一種簡便的細菌基因敲除的方法

一種簡便的細菌基因敲除的方法
【專利摘要】本發明提供了一種細菌基因敲除的方法，包括以下步驟：pSIM19轉化E.coliO56，得到含pSIM19的重組E.coliO56；制備含pSIM19的E.coliO56電感受態細胞；以質粒pKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態細胞重組菌E.coliO56/pSIM19中加入帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養基，培養，篩選得到目的基因已經被消除的陽性重組子。本方法非常簡便，省去了誘導劑使用濃度摸索等繁瑣的環節。
【專利說明】一種簡便的細菌基因敲除的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體的是涉及一種簡便的細菌基因敲除的方法。
【背景技術】
[0002]同源重組作為體內基因工程的新方法使DNA修飾變得更容易、更有效，它是功能基因組分析的高效方法，可以在沒有限制性內切酶和DNA連接酶的情況下實現DNA修飾。
[0003]傳統同源重組方法是利用RecA重組系統，但是以RecA同源重組為基礎的基因敲除有很大的不足，如需要較長的靶基因同源臂，重組率很低，很難獲得所需要的重組子等。1998年，Murphy首次報道了利用λ噬菌體Red重組系統在大腸桿菌染色體上進行基因替換的方法，將λ噬菌體的重組功能基因exo，bet, gam在多拷貝質粒上表達，用于野生型E.coli宿主菌的基因替換。近年來，Red重組以其較短的同源臂和較高的重組效率等優點廣泛用于大腸桿菌的基因修飾中。Red同源重組由λ曬菌體的exo, bet, gam 3個基因組成，分別編碼Exo、Beta、Gam 3種蛋白質。Exo作為雙鏈核酸外切酶，可以結合在雙鏈DNA.的末端，從5'向3'降解DNA單鏈，產生3'末端單鏈懸突(3' single strand DNAoverhangs)。Beta作為單鏈退火蛋白，結合在由核酸外切酶(Exo)外切產生的3'末端單鏈懸突上，促進DNA互補鏈的退火。Gam蛋白作為Exo、Beta的輔助蛋白，可與RecB⑶核酸外切酶結合，抑制RecBCD核酸外切酶活性，抑制體內的外源DNA的降解。RecBCD是高度ATP依賴的雙鏈DNA核酸外切酶，在大腸桿菌中用于基因的同源重組和DNA復制叉的修復。研究表明，Gam蛋白對于反應進行中的RecBCD雙鏈DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事實上，Gam蛋白并不能抑制一個正在進行的反應，而是在ATP的存在下分離連在雙鏈DNA末端的 RecBCD。
[0004]對于敲除細菌基因的Red重組系統共需要三種質粒:一種質粒是表達重組酶相關的Exo、Beta、Gam這3種蛋白質的輔助質粒；另一種質粒含有兩側帶有翻轉酶結合位點(flipase recognition target, FRT)的抗性基因,用作PCR模板；最后一種質粒是抗性基因消除質粒，其含有的重組酶能特異識別FRT位點，從而消除染色體上同源重組的抗性基因。對于整個基因敲除過程中，最重要的是控制同源所需的三個蛋白的表達。表達這三個蛋白的質粒如pKD46、pRedET。這兩個質粒均含有溫度敏感型復制起始點oriRlOl，在37°C培養時能夠正常復制，而高于37°C時會自動丟失。此外，pKD46上還含有ParaB啟動子調控的exo、bet、gam基因，它們通過L-阿拉伯糖誘導表達，并攜帶氨芐青霉素抗性基因作為篩選標記。而PRedET上調控exo、bet、gam基因的表達的啟動子則是Pbad啟動子；同樣是通過L-阿拉伯糖誘導表達；但是Pbad啟動子比ParaB啟動子的調控方式更嚴謹，Pbad啟動子同時還受araC基因產物的正調控和負調控，araC作為轉錄阻遏物可以與L-阿拉伯糖形成復合物，從而啟動轉錄。
[0005]對于敲除細菌基因組中的靶基因目前常選用Red重組系統。不同的質粒上λ噬菌體的重組功能基因exo，bet, gam的表達調控方式不一樣。對于選用由L-阿拉伯糖誘導重組功能蛋白表達的質粒，敲除不同基因則需要摸索L-阿拉伯糖的誘導濃度，此過程耗時耗力。

【發明內容】

[0006]基于此，本發明提供一種簡便的細菌基因敲除的方法。
[0007]實現上述目的的技術方案如下。
[0008]一種細菌基因敲除的方法，包括以下步驟:(l)pSM19轉化E.coli 056得到含PSIM19 的重組 E.coli 056 ；
[0009](3)制備含pSM19的E.coli 056電感受態細胞:挑取重組E.coli 056的陽性克隆，培養，菌體濃度0D_為0.4-0.5時放入42°C水浴搖床中，震蕩搖勻后置于冰上冷卻后，離心后，用預冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預冷的無菌的EP管中；然后用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體四次，最后每管加入無菌水，制備到電感受態細胞E.coli056/pS頂19 ；
[0010](3)以質粒PKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態細胞重組菌E.coli056/pSIM19中加入所述帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養基，370C，培養1.5 ±0.2h后，離心后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素抗性平板，培養，長出單菌落，將單菌落劃線于含50±2g/mL的卡那霉素抗性平板中，長出較濃菌苔，篩選得到目的基因已經被消除的陽性重組子。
[0011]在其中一個實施例中，所述PSM19轉化E.coli 056的步驟為:將質粒加入到E.coli 056感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴；42°C水浴熱激90s，迅速轉移至冰上，繼續冰浴2 ± Imin ;無菌條件下，加入LB培養基，37°C，100 ± IOrpm慢搖，恢復培養I ±0.2h ;離心培養物后取適量培養物涂布含100±2g/mL Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養基吸收后，將平板倒置，37±2°C恒溫培養，12-16h，得到含pSM19的重組E.coli 056。
[0012]在其中一個實施例中，步驟(2)中用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體時，每次均在12000±20rpm，4±l°C的條件下離心1±0.1min以除去超純水。
[0013]在其中一個實施例中，步驟(3)中PCR擴增帶有目的基因WfaQ同源臂的kana基因片段的擴增引物為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
[0014]在其中一個實施例中，所述無菌超純水為MiliQ超純水。
[0015]對于敲除細菌基因組中的靶基因目前常選用Red重組系統。不同的質粒上λ噬菌體的重組功能基因exo，bet, gam的表達調控方式不一樣。對于選用由L-阿拉伯糖誘導重組功能蛋白表達的質粒，敲除不同基因則需要摸索L-阿拉伯糖的誘導濃度，此過程耗時耗力。本發明選用由溫度誘導重組功能蛋白表達的溫度敏感型質粒PSIM19，從而省去了誘導劑使用濃度摸索這一繁瑣的環節。同時，本發明選用MiliQ超純水作為線性DNA電轉緩沖液，洗滌菌體時12000rpm離心lmin，洗滌4_5次即可，相比用10%甘油作為電轉緩沖液節省了很多時間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為pSM19質粒圖譜；
[0017]圖2為圖1菌落PCR驗證陽性重組子056/AwfaQ/kana;其中，1:以野生型E.coli056模板；3-11和13:以陽性重組子056/Δ wfaQ/kana為模板；2和12:以假陽性重組子為模板。
【具體實施方式】
[0018]為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例結合附圖詳細說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。
[0019]本發明選用的質粒pSIM19由Donald L Court實驗室饋贈，該質粒可從許多實驗室無償獲得。參見文獻:Sharan K S, et al.Recombineering:ahomologousrecombination-based method of genetic engineering.Nat Pr0.2009(4).,如Donald LCourt (conrtQmai 1.ncifcrf.gov)。本領域的技術人員也可以根據現有技術，根據圖譜自行構建得到。其圖譜請見圖1。
[0020]實施例一:用RED重組系統敲除E.coli 056中的基因wfaQ。[0021]一、pSM19 轉化 Ε.coli 056
[0022]①將2L質粒加入到IOOL E.coli 056感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴30min ；
[0023]②42°C水浴熱激90s，迅速轉移至冰上，繼續冰浴2min ；
[0024]③無菌條件下，加入900L LB培養基，37°C，IOOrpm慢搖，恢復培養Ih ；
[0025]④5000rpm離心培養物，5min后取適量培養物涂布含100g/mL Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養基吸收后，將平板倒置，37°C恒溫培養12-16h，得到含pSM19的重組 E.coli 056。
[0026]二、制備含pSM19的E.coli 056電感受態細胞
[0027]挑取重組E.coli 056(含有溫度敏感性質粒pSM19)的陽性克隆，30°C，200rpm過夜培養。次日，取I %過夜培養物轉接50mL SOB液體培養基(該培養基的配方為:將2g胰蛋白胨，0.5g酵母粉，0.0585g氯化鈉，0.0186g氯化鉀溶解到純水中，混勻后定容至IOOmL,121 °C濕熱滅菌20min備用。)，同時加入500L濃度為IM的無菌MgCl2，待菌體濃度OD6tltl為0.4-0.5 (大約生長2h)后將其放入42°C水浴搖床中，200rpm震蕩15min，然后立刻將搖瓶置于冰上,5-10min后開始制作電感受態細胞。4°C, 12000rpm離心7min后,用2mL預冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預冷的無菌的1.5mLEP管中。然后用預冷的無菌超純水(MiliQ超純水)水洗管中菌體四次(每次均在12000rpm，4°C的條件下離心Imin以除去超純水)，最后每管加入無菌水至終體積為50-60L,由此制備的電感受態細胞(命名為E.coli056/pSIM19)可以于 _80°C存放一周。
[0028]三、帶有wfaQ同源臂的抗性基因電轉進上述電感受態細胞E.coli056/pSIM19中
[0029]先以質粒pKD4(商業化質粒)為模版，以引物056-wfaQ-k-F/wfaQ-k-R為敲除引物(序列見表1)通過聚合酶鏈式反應PCR的方法(PCR反應體系請參考fermentas貨號S#EP0502(Pfu DNA polymerase)給出的反應體系；本實驗擴增條件為98°C預變性2min，98°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸1.5min，共30個循環；最后72°C延伸5min。)擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段。向電感受態細胞重組菌E.coli 056/pSIM19中加入40L濃度為200-300ng/L的基因片段(即上述帶有目的基因wfaQ (GeneBank號為:DQ220293.1)同源臂的kana基因片段(卡那霉素核苷酸轉移酶基因，其GeneBank號為:NC_002952))，混勻后轉移至預冷的無菌的厚度為2mm的電轉杯中，2.5kV高壓電擊完成后立即加入ImL SOC液體培養基(即加入了終濃度為20mM葡萄糖的SOB液體培養基)，37°C, IOOrpm恢復培養1.5h后，6000rpm離心5min后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50g/mL的卡那霉素抗性平板(含終濃度為50g/mL卡那霉素的瓊脂糖固體培養基)。將平板放于37°C培養箱中，約16-20h長出單菌落，將單菌落劃線于含50g/mL的卡那霉素抗性平板中，12h后長出較濃菌苔。通過菌落PCR(PCR反應體系請參考Transgene貨號為APlll (EasyTaq DNA polymerase)給出的反應體系；本實驗擴增條件為94°C預變性4min,94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環；最后72°C延伸5min。)鑒定的方法判斷目的基因的敲除情況，瓊脂糖凝膠電泳圖請見圖2。
[0030]在E.coli 056基因組中，表1所示的敲除引物056-wfaQ-k-F/wfaQ-k-R之間相距1149bp,檢測引物wfaQ-t-F/wfaQ-t-R(序列見表1)之間相距1250bp,因此用檢測引物進行菌落PCR驗證O 56/ Δ wfaQ/kana陽性重組子時，以野生型056 (陰性對照)菌液為模板的PCR產物大小應為1250bp ;而陽性重組子056/Λ wfaQ/kana的敲除引物之間由于重組了大小為1496bp的kana抗性基因，因此陽性重組子的檢測引物之間應相距1760bp。所以，以檢測引物wfaQ-t-F/wfaQ-t-R為引物，以E.coli 056為陰性對照，通過菌落PCR驗證陽性重組子056/Awfa0/kana，電泳結果由圖2可知，編號為3_11和13為陽性重組子，即E.coli056中的目的基因wfaQ已經被消除。
[0031]表1:擴增引物
[0032]
【權利要求】
1.一種細菌基因敲除的方法，其特征是，包括以下步驟:
(1)pSIM19轉化 E.coli056，得到含 pSIM19 的重組 E.coli056 ； (2)制備含pSM19的E.coli056電感受態細胞:挑取重組E.coli 056的陽性克隆，培養，菌體濃度OD6tltl為0.4-0.5時放入42°C水浴搖床中，震蕩搖勻后置于冰上冷卻后，離心后，用預冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預冷的無菌的EP管中；然后用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體三至五次，最后每管加入無菌水，制備到電感受態細胞E.coli056/PSIM19 ； (3)以質粒pKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因WfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態細胞重組菌E.coli 056/pSIM19中加入所述帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養基，37 ±0.5°C，培養1.5±0.2h后，離心后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板，培養，長出單菌落，將單菌落劃線于含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板中，長出較濃菌苔，篩選得到目的基因已經被消除的陽性重組子。
2.根據權利要求1所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，所述PSIM19轉化E.coli056的步驟為:將質粒加入到E.coli056感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴；42°C水浴熱激90±2s，迅速轉移至冰上，繼續冰浴2±lmin ;無菌條件下，加入LB培養基，37±0.5 °C，100± IOrpm慢搖，恢復培養1±0.2h ;離心培養物后取適量培養物涂布含100±2g/mL Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養基吸收后，將平板倒置，37±0.5°C恒溫培養，12-16h，得到含 pSM19 的重組 E.coliO 56。
3.根據權利要求1所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，步驟(2)中用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體時，每次在12000±20rpm，4±l°C的條件下離心1±0.1min以除去超純水。
4.根據權利要求1-3任一項所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，所述無菌超純水是MiliQ超純水。
5.根據權利要求1-3任一項所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，步驟(3)中PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段的擴增引物為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2。
6.根據權利要求1-5任一項所述的細菌基因敲除的方法所制備得到的目的基因wfaQ被敲除的陽性重組子E.coli056。
【文檔編號】C12N1/21GK103898143SQ201210572241
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】萬曉春, 黨利君, 金言 申請人:深圳先進技術研究院