專利名稱：一種水產遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于水產致病微生物體外診斷技術領域，具體涉及一種水產動物病原細菌遲鈍愛德華氏菌的快速藥敏檢測試劑盒。
背景技術：
近年來隨著水產養殖業的快速發展，水產養殖動物病害問題也日益突出，其中細菌性疾病已在世界范圍內對漁業經濟造成了巨大的損失。遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)是一種水產動物重要的致病菌，可以感染包括淡水與海水養殖的多種魚類，并能在短期內引起大量死亡。目前，在水產養殖生產過程中，抗生素的使用仍是解決水產養殖動物細菌性疾病的重要手段，它能在短期起到良好的治療效果，但由于抗生素在養殖動物疾病防治上的廣泛和長期使用，水產耐藥微生物種類及數量得到不斷攀升。近年來，抗藥性遲鈍愛德華氏菌菌株也陸續地被分離到，在這種情況下如果無選擇地盲目使用抗生素，不但得不到理想的治療效果，反應會使得菌株的耐藥性進一步加劇，從而給水產養殖業甚至人類生命健康安全帶來更為嚴重的危害。因此，為了有針對性地使用抗生素藥物以達到理想的治療效果，對病原微生物開展抗生素敏感試驗，以獲知菌株的耐藥特性，對于指導臨床科學、合理、準確用藥，避免疾病的暴發流行及微生物耐藥性加劇起著關鍵性的作用。目前，藥敏檢測方法主要采用K-B紙片法與肉湯稀釋法，其中K-B紙片法一般須在專業的微生物實驗室條件下進行，需要具備專業知識的人員來操作完成，存在操作繁瑣、工作量大、周期長等問題，而且無法獲得藥物的最小抑菌濃度(MIC)值。肉湯稀釋法雖然可以測定藥物的MIC值，但實驗周期長，有時需要專業的儀器設備輔助，且對結果判讀不夠直觀。因此，以上兩種方法都不適合在養殖生產中應用推廣。
發明內容
本發明的目的是提供一種能應用于水產養殖現場的遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測試劑盒，從而彌補現有技術的不足。本發明的檢測試劑盒，由檢測板、菌體采集工具、增菌液、藥敏檢測培養基、顯色指示劑、比濁管和比色卡組成；其中檢測板包含有用于藥敏檢測的、包被了含有不同濃度藥物和顯色指示劑的檢測孔，所述顯色指示劑為阿爾瑪藍。所述的菌體采集工具為無菌接種環或無菌吸管；所述的增菌液的，其組份及濃度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 10g/L、CaCl2 2. 8mg/L、MgCl2 4mg/L、魚肉蛋白胨 10g/L。所述的藥敏檢測培養基的組成如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10g、2.8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L。所述的包被了含有藥物的檢測孔，是將藥物與海藻糖水溶液混合，加入到檢測孔中進行陰干制成。本發明檢測板還包含有用做質量控制的檢測孔和/或生長對照的檢測孔。
其中質量控制的檢測孔和生長對照的檢測孔，是將超純水與海藻糖水溶液混合后加入到檢測孔中進行陰干制成。上述的一種檢測板，包含有96個檢測孔，呈8行X 12列排列。所述的藥物為氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強力霉素、多粘菌素B、復方新諾明、恩諾沙星或利福平。利用本藥敏檢測試劑盒進行檢測的方法按照以下步驟進行I)利用無菌接種環挑取前期分離純化的遲鈍愛德華氏菌單菌落，置于增菌液管內攪動混勻，然后將增菌液管置于28 °C培養箱內震蕩培養，直至增菌液濁度與O. 5麥度比濁管的濁度相當。2)將增菌后的菌液以藥敏檢測培養基將其稀釋1500倍，然后分別滴加于藥敏檢測和生長對照的檢測孔內，每孔滴加90 μ I菌液；而質量控制的檢測孔內加入90 μ I無菌的
藥敏檢測培養基。3)在每個微孔內加入10 μ I顯色指示劑，置于28°C培養箱內避光培養8_12h，取出檢測板觀察微孔內的顏色，進行藥敏結果判讀，判讀標準如下A、若質控區顏色呈藍色，則試驗有效，可以繼續進行判讀；若呈粉紅色，則試驗無效，需重新進行檢測。B、若生長對照區呈粉色，則可以繼續進行MIC判讀；若生長對照區呈藍色則需將檢測板置于28°C培養箱內繼續培養，至顏色變為粉紅色后，再進行MIC判讀。C、若質 控區呈藍色，生長對照區呈粉紅色，則判讀各列不同藥物對菌體的MIC，其中每列與比色卡上細菌增殖陰性對照區內顏色相同微孔的最低藥物包被濃度即為待測弧菌的MIC。 本發明根據水生動物病原菌的生長需求，在MH培養基的基礎上添加魚肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，調整了 NaCl濃度，作為遲鈍愛德華氏菌的增菌液，可有效促進水產遲鈍愛德華氏菌的生長，使得待測菌液在短時間內達到要求濃度，以縮短藥敏檢測的時間。同時本發明利用一種對細胞安全、無毒的藍色染料阿爾瑪藍作為生長指示劑，基于氧化/還原反應原理，當細菌生長增殖時，由于細菌細胞內生化反應產生的還原力可將阿爾瑪藍顯色劑還原，從而使其顏色由氧化態下的藍色轉變為還原態下的粉紅色，這一顏色變化可利用肉眼進行直接判斷。由于阿爾瑪藍染料對細胞無毒害作用，直接將其加入藥敏檢測板微孔內不會影響細菌的生長，從而使得檢測操作更加簡便、快速，而且可連續監測細菌的增殖動態，因此本發明是一種簡便、快捷、敏感、高效的藥敏檢測方法。
圖1 :本發明的一種檢測板的不同藥物種類及含量的包被示意圖。圖2 :本發明的比色卡的示意圖。圖3 :不同增菌液配方對遲鈍愛德華氏菌生長的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明進行詳細說明。本發明試劑盒所用到的組份如下
I)藥敏檢測板為常規96孔細胞培養板，也可是其它類型的細胞培養板；2)菌體采集工具為無菌接種環或一次性無菌塑料接種環3)增菌液的一種配制方法如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2>4 mg MgCl2、魚肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L ；4)0. 5 麥氏比濁管，是以 O. 5ml 的 O. 048M BaCl2 溶液與 99. 5ml 的 O. 36M H2SO4 溶液(1%濃度，V/V)混合配制裝于密閉的透明小管內；也可選用商品化的麥氏比濁管；5)比色卡其上劃分有細菌增殖陽性對照區及細菌增殖陰性對照區(圖2)，其中從細菌增殖陰性對照區到細菌增殖陽性對照區的顏色從藍色(RGB44、19、185)至粉紅色(RGB :255，143，218)漸變；6)選用的藥品粘附保護劑海藻糖為試劑級純度大于99%，顯色指示劑采用試劑級的阿爾瑪藍染料，該染料是一種對細胞安全、無毒的氧化/還原指示染料，當細菌生長增殖時，由于細菌細胞內生化反應產生的還原力可將阿爾瑪藍染料發生還原，從而使其顏色由氧化態下的藍色轉變為還原態下的粉紅色，這一顏色變化可利用肉眼進行直接判斷。實施例1 :水產遲鈍愛德華氏菌藥敏快速檢測微孔板的制備1、藥物的配置依據水產常用藥物種類和禁用藥物目錄，確定檢測藥物的種類為氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強力霉素、多粘菌素B、復方新諾明、恩諾沙星、利福平，共11種。根據不同藥物的特性分別采用不同的溶劑準確配制成濃度為6. 4mg/ml、
6.4mg/ml、5. 1 2mg/ml、6. 4mg/ml、6. 4mg/ml、5. 12mg/ml、6. 4mg/ml、1. 28mg/ml、5. 12mg/ml、
2.56mg/ml、3. 2mg/ml的抗菌藥物儲液,其中氨節青霉素、硫酸鏈霉素、阿米卡星、鹽酸土霉素、新霉素、強力霉素、多粘菌素B用超純水配制；氟苯尼考、利福平用甲醇溶解，超純水稀釋配制；恩諾沙星用O.1N的NaOH溶解，超純水稀釋配制；SMZ用O.1NNaOH溶解，超純水稀釋配制，TMP用O.1N的冰醋酸溶解，超純水稀釋配制，以SMZ:TMP=5:1的比例混合配制成復方新諾明。配制好的藥物儲液經O. 22 μ m濾膜過濾后，置于_20°C保存。2、藥敏檢測微孔板的制備水產遲鈍愛德華氏菌藥敏快速檢測板為96孔無菌微孔板，共有8行(A-H) 12列(1-12)，根據用途不同分為三個區域藥敏檢測區(A1:H11)、生長對照區(A12:D12)、質控區(E12:H12)，其中藥敏檢測區每一列微孔底部包被有不同種類濃度呈倍比稀釋的抗菌藥物。首先，將包被藥物稀釋成以下不同濃度氨芐青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、土霉素、強力霉素由高至低的稀釋濃度分別為0· 064 μ g/ μ 1、0· 032 μ g/ μ 1、0· 016 μ g/ μ 1、0· 008 μ g/ μ 1、0· 004 μ g/ μ 1、0· 002 μ g/μ 1、0·001 μ g/μ 1、0· 0005 μ g/μ I ；鏈霉素、新霉素、復方新諾明由高至低的稀釋濃度分別為0. 512μ g/μ1、
O.256 μ g/ μ1、O. 128 μ g/ μ1、O. 064 μ g/ μ 1、0. 032 μ g/ μ 1>0. 016 μ g/ μ 1>0. 008 μ g/μ1、0·004 μ g/μ I ；恩諾沙星由高至低的稀釋濃度分別為0. 256 μ g/μ 1,0. 128 Ug/μ 1,0. 064 μ g/μ 1、0. 032 μ g/ μ 1、0. 016 μ g/ μ 1、0. 008 μ g/ μ 1、0. 004 μ g/ μ 1、0. 002 μ g/ μ I ；多粘菌素B由高至低的稀釋濃度分別為0. 128 μ g/μ 1、0. 064 μ g/ μ1、O.032 μ g/ μ 1>0. 016 μ g/ μ 1>0. 008 μ g/ μ 1、0· 004 μ g/ μ 1、0· 002 μ g/ μ1、0· 001 μ g/μ I ；利福平由高至低的稀釋濃度分別為0. 032 μ g/μ 1,0. 016 μ g/μ 1,0. 008 μ g/μ 1、0. 004 μ g/ μ 1、0. 002 μ g/ μ 1、0. 001 μ g/ μ 1、0. 0005 μ g/ μ 1、0. 00025 μ g/ μ I。然后，用超純水配置lmg/ml的海藻糖溶液，用O. 22 μ m濾膜過濾，將配置好的海藻糖溶液分別與以上不同稀釋度的藥物按體積比1:1混合，分別取不同濃度的藥物混合液20μ I對應地加入微孔板檢測區內(A1:H11)。在生長對照區(A12:D12)及質控區(E12:H12)內加入以無菌超純水與海藻糖溶液1:1混合液20μ I。將微孔板置于無菌超凈臺內室溫陰干，最終獲得藥敏檢測微孔板，4°C保存備用，其具體藥物包被種類及包被量如圖1所示。實施例2 :快速增菌液的優選為實現遲鈍愛德華氏菌快速生長以縮短藥敏檢測過程，在Mueller-Hinton(MH)培養基配方的基礎上，對其進行改良以制成增菌液，改良配方為ΜΗ0 (牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L)、MHl(牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2,4mg MgCl2、10%魚湯、蒸餾水I L)和MH2 (牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、魚肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L)。為測定不同增菌液配方對遲鈍愛德華氏菌的增殖效果，分別吸取I ml過夜培養的遲鈍愛德華氏菌菌液轉入100 ml MHO,MHl和MH2中，混合均勻后取5 mL菌液加入13支無菌試管中，置于28°C搖床180 rpm振蕩培養，每隔2 h取樣一次，于600 nm波長下測定O. D值，以培養基作為空白對照，繪制不同細菌在不同培養基中的生長曲線。結果顯示三種改良配方中，MH2培養基可以縮短遲鈍愛德華氏菌的生長延滯期，使遲鈍愛德華氏菌快速進入指數生長期，具有最好的細菌增殖效果，因此以下實施例均選用MH2培養基作為增菌液。
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實施例3 :應用水產遲鈍愛德華氏菌藥敏快速檢測微孔板進行藥敏檢測對比I)從固體培養基平板上挑取遲鈍愛德華氏菌JF-1單菌落，將其接種于增菌液中，置于28°C培養箱中震蕩培養(轉速120rpm)至肉眼可見渾濁。其中所述的遲鈍愛德華氏菌增菌液的配方為牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1. 5g、酪蛋白水解物17. 5g、NaCl 10g、魚肉蛋白胨 10g、lmgCa2+、lmgMg2+、蒸懼水 1L。2)將增菌液用檢測培養液調整濃度至O. 5麥度，再稀釋1500倍，使菌體濃度達到IX IO5個/ml用于藥敏檢測使用。其中所述的檢測培養液的配方為牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1. 5g、酪蛋白水解物 17. 5g、NaCl 10g、lmgCa2+、lmgMg2+、蒸懼水 1L。3)以粗頭接種滴管向質控區內的每個微孔里滴加2滴(90μ I)檢測培養液，將稀釋好的菌液分別滴加于微孔檢測板的藥敏檢測區及生長對照區，每孔滴加2滴。然后，在藥敏檢測微孔板每個微孔內用細頭接種滴管滴加I滴( ομ I)顯色指示劑，置于28°C培養箱中靜置避光培養8-12h，取出藥敏檢測微孔板肉眼觀察記錄各微孔內的顏色變化情況。4)同時，取一塊預先參照實施例1同等操作制備的包被不同藥物的96孔無菌酶標板，參照藥敏檢測微孔板平行地滴加待檢菌液。然后置于28°C培養箱中靜置培養。在藥敏檢測微孔板進行MIC結果判讀的同時，將接種有待檢菌的酶標板以酶標儀在595 nm波長下測定各微孔的吸光值。
5)與此同時，采用常規試管稀釋法進行MIC測定。在試管中接種Iml濃度為IO5個/mL菌液，分別在每個試管中加入以上11種8個濃度梯度的抗菌藥物，終濃度與微孔檢測法相同，每個藥物濃度處理設置3個重復，置于28°C培養箱中靜置培養，肉眼觀察至試管出現明顯濁度，且濁度不再變化，記錄結果，以肉眼觀察未出現渾濁的試管對應的最小藥物濃度為MIC。6)結果判讀(I)根據藥敏檢測微孔板內的顏色變化情況對藥敏結果進行判讀，判讀標準如下a.若質控區顏色呈藍色，則試驗有效，可以繼續進行判讀；若呈粉紅色，則試驗無效，需重新進行檢測。b.若生長對照區呈粉色，則可以繼續進行MIC判讀；若生長對照區呈藍色則需將檢測板置于28°C培養箱內繼續培養，至顏色變為粉紅色后，再進行MIC判讀。c.若質控區呈藍色，生長對照區呈粉紅色，則判讀各列不同藥物對菌體的MIC，其中每列與比色卡上細菌增殖陰性對照區內顏色相同微孔的最低藥物包被濃度即為待測弧菌的MIC。最終藥敏檢測結果顯示，利用顯色指示劑的微孔檢測板結果表明不同藥物不同濃度對遲鈍愛德華氏菌生長的抑制作用不同，以每列藥物包被孔內顏色與比色卡上細菌增殖陰性對照區顏色相同測試孔的最低藥物濃度即為MIC，結果顯示，氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素 、強力霉素、多粘菌素B、復方新諾明、恩諾沙星、利福平對遲鈍愛德華氏菌的 MIC 分別為 O. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、1.6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、6. 4 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 05 μ g/ml。(2)同時，根據酶標板內各微孔的吸光值對微孔內的細菌存活率進行計算，具體計算方法為細菌存活率=(藥物組O. D-空白對照組O. D) / (藥物陰性對照組O. D-空白對照組O. D) X 100%,將細菌存活率彡20%微孔內的最低藥物濃度判定為MIC值，結果顯示，氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強力霉素、多粘菌素B、復方新諾明、恩諾沙星、利福平對遲鈍愛德華氏菌的MIC分別為O. 4μ g/ml、0. 8μ g/ml、3. 2μ g/ml>0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、1. 6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml>0. 8 μ g/ml>6. 4 μ g/ml、3.2 μ g/ml、
0.05 μ g/ml,結果與顯色法完全吻合。(3)通過觀察試管稀釋法測定MIC的結果顯示，各試管的濁度需要在28°C培養24h后才能趨于穩定，肉眼無法觀察到明顯渾濁試管中不同藥物的最低濃度為MIC，結果顯示，氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強力霉素、多粘菌素B、復方新諾明、恩諾沙星、利福平分別為 O. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、
1.6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、6. 4 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 05 μ g/ml,結果與顯色法及分光光度法完全吻合。綜上所述，利用分光光度比濁法計算細菌存活率，發現細菌存活率< 20%的測試孔所對應的最小抑菌藥物濃度與阿爾瑪藍顯色法的結果一致。同時，試管稀釋法測定出的MIC也與以上兩種方法結果一致。因此，本發明利用阿爾瑪藍作為顏色指示劑結合制備的藥敏檢測微孔板可以準確有效地應用于水產遲鈍愛德華氏菌的藥敏檢測。本發明操作簡便，觀察方法直觀，結果穩定易讀，檢測時間短，可以作為水產養殖中遲鈍愛德 華氏菌敏感藥物的快速檢測，能夠大大縮短藥物篩選的時間，有助于養殖過程中愛德華氏菌病的預防和治療，降低疾病暴發風險，為漁業經濟帶來潛在效益，具有廣闊的應用前景。
權利要求
1.一種水產遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測試劑盒，由檢測板、菌體采集工具、增菌液、藥敏檢測培養基、比濁管和比色卡組成；其中檢測板包含有用于藥敏檢測的、包被了含有藥物和顯色指示劑的檢測孔，所述顯色指示劑為阿爾瑪藍。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的菌體采集工具為無菌接種環或無菌吸管。
3.一種用于權利要求1所述的試劑盒的增菌液，其組份及濃度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 15g/L、CaCl22. 8 mg/L、MgCl2 4 mg/L、魚肉蛋白胨10g/L。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的藥敏檢測培養基的組成如下牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 15g、2. 8 mg CaCl2,4 mg MgCl2'蒸餾水I L。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的包被了含有藥物的顯色指示劑的檢測孔，是將溶解有藥物的海藻糖水溶液與顯色指示劑阿爾瑪藍混合，加入到檢測孔中進行陰干制成。
6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測板還包含有用做質量控制的檢測孔和/或生長對照的檢測孔。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的質量控制的檢測孔和生長對照的檢測孔，是將海藻糖水溶液和顯色指示劑阿爾瑪藍混合，加入到檢測孔中進行陰干制成。
8.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的比色卡上劃分有細菌增殖陽性對照區及細菌增殖陰性對照區，其中細菌增殖陰性對照區到細菌增殖陽性對照區的顏色從藍色(RGB44、19、185)至粉紅色(RGB :255，143,218)漸變。
9.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的藥物為氨芐青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四環素、土霉素、強力霉素、多粘菌素B、復方新諾明、諾氟沙星、恩諾沙星或利福平。
10.權利要求1所述的試劑盒進行檢測的方法，包括如下的步驟 1)利用無菌接種環挑取前期分離純化的遲鈍愛德華氏菌單菌落，置于增菌液管內攪動混勻，然后將增菌液管置于28 °C培養箱內震蕩培養，直至增菌液濁度與O. 5麥度比濁管的濁度相當； 2)將增菌后的菌液以藥敏檢測培養基將其稀釋1500倍，然后分別滴加于藥敏檢測和生長對照的檢測孔內，每孔滴加90 μ I菌液；而質量控制的檢測孔內加入90 μ I無菌的藥敏檢測培養基； 3)在每個微孔內加入10μ I顯色指示劑，置于28°C培養箱內避光培養8-12h，取出檢測板觀察微孔內的顏色，進行藥敏結果判讀，判讀標準如下 A、若質控區顏色呈藍色，則試驗有效，可以繼續進行判讀；若呈粉紅色，則試驗無效，需重新進行檢測； B、若生長對照區呈粉色，則可以繼續進行MIC判讀；若生長對照區呈藍色則需將檢測板置于28°C培養箱內繼續培養，至顏色變為粉紅色后，再進行MIC判讀； C、若質控區呈藍色，生長對照區呈粉紅色，則判讀各列不同藥物對菌體的MIC，其中每列與比色卡上細菌增殖陰性對照區內顏色相同微孔的最低藥物包被濃度即為待測弧菌的MIC。
全文摘要
本發明涉及一種能應用于水產養殖現場的遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測試劑盒，本發明的檢測試劑盒，包括有檢測板、菌體采集工具、增菌液、藥敏檢測培養基、比濁管及比色卡；其中檢測板包含有用于藥敏檢測的、包被了含有藥物和顯色指示劑的檢測孔，所述顯色指示劑為阿爾瑪藍。本發明在MH培養基的基礎上添加魚肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，調整NaCl濃度，作為遲鈍愛德華氏菌的增菌液，可有效促進遲鈍愛德華氏菌的生長，使得增菌液在短時間內達到要求濃度，以縮短藥敏檢測的時間。同時利用一種對細胞安全、無毒的藍色染料阿爾瑪藍，對細胞無毒害作用，直接將其包被在藥敏檢測板微孔內不會影響細菌的生長，從而使得檢測操作更加簡便、快速，可連續監測細菌增殖動態。
文檔編號C12Q1/20GK103060186SQ20121057121
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者刁菁, 楊秀生, 葉海斌, 薛蓮, 蓋春蕾 申請人:山東省海水養殖研究所