素磁珠的反應體系、微小隱孢子蟲的特異上游引物、特異下游引物和Taqman熒光定量探針引物，優選地，所述試劑盒還包括微小隱孢子蟲重組質粒標準品；再優選地，所述微小隱孢子蟲重組質粒標準品的濃度梯度為IO4-1O8拷貝/ μ I。
11.根據權利要求10所述的微小隱孢子蟲的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的濃度為2-50ng/ml，所述的鏈霉素磁珠的終濃度為20 μ g/ml，優選地，所述生物素化微小隱孢子蟲Cp23單克隆抗體的濃度為20ng/ml ;更優選地，所述反應體系還包括免疫磁珠分離純化體系緩沖液；再優選地，所述試劑盒還包括突光定量PCR反 應液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898203SQ201210585063
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】何宏軒, 高姍姍, 王承民, 羅靜 申請人:中國科學院動物研究所