專利名稱：一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，特別涉及解除含有鐵離子的中水對酶解木質纖維素抑制的方法，屬于纖維素利用技術領域。
背景技術：
隨著不可再生的石化原料的日益枯竭，以及對環境的危害，特別是燃燒排放的溫室氣體導致的全球變暖問題越來越受到人類的關注。以可再生的資源為原料，經過對環境無危害的過程來替代石化原料，已成為全世界都在積極探索的方向。目前，以木質纖維素生物質，例如，玉米秸桿(玉米芯)、麥秸、稻殼、谷物、蘆葦、木材等原料進行可循環能源開發便成為了未來生物能源的發展方向之一，受到了全世界的普遍關注。在可在生能源產業化過 程中，纖維素酶的酶解過程在C循環和能量轉換中發揮了非常大的作用。然而，纖維素酶酶解過程所面臨的主要問題是酶解效率低，特別是隨著國家工業化步伐的加快，環境污染問題越來越嚴重，特別是地下水的重金屬污染。這就造成了在實際工業化中所用的中水或者原水是含有各種重金屬離子的水。而纖維素酶的活性和木質纖維素都很容易受到重金屬離子的干擾，導致纖維素酶在木質纖維素水解過程中不能發揮最大作用，或者木質纖維素原料受到中水或原水中金屬離子作用導致酶解效率降低。中國專利文獻CN101092447A (申請號20061009013L 9)公開了用如下方法制備的來源于植物秸桿料的纖維素酶解助劑將植物秸桿粉料進行水清洗、過濾得細胞壁濾渣；按配比加入含20-50MM抗壞血酸VC、質量百分比O. 1-0. 5%巰基乙醇、1-5MM PMSF、5_10MMEDTA的O. 1-0. 5M0L/L NAOH溶液；30-70°C溫度下保溫10-30小時，并每隔3-5小時添加一次PMSF至終濃度為1-5MM進行提取；提取完成后，離心并收集上清液；將上清液用鹽酸調PH，并加入酒精充分搖勻，經放置再離心獲沉淀物，再進行低溫真空干燥，得占秸桿細胞壁干重10%的纖維素酶解助劑。該專利文獻并未涉及到中水或原水水質對纖維素底物的影響或者對纖維素酶酶解效果的影響。中國專利文獻CN101899488A (申請號201010228581. 6)公開了一種木質纖維素酶水解與膜分離單元耦合生產高濃度還原糖的方法。該方法利用微濾和超濾分離酶解液中的木質纖維素底物、水解酶和酶解產物還原糖，實現底物和酶的反復使用，并通過納濾濃縮酶解液，制得高濃度的還原糖溶液。雖然該方法實現了纖維素水解生產還原糖的工業化，但耗水量較大，且對水質的要求較高，工業處理后的中水或原水通過上述方法無法獲得還原糖，并沒有涉及到中水對木質纖維素酶解的抑制作用。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法術語說明本發明所述中水是指遭受金屬重度污染的工業用水經處理后的再生水，水質符合GB/TT18920-2002標準,其中鐵離子濃度為3 10mM。本發明的技術方案如下一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下(I)將待降解木質纖維素原料在40 50°C條件下于中水中浸泡20 28h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為2 IOmM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液中，在40 50°C條件下浸泡20 28h，然后經水或緩沖液沖洗至pH到4. 5 5. 5，烘干制得木質纖維素原料；
(3)按糖化體系重量百分比3 8%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為20 40mg/g,在40 60°C條件下進行糖化,糖化80 IOOh,制得水解液。根據本發明優選的，所述步驟(I)中待降解木質纖維素原料為微晶纖維素、玉米秸桿、麥稻、稻殼、谷物、蘆華、木材、麩皮、木糖洛和/或脫木素洛。根據本發明優選的，所述步驟(2)中水為自來水或純化水。根據本發明優選的，所述步驟(2)中緩沖液為由自來水或純化水或由其配制的濃度O. ΟΓΟ. 05Μ, pH4. 5^5. 5的檸檬酸鹽、磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液。根據本發明優選的，所述步驟(3)中木質纖維素原料添加量為糖化體系重量百分比的5%。所述步驟(3)中纖維素酶酶液可采用市售纖維素酶按比例配制，優選購自寧夏夏盛實業集團有限公司的纖維素酶，該纖維素酶源于斜臥青霉(Penicillum decumbens)。有益效果經研究發現，中水中Fe離子對水解木質纖維素的抑制作用是通過對底物還原端的氧化和與酶結合兩方面，目前常用的還原劑Vc或金屬螯合劑EDTA只能從一方面解除Fe離子對水解木質纖維素的抑制作用；本發明通過將經中水預處理后的木質纖維素經二硫蘇糖醇(DTT)浸泡，二硫蘇糖醇既可以消除Fe離子對底物的氧化作用，又可以消除Fe離子對酶活的影響，大幅提高了酶的用量，降低了工業化成本，從而為利用中水水解木質纖維素奠定了基礎。
圖1是微晶纖維在不同處理條件下水解實驗柱狀結果比對圖。圖2是木糖渣在不同處理條件下與經過水洗后烘干水解實驗柱狀結果對比圖。圖3是木糖渣添加DTT后不經過處理后直接水解柱狀結果比較圖。
具體實施例方式下面通過具體實例對本發明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。原料來源微晶纖維素購自國藥集團化學試劑有限公司；木糖渣來自山東龍力生物有限公司。
二硫蘇糖醇購自北京鼎國生物技術有限責任公司。實施例1 3中纖維素酶酶液按如下方法制備以購自寧夏夏盛實業集團有限公司的纖維素酶，該纖維素酶是斜臥青霉經發酵后獲得，糖化時酶加量為20mg-40mg/g。實施例4中纖維素酶酶液是將購自于棗莊市杰諾生物酶有限公司的酸性纖維素酶溶于醋酸鈉緩沖液里，離心去除雜質后得到的。上述酸性纖維素酶的作用pH范圍為4. 5 6. 2，最適作用pH4. 8 ;溫度范圍50 65°C，最適作用溫度60°C。實施例1中的中水是符合GB/TT18920-2002標準的處理水，其中鐵離子濃度在3mM0實施例2中的中水是符合GB/TT18920-2002標準的處理水，其中鐵離子濃度在 5mM。實施例3、4中的中水是符合GB/TT18920-2002標準的處理水，其中鐵離子濃度在10mM。實施例1一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下(I)將微晶纖維素在45°C條件下于中水中浸泡24h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為6mM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液中，在45°C條件下浸泡20h，然后經醋酸鈉緩沖液沖洗至pH4. 8，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比3%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在45°C條件下進行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為11. lg/L。實施例2一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下( I)將木糖渣在40°C條件下于中水中浸泡20h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為2mM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液中，在50°C條件下浸泡28h，然后經自來水沖洗至pH到5. 0，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比5%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為20mg/g，在40°C條件下進行糖化，糖化72h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為8. lg/L。實施例3—種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下(I)將木糖渣在45°C條件下于中水中浸泡26h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為6mM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液中，在45°C條件下浸泡24h，然后經自來水沖洗至pH到4. 8，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比5%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在60°C條件下進行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為9. 8g/L。實施例4
一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下(I)將木糖渣在50°C條件下于中水中浸泡22h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為IOmM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液中，在40°C條件下浸泡24h，然后經檸檬酸緩沖液沖洗至pH到4. 5，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比8%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為30mg/g，在50°C條件下進行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為10. 4g/L。
對比例I將微晶纖維素在45°C條件下于自來水中浸泡24h，然后按糖化體系重量百分比3%的比例浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在45°C條件下進行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為11. 9g/L。對比例2處理步驟如下(I)將微晶纖維素在45°C條件下于中水中浸泡24h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素經醋酸鈉緩沖液沖洗至pH4. 8，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比3%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在45°C條件下進行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為9. 4g/L。對比例3處理步驟如下(I)將微晶纖維在45°C條件下于自來水中浸泡24h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素添加ImM DTT40°C浸泡20h，烘干制得木質纖維素原料。(3)按糖化體系重量百分比5%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在45°C條件下進行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為12. lg/L。對比例4處理步驟如下(I)將微晶纖維素在45°C條件下于中水中浸泡24h，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為6mM的Vc溶液中，在45°C條件下浸泡20h，然后經醋酸鈉緩沖液沖洗至pH4. 8，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比5%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在45°C條件下進行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為9. Og/L。對比例5處理步驟如下
(I)將木糖渣用自來水洗凈至pH5. O后烘干，制得預處理木質纖維素；(2)按糖化體系重量百分比5%的比例將步驟(I)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為40mg/g，在45°C條件下進行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為7. 2g/L。對比例6處理步驟如下(I)將木糖渣在50°C用自來水洗凈至pH5. O后烘干，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為6mM的二硫蘇糖醇(DTT)溶 液中，在40°C條件下浸泡24h，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比8%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為30mg/g，在50°C條件下進行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為8. 8g/L。對比例7處理步驟如下(I)將木糖渣用自來水洗凈至pH5. O后烘干，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為6mM的Vc溶液中，在40°C條件下浸泡24h，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比8%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為30mg/g，在50°C條件下進行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為8. Og/L。對比例8處理步驟如下(I)將木糖渣用自來水洗凈至pH5. O后烘干，制得預處理木質纖維素；(2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為6mM的Vc溶液中，在40°C條件下浸泡24h，然后經自來水沖洗至pH到4. 8，烘干制得木質纖維素原料；(3)按糖化體系重量百分比8%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為30mg/g，在50°C條件下進行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC測定葡萄糖濃度，水解液中葡萄糖含量為6. 9g/L。結果分析由實施例1和對比例1、2、3、4可以看出，實施例1的水解液中葡萄糖含量為11. lg/L，對比例I的水解液中葡萄糖含量為11. 9g/L，對比例2水解液中葡萄糖含量為
9.4g/L，對比例3中的葡萄糖含量為12. lg. L，對比例4的水解液中葡萄糖含量為9. Og/L,因此，可以看出通過中水處理，可以將底物水解效率降低20%，DTT處理微晶纖維素和處理后將DTT洗凈或用低濃度DTT處理后不經過洗滌水解效率提高至中水處理前，并優于中水處理前，充分說明了 DTT對底物的還原作用，同時還有助于提高酶的水解效率而Vc組效果略差(圖1)。由實施例2 4和對比例5可以看出，實施例2 4的水解液中葡萄糖含量分別為8. lg/L、9. 8g/L、10. 4g/L，對比例5的水解液中葡萄糖含量為7. 2g/L，因此，采用DTT處理木糖渣對底物的還原作用，該方式提高水解效果為12. 5%, 36%, 44% (圖2)。
有實施例3和對比例6、7、8中水解液中葡萄糖含量為9. 8g/L，8. 8g/L，8. Og/ L, 6. 9g/L可以看出，木糖渣底物經6mM或IOmM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液浸泡后，如果不經水或緩沖液沖洗，直接采用纖維素酶處理，會較為明顯的影響纖維素酶對纖維素的降解效果，并且Vc組經過不洗與洗效果都不佳(圖3)。
權利要求
1.一種利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下 (1)將待降解木質纖維素原料在40 50°C條件下于中水中浸泡20 28h，制得預處理木質纖維素； (2)將步驟(I)制得的預處理木質纖維素浸入濃度為2 IOmM的二硫蘇糖醇溶液中，在40 50°C條件下浸泡20 28h，然后經水或緩沖液沖洗至pH到4. 5 5. 5，烘干制得木質纖維素原料； (3)按糖化體系重量百分比3 8%的比例將步驟(2)制得的木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，酶濃度為20 40mg/g,在40 60°C條件下進行糖化,糖化80 IOOh,制得水解液。
2.如權利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步驟(I)中待降解木質纖維素原料為微晶纖維素、玉米秸桿、麥秸、稻殼、谷物、蘆葦、木材、麩皮、木糖渣和/或脫木素渣。
3.如權利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步驟(2)中水為自來水或純化水。
4.如權利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步驟(2)中緩沖液為由自來水或純化水或由其配制的濃度O. 0Γ0. 05Μ，ρΗ4. 5^5. 5的檸檬酸鹽、磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液。
5.如權利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步驟(3)中木質纖維素原料添加量為糖化體系重量百分比的3 8%。
全文摘要
本發明涉及一種利用利用還原劑解除中水對酶解木質纖維素抑制的方法，步驟如下(1)將待降解木質纖維素原料在中水中浸泡，制得預處理木質纖維素；(2)將預處理木質纖維素浸入二硫蘇糖醇溶液中然后經水或緩沖液沖洗，烘干制得木質纖維素原料；(3)將木質纖維素原料浸入纖維素酶酶液中，進行糖化，制得水解液。本發明通過將經中水預處理后的木質纖維素經二硫蘇糖醇(DTT)浸泡，二硫蘇糖醇既可以消除Fe離子對底物的氧化作用，又可以消除Fe離子對酶活的影響，大幅提高了酶的用量，降低了工業化成本，從而為利用中水水解木質纖維素奠定了基礎。
文檔編號C12P19/14GK103014098SQ20121057126
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者方詡, 穆子銘, 夏蕊蕊, 王明鈺, 李玲, 肖林, 程少博, 覃樹林 申請人:山東大學, 山東龍力生物科技股份有限公司