Hat半固體篩選培養基以及雜交瘤細胞的篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種HAT半固體篩選培養基，每100mL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成：2mL的50×HAT貯存液、20mL的胎牛血清、1mL的100×青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、1mL的100×B細胞刺激因子溶液、2mL的50×雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、1mL的100×異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基。本發明還公開了一種使用HAT半固體篩選培養基的雜交瘤細胞的篩選方法，融合細胞在半固體培養基上呈集落生長，彼此分離，每個克隆由單個細胞形成，避免了不分泌抗體的雜交瘤生長很快而影響分泌抗體的雜交瘤細胞的生長，與傳統的有限稀釋法相比，篩選效率較高。
【專利說明】HAT半固體篩選培養基以及雜交瘤細胞的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學領域，特別是涉及一種HAT半固體篩選培養基以及使用HAT半固體篩選培養基的雜交瘤細胞的篩選方法。
【背景技術】
[0002]單克隆抗體技術的基本原理是將分泌抗體但不能長期培養的B細胞與能在體外長期培養的骨髓瘤細胞進行雜交，篩選得到的雜交瘤細胞既能分泌抗體又有骨髓瘤細胞無限增殖的特性，由一個雜交瘤細胞繁殖、分泌的抗體稱為單克隆抗體，它只針對一個抗原表位。細胞融合時，B細胞是從抗原免疫的動物的脾臟中分離出來的，骨髓瘤細胞是經過誘變和篩選得到的缺陷型，其本身不能分泌抗體；并且是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型，不能在含有次黃嘌呤(hypoxanthine H)、氨基蝶呤(aminopterin, A)、胸腺嘧唳(thymidine T)的篩選培養基(HAT)中存活。在融合后的細胞群中，未融合的脾細胞和相互融合的脾細胞，不能連續培養，只能在培養基中存活幾天，而未融合的骨髓瘤細胞和融合的骨髓瘤細胞因缺乏HGPRT不能在HAT培養基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中存活下來，所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。
[0003]一個脾臟中，能分泌抗體的細胞占的比例很少，90%以上的細胞是不能分泌抗體的。即使進行了人工免疫，能分泌出針對人工免疫的抗原的抗體的細胞比例也是很低的，并且兩個細胞的融合是隨機的，因此，盡管一個成功免疫的脾臟可達到2X IO8個細胞以上，但細胞融合后能得到目 標雜交瘤的數量也是很有限的，如何篩選克隆出這些能分泌目的抗體的雜交瘤細胞是一個非常關鍵的問題。
[0004]雜交瘤細胞的克隆化是單克隆抗體制備過程中工作量最大的部分，實驗室傳統的克隆化方法為有限稀釋法，該法需要多次進行有限稀釋獲得單克隆雜交瘤，耗時較長，在克隆化之前一些不分泌抗體的雜交瘤往往生長很快，影響分泌抗體的雜交瘤細胞的生長易導致陽性克隆丟失，篩選效率較低。
【發明內容】
[0005]基于此，有必要提供一種篩選效率較高的HAT半固體篩選培養基以及雜交瘤細胞的篩選方法。
[0006]一種HAT半固體篩選培養基，每IOOmL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成:2mL的50\撤1'貯存液、201^的胎牛血清、11^的100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、ImL的100XB細胞刺激因子溶液、2mL的50X雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、ImL的100X異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基；
[0007]所述甲基纖維素半固體培養基由按照體積比為1:1的2XDMEM培養基和4%的甲基纖維溶液充分混勻得到。
[0008]在一個實施例中，所述2 X DMEM培養基通過如下操作制備:將13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氫鈉加入500mL的超純水充分攪拌溶解，接著調節pH值為7.0-7.2，最后通過0.22 um濾膜過濾除菌，得到所述2 X DMEM培養基。
[0009]在一個實施例中，所述4%的甲基纖維溶液通過如下操作制備:稱取20g甲基纖維素溶于500mL超純水中，4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒，最后高壓滅菌得到所述4%的甲基纖維溶液。
[0010]一種雜交瘤細胞的篩選方法，包括如下步驟:
[0011]步驟一、按照體積比為1:1將2XDMEM培養基和4%的甲基纖維溶液充分混勻，得到甲基纖維素半固體培養基；
[0012]步驟二、配制HAT半固體篩選培養基,每IOOmL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成:2mL的50XHAT貯存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、ImL的100XB細胞刺激因子溶液、2mL的50X雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、ImL的100X異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基；
[0013]步驟三、將淋巴細胞和小鼠骨髓瘤進行細胞融合后,用HAT液體培養基將融合后的細胞重懸得到細胞懸液，將所述細胞懸液加入到預熱至35°C~38°C的步驟二得到的HAT半固體篩選培養基中混勻，37°C靜置并排除氣泡后倒入平皿中，置于37°C、5%C02的孵育箱培養；
[0014]步驟四、步驟三得到的細胞在37°C、5%C02的孵育箱培養10-14天，待所述平皿中長出肉眼可見克隆集落時，在熒光顯微鏡下對周圍具有強熒光信號的陽性細胞團分別進行標記，然后在顯微鏡下將已標記的陽性克隆挑出，所述陽性克隆即為所述雜交瘤細胞。
[0015]在一個實施例中，步驟一中，所述2 XDMEM培養基通過如下操作制備:將13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氫鈉加入500mL的超純水充分攪拌溶解，接著調節pH值為7.0-7.2，最后通過0.22 μ m濾膜過濾除菌，得到所述2 X DMEM培養基。
[0016]在一個實施例中，步驟一中，所述4%的甲基纖維溶液通過如下操作制備:稱取20g甲基纖維素溶于500mL超純水中，4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒，最后高壓滅菌得到所述4%的甲基纖維溶液。
[0017]在一個實施例中，步驟二中所述的抗原為可偶聯異硫氰酸素的可溶性蛋白。
[0018]在一個實施例中，步驟三中所述的HAT液體培養基的由如下成分組成=IXDMEM培養基、20%的胎牛血清和1XHAT。
[0019]在一個實施例中，步驟四還包括在所述將已標記的陽性克隆挑出后，對所述陽性克隆進行確認的步驟，包括如下操作:將挑出的陽性克隆放入含有HT液體培養基的96孔板中進行培養，每孔一個克隆，待細胞長滿孔底后，取上清對陽性克隆進行確認。
[0020]在一個實施例中，所述對陽性克隆進行確認的操作中，采用ELISA的方法對陽性克隆進行確認。
[0021]這種雜交瘤細胞的篩選方法使用HAT半固體篩選培養基，融合細胞在半固體培養基上呈集落生長，彼此分離，每個克隆由單個細胞形成，避免了不分泌抗體的雜交瘤生長很快而影響分泌抗體的雜交瘤細胞的生長，與傳統的有限稀釋法相比，篩選效率較高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為一實施方式的雜交瘤細胞的篩選方法的流程圖。【具體實施方式】
[0023]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
[0024]一實施方式的HAT 半固體篩選培養基，其中，每IOOmL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成:2mL的50XHAT貯存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、ImL的100XB細胞刺激因子溶液、2mL的50X雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、ImL的100X異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基。
[0025]甲基纖維素半固體培養基由按照體積比為1:1的2XDMEM培養基和4%的甲基纖維溶液充分混勻得到。
[0026]2XDMEM培養基通過如下操作制備:將13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氫鈉加入500mL的超純水充分攪拌溶解，接著用鹽酸或氫氧化鈉調節pH值為7.0-7.2，最后通過0.22 um濾膜過濾除菌，得到所述2 XDMEM培養基。
[0027]4%的甲基纖維溶液通過如下操作制備:稱取20g甲基纖維素溶于500mL超純水中，4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒，最后高壓滅菌得到所述4%的甲基纖維溶液。
[0028]一實施方式的雜交瘤細胞的篩選方法，如圖1所示，步驟如下。
[0029]S10、按照體積比為1:1將2XDMEM培養基和4%的甲基纖維溶液充分混勻，得到甲
基纖維素半固體培養基。
[0030]2XDMEM培養基通過如下操作制備:將13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氫鈉加入500mL的超純水充分攪拌溶解，接著用鹽酸或氫氧化鈉調節pH值為7.0-7.2，最后通過
0.22 μ m濾膜過濾除菌，得到2 XDMEM培養基。
[0031]DMEM粉末購自Gibco公司，貨號為12800-017。
[0032]4%的甲基纖維溶液通過如下操作制備:稱取20g甲基纖維素溶于500mL超純水中，4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒，最后高壓滅菌得到4%的甲基纖維溶液。
[0033]甲基纖維素購自sigma公司，貨號為M0512。
[0034]4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒的操作可以為:在4°C冰箱中用磁力攪拌器上攪拌過夜至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒。
[0035]高壓滅菌的操作可以為:121°C高壓滅菌30min。滅菌4%的甲基纖維溶液可以在4°C下保存。
[0036]S20、配制HAT半固體篩選培養基，每IOOmL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成:2mL的50XHAT貯存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、ImL的100XB細胞刺激因子溶液、2mL的50X雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、ImL的100X異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基。
[0037]50 X HAT貯存液通過如下操作制備:將I瓶HAT粉末加入IOmL無菌的PBS溶液中，溶解后得到50XHAT貯存液。
[0038]50XHAT貯存液由如下成分組成:5mM次黃嘌呤、20 μ M氨基蝶呤和800 μ M胸腺嘧啶核苷。
[0039]HAT粉末購自Sigma公司，貨號為H0262。
[0040]無菌的PBS溶液購自Gibco公司，貨號為C20012500BT。
[0041]胎牛血清購自Hyclone公司，貨號為SV30087。
[0042]100XB 細胞刺激因子(B cell activating factor，BAFF)購自 R&D 公司，貨號為2149-BF-010/CF,其工作濃度為 200~100ng/L。
[0043]IOOX異硫氰酸素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的抗原溶液的工作濃度為廣10μ g/mL,可以在-20°C下保存。
[0044]異硫氰酸素標記的抗原可以根據具體需要的抗原，從市場購買或自行制備。
[0045]抗原可以為可偶聯異硫氰酸素的可溶性蛋白。
[0046]異硫氰酸素標記的抗原，通過抗原抗體凝集反應可直接對分泌特異抗體的細胞克隆進行篩選。
[0047]100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液購自Hyclone公司，貨號為SV30010。
[0048]5O X 雜交瘤細胞融合克隆因子(Hybridoma Fusion and CloningSupplement, HFCS)溶液購自 Roche 公司，貨號為 11363735001。
[0049]S30、將淋巴細胞和小鼠骨髓瘤進行細胞融合后,用HAT液體培養基將融合后的細胞重懸得到細胞懸液，將細胞懸液加入到預熱至35°C~38°C的S20得到的HAT半固體篩選培養基中混勻，37°C靜置并排除氣泡后倒入平皿中，置于37°C、5%C02的孵育箱培養。
[0050]HAT液體培養基的由如下成分組成:1 XDMEM培養基、20%的胎牛血清和I XHAT。
[0051]平皿可以選擇直徑為3.5cm的平皿，每個平皿分裝2mL培養基。
[0052]S40、S30得到的細胞在37°C、5%C02的孵育箱培養10-?4天，待平皿中長出肉眼可見克隆集落時，在熒光顯微鏡下對周圍具有強熒光信號的陽性細胞團分別進行標記，然后在顯微鏡下將已標記的陽性克隆挑出，所述陽性克隆即為所述雜交瘤細胞。
[0053]將已標記的陽性克隆挑出的操作可以選擇無菌的微量移液器完成。
[0054]S40還包括對陽性克隆進行確認的步驟，包括如下操作:將挑出的陽性克隆放入含有HT液體培養基的96孔板中進行培養，每孔一個克隆，待細胞長滿孔底后，對陽性克隆進行確認。
[0055]HT液體培養基由如下成分組成:1 XDMEM培養基、20%的胎牛血清和I ΧΗΤ。
[0056]HT購自sigma公司，貨號為Η0137。
[0057]可以取上清用ELISA等方法對陽性克隆進行確認，選擇確認后的陽性克隆進行擴大培養，凍存和鑒定分析。
[0058]這種雜交瘤細胞的篩選方法，融合細胞在半固體培養基上呈集落生長，彼此分離，每個克隆由單個細胞形成，因此不需要反復克隆即能獲得純一的抗體。培養基中加入了熒光標記抗原，一步實現雜交瘤細胞的克隆和陽性篩選，工作量小、耗時短；可根據熒光強度判斷細胞分泌抗體的能力，從而得到高分泌抗體的細胞株；半固體培養基中加入了 B細胞刺激因子和雜交瘤細胞融合克隆因子，保證了雜交瘤細胞的營養需要，避免了使用飼養細胞的繁瑣操作，大大降低了污染危險。
[0059]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因 此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.一種HAT半固體篩選培養基,其特征在于,每IOOmL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成:2mL的50XHAT貯存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、ImL的100XB細胞刺激因子溶液、2mL的50X雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、ImL的100X異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基； 所述甲基纖維素半固體培養基由按照體積比為1:1的2XDMEM培養基和4%的甲基纖維溶液充分混勻得到。
2.根據權利要求1所述的HAT半固體篩選培養基，其特征在于，所述2XDMEM培養基通過如下操作制備:將13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氫鈉加入500mL的超純水充分攪拌溶解，接著調節PH值為7.0-7.2，最后通過0.22 μ m濾膜過濾除菌，得到所述2 X DMEM培養基。
3.根據權利要求1所述的HAT半固體篩選培養基，其特征在于，所述4%的甲基纖維溶液通過如下操作制備:稱取20g甲基纖維素溶于500mL超純水中，4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒，最后高壓滅菌得到所述4%的甲基纖維溶液。
4.一種雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、按照體積比為1:1將2XDMEM培養基和4%的甲基纖維溶液充分混勻，得到甲基纖維素半固體培養基； 步驟二、配制HAT半固體篩選培養基，每IOOmL所述HAT半固體篩選培養基由如下成分組成:2mL的50XHAT貯存 液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和鏈霉素的雙抗溶液、ImL的100XB細胞刺激因子溶液、2mL的50X雜交瘤細胞融合克隆因子溶液、ImL的100X異硫氰酸素標記的抗原溶液以及余量的甲基纖維素半固體培養基； 步驟三、將淋巴細胞和小鼠骨髓瘤進行細胞融合后，用HAT液體培養基將融合后的細胞重懸得到細胞懸液，將所述細胞懸液加入到預熱至35°C~38°C的步驟二得到的HAT半固體篩選培養基中混勻，37°C靜置并排除氣泡后倒入平皿中，置于37°C、5%C02的孵育箱培養; 步驟四、步驟三得到的細胞在37°C、5%C02的孵育箱培養10-14天，待所述平皿中長出肉眼可見克隆集落時，在熒光顯微鏡下對周圍具有強熒光信號的陽性細胞團分別進行標記，然后在顯微鏡下將已標記的陽性克隆挑出，所述陽性克隆即為所述雜交瘤細胞。
5.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，步驟一中，所述2X DMEM培養基通過如下操作制備:將13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氫鈉加入500mL的超純水充分攪拌溶解，接著調節PH值為7.0-7.2，最后通過0.22 μ m濾膜過濾除菌，得到所述2XDMHM培養基。
6.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，步驟一中，所述4%的甲基纖維溶液通過如下操作制備:稱取20g甲基纖維素溶于500mL超純水中，4°C下攪拌至溶液粘稠均一且沒有白色顆粒，最后高壓滅菌得到所述4%的甲基纖維溶液。
7.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，步驟二中所述的抗原為可偶聯異硫氰酸素的可溶性蛋白。
8.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，步驟三中所述的HAT液體培養基的由如下成分組成:I XDMEM培養基、20%的胎牛血清和1XHAT。
9.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，步驟四還包括在所述將已標記的陽性克隆挑出后，對所述陽性克隆進行確認的步驟，包括如下操作:將挑出的陽性克隆放入含有HT液體培養基的96孔板中進行培養，每孔一個克隆，待細胞長滿孔底后，取上清對陽性克隆進行確認。
10.根據權利要求9所述的雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，所述對陽性克隆進行確認的操作中，采用ELIS A的方法對陽性克隆進行確認。
【文檔編號】C12N5/20GK103898060SQ201210572759
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】萬曉春, 王彩霞, 向軍儉 申請人:深圳先進技術研究院