常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片的制作方法
【專利摘要】本發明公開了常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，包括步驟：1）提取受檢者樣本DNA；2）對樣本DNA進行目的基因的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標記；3）熒光素標記的PCR產物進行基因芯片雜交，檢測目的基因的SNP位點；4）根據步驟3）得到的基因分型結果，分析受檢者對乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、白血病、食管癌、結直腸癌的易感性。通過相關基因分型，可以對受檢者進行常見惡性腫瘤的易感性評估，從而制訂最科學的個性化保健計劃，以避免、延緩甚或避免惡性腫瘤的發生。
【專利說明】常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片
【技術領域】
[0001]本發明涉及一常 見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，特別是涉及一種惡性腫瘤易感性測評及套組方法。
【背景技術】
[0002]2008年，全球有1270萬人患癌，死亡人數高達760萬。世界范圍內因惡性腫瘤死亡的人數，比艾滋病、瘧疾和結核病加起來還要多。如果不采取有效措施，預計到2030年，每年將出現2600萬新增惡性腫瘤病例，惡性腫瘤死亡人數將達到1700萬，中低收入國家將成為惡性腫瘤肆虐的“重災區”。
[0003]近幾年腫瘤的發病率和死亡率居高不下，就我國而言，惡性腫瘤已成為居民的第二位死因，城市居民的首位死因。在全球范圍內，我國的惡性腫瘤發病率與美國、英國、法國接近，高于多數亞洲國家。肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、膀胱癌死亡率及其構成呈明顯上升趨勢，其中肺癌和乳腺癌上升幅度最大，肺癌已代替肝癌成為我國首位惡性腫瘤死亡原因(占全部惡性腫瘤死亡的22.7%)。
[0004]已經掌握了關于惡性腫瘤病因及預防和管理惡性腫瘤的干預措施的大量知識。通過實施以證據為基礎的惡性腫瘤預防、早期發現和惡性腫瘤患者管理戰略，可使惡性腫瘤得以減少和控制。
[0005]煙草使用、飲酒、不健康的飲食以及缺乏運動是全世界惡性腫瘤的主要危險因素。同時遺傳因素也是惡性腫瘤一個重要危險因素。因外部環境我們可以掌控，而內部因素一遺傳因素(易感基因)我們是無法掌控。因此要從根本上預防惡性腫瘤的發生、延緩惡性腫瘤的發展和制訂合理的疾病治療措施，就必須檢測這些疾病的易感基因。基因檢測的積極意義體現在癌癥發生之前就可以發現潛在的風險，從而提起人們對自身健康與疾病的關注，進而通過“個性化健康管理”指導受檢者采取有效的方法預防。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，通過對這些基因中的關鍵性基因遺傳位點進行檢測，判斷具體基因型，能夠評估個體患上惡性腫瘤的風險幾率，從而對加強惡性腫瘤防治起到積極作用。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，包括步驟:
[0008]1)提取受檢者樣本DNA ；
[0009]2)對樣本DNA進行遺傳變異的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標記，所述遺傳變異包括:rs505922、rs2294008、rs2279744、rs738409、rs2274223、rs667282、rs6983267 和rs22311420
[0010]3)熒光素標記的PCR產物進行基因芯片雜交，檢測遺傳變異，所述遺傳變異包括:rs505922、 rs2294008、 rs2279744、 rs738409、 rs2274223、 rs667282、 rs6983267 和rs22311420[0011]4)根據步驟3)得到的基因分型結果，分析受檢者腫瘤個性化治療的療效。
[0012]所述步驟2)中的rs505922的引物是SEQ ID NO:1~2所示序列的引物、rs2294008的引物是SEQ ID N0:3~4所示序列的引物、rs2279744的引物是SEQ ID N0:5~6所示序列的引物、rs738409的引物是SEQ ID N0:7~8所示序列的引物、rs2274223的引物是SEQ ID N0:9~10所示序列的引物、rs667282的引物是SEQ ID NO: 11~12所示序列的引物、rs6983267的引物是SEQ ID NO: 13~14所示序列的引物、rs2231142的引物是SEQ IDNO: 15~16所示序列的引物。
[0013]所述步驟2)中的片段化是將純化的PCR產物經測定濃度后，用DNase I進行片段化；所述熒光素標記是將片段化PCR產物利用脫氧核苷酸轉移酶在3’末端進行熒光素標記。
[0014]所述步驟3)基因芯片的制備是將預先設計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片或硅片材質的固相載體片基上，其中，探針是SEQ ID N0:17~SEQ IDNO: 32所示序列的DNA探針。
[0015]本發明中的基因和SNP位點的理論依據:
[0016]rs505922與人體的ABO血型相關，而人體ABO血型與胰腺癌相關。
[0017]rs2294008是PTSA基因上的多態性位點，PTSA是前列腺癌標志性基因。今年來的研究發現這個基因也與其它多種腫瘤的發生相關。
[0018]rs2279744是MDM2基因上的一個多態性位點。MDM2是P53抑癌基因調控網絡中一員，其功能異常幾乎與所有癌癥發生發展相關。
[0019]rs738409是PNPLA3基因上的一個多態性位點。PNPLA3功能異常與肝硬化和肝癌相關。
[0020]rs2274223是PLCEl基因上的一個多態位點。PLCEl可以調節細胞生長，分化，凋亡和血管發生，其功能異常與多種腫瘤相關。
[0021]rs667282與吸煙成癮相關，而吸煙是肺癌最主要的危險因素。
[0022]rs6983267位于MYC增強子中，影響其表達。MYC是癌基因，與很多腫瘤的發生發
展相關。
[0023]rs2231142是ABCG2基因上的一個多態位點。ABCG2與癌癥耐藥相關，但近年來研究發現，該基因也參與腫瘤形成。
[0024]本發明的有益效果:
[0025]通過相關基因分型，可以對受檢者乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、白血病、食管癌、結直腸癌等常見惡性腫瘤的易感性進行預估，從而制訂最科學個體化保健養生方案，以避免、延緩甚或避免惡性腫瘤的發生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]下面結合附圖與【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明:
[0027]圖1是多重PCR擴增后的電泳檢測結果圖；
[0028]圖2是PCR產物片段化后的電泳檢測結果圖；
[0029]圖3是檢測芯片雜交結果圖；【具體實施方式】
[0030] 實施例1:樣本DNA的提取
[0031]【具體實施方式】
[0032]實施例1:樣本DNA的提取
[0033]采用FlexiGene DNA Kit (QIAGEN，Cat.N0.51206)試劑盒抽提人外周血中基因組 DNA。
[0034]具體方法為:向300 μ I血液樣本中加入750 μ I Buffer FG1，上下顛倒5次使其混勻。接著在12，000 rpm轉速下離心I min。離心后倒掉上層清液,再加入150 μ IBuffer FG2&1.5 μ I蛋白酶溶液，立即振蕩，直至沉淀完全溶解。接下來離心:3-5 S，然后65°C水浴5 min。當溶液從紅色變為橄欖綠色后，加入150 μ I 100%異丙醇，上下充分顛倒離心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可見的線狀或塊狀。然后在12，000 rpm轉速下離心3 min。離心后倒掉上層清液，再加入150 μ I 70%乙醇，并振蕩5 S。接著重新在12,000 rpm轉速下離心3 min，離心后倒掉上層清液，自然風干沉淀，直至所有的液體都蒸發掉。最后向離心管中加入200 μ I Buffer FG3，振蕩5 s，然后65°C水浴10 min，使DNA溶解。
[0035]使用ND-1000核酸濃度分析儀對所抽提的DNA定量。DNA工作液濃度校正至10ng/ μ 1，置于-20°c冰箱保存。
[0036]實施例2:芯片雜交檢測SNP位點
[0037]1.基因芯片的制備
[0038](I)探針溶解
[0039]將SEQ ID NO: 16~SEQ ID NO: 32所示序列探針的每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10 mM。將濃度為10 mM的探針與濃度為200 mM的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，_20°C保存，以備點樣使用。
[0040](2)點樣
[0041]將預先設計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質的固相載體片基上。片基米用Cell Associates CSS-100醒基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度:65-75%(以FullMoon片基為準)，溫度為25°C的條件下點樣，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。
[0042]2.待測樣品的處理和標記
[0043](1)目的基因的擴增
[0044]用rs505922 的引物(SEQ ID NO:1 ~2)、rs2294008 的引物(SEQ ID N0:3 ~4、rs2279744 的引物(SEQ ID NO:5 ~6)、rs738409 的引物(SEQ ID NO:7 ~8)、rs2274223 的引物(SEQ ID N0:9 ~10)、rs667282 的引物(SEQ ID NO: 11 ~12)、rs6983267 的引物(SEQID N0:13 ~14)、rs2231142 的引物(SEQ ID NO: 15 ~16)對樣本 DNA 進行 PCR 擴增。PCR擴增用30 μ I反應體系進行，反應體系是0.3 mM dNTPUO mM Tris-HCl,50 mM KCl,2 mMMgCl2,20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的濃度 0.16 μ M、基因組 DNA 10 ng,Taq 酶 0.6 U(Takara)。應用 Touch-down PCR 反應程序:94°C變性 5 min ;94°C變性 40 s,64°C退火I min，每個循環降低0.5°C，72°C延伸50 S，共10個循環；然后94°C變性40 s,59°C退火40 s，72°C延伸50 S，共30個循環；最后72°C延伸5 min。PCR結束后用1.5%瓊脂糖凝膠檢測擴增結果。
[0045]當進行多重PCR反應時，將SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 16所示序列的引物放入一個反應體系中進行擴增，體系為50 μ I。多重PCR的反應體系為:每種dNTP 0.3 μ mol/L,Tricine-KOH (PH=8.7) 40 mmol/L,KCl 16 mmol/L,MgCl2 3.5 mmol/L,BSA 3.75 μ g/ml,每條引物 2 μ mol/L, DNA 80 ng 和 2.2XTitanium Taq DNA 聚合酶(Clontech, USA)。多重PCR反應條件:95°C變性3 min ;95°C變性30s，66°C退火2 min，68°C延伸4 min，共40個循環；最后68°C延長10 min。PCR擴增后，取3 μ I PCR反應產物做瓊脂糖凝膠電泳，這些PCR產物經處理后可用于下面的雜交步驟。
[0046](2) PCR產物純化和片段化
[0047]每個樣品的所有PCR 產物混合,用 QIA quick PCR Purification Kit (Qiagen,Cat.N0.28106)純化。純化的PCR產物經測定濃度后，用DNase I (脫氧核糖核酸酶I)進行片段化。片段化的反應體系包括:30 μ I純化PCR產物(10 μ g)，4 μ I的10Χ DNaseI緩沖液，0.12 μ I的DNase 1,5.88 μ I的ddH20。反應條件為37°C溫浴5 min，然后95°C15 min。片段化后的產物跑4%瓊脂糖凝膠，保證絕大多數的片段處于30-200個堿基對。
[0048](3)熒光素標記
[0049]利用脫氧核苷酸轉移酶在3’末端進行熒光素標記，標記的40 μ I反應體系包括:25 μ I片段化PCR產物，8 μ I的5 X脫氧核苷酸轉移酶緩沖液，I μ I的CY3-N6-ddCTP(I mM),3 μ I的脫氧核苷酸轉移酶(20 U/μ 1),3 μ I的ddH20。反應條件為37°C溫浴120min,然后 95°C加熱 15 min。
[0050]3.雜交、洗滌和結果檢測
[0051]熒光標記的PCR產物95°C變性10 min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應20 μ I體系包括:熒光素標記的 PCR 產物 15 μ 1,20X SSPE 1.2 μ 1,1% Triton 0.2 μ 1,10XDenhandts 0.9 μ 1，甲酰胺 0.5 μ l,ddH20 2.2 μ I。反應條件為 48°C溫浴 120 min，然后相繼用IX洗滌緩沖液I (5X SSC,0.1% SDS)、1X洗滌緩沖液II (2X SSC,0.1% SDS)和IX洗滌緩沖液III (IX SSC)在42°C各洗滌10 min，最后用ddH20洗滌0.5 min。
[0052]洗滌后的芯片，經甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到雜交結果，再用GenePix Pro處理圖像得到數據文件，然后對數據文件進行分析就可以得到受檢者對抗腫瘤藥物療效和毒副作用的預測結果。
[0053]實施例4:療效預估
[0054]樣本:受檢者(男性，41歲)
[0055]按照實施例1-3的檢測操作流程進行檢測，其中，該受檢者目的基因多重PCR擴增后的電泳檢測結果見圖1，PCR產物片段化后的電泳檢測結果見圖2，檢測芯片雜交結果見圖3。將基因芯片檢查結果導入分析軟件獲得受檢者常見惡性腫瘤的易感性評估。該受檢者對肺癌和肝癌的易感性較高，需嚴控吸煙和飲酒。
[0056]序列表
[0057]<110>泰州醫藥城博奧邦科生物科技有限公司
[0058]<120>常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片
[0059]〈130〉 NP-10-11245[0060]〈160〉 58
[0061]〈213〉物種:人
[0062]<400> 序列:
[0063]ttgactgggt caagatgtat cc22
[0064]〈212〉類型:DNA
[0065]〈211〉長度:22
[0066]序列編號:I
[0067]〈213〉物種:人
[0068]<400> 序列: [0069]cacgggaaaa caggtttgg21
[0070]〈212〉類型:DNA
[0071]〈211〉長度:19
[0072]序列編號:2
[0073]〈213〉物種:人
[0074]<400> 序列:
[0075]atatggccct gggtaggctc t21
[0076]〈212〉類型:DNA
[0077]〈211〉長度:21
[0078]序列編號:3
[0079]〈213〉物種:人
[0080]<400> 序列:
[0081]ATCMCAGGG CMGCAGCAC21
[0082]〈212〉類型:DNA
[0083]〈211〉長度:20
[0084]序列編號:4
[0085]〈213〉物種:人
[0086]<400> 序列:
[0087]cgggagttca gggtaaaggt22
[0088]〈212〉類型:DNA
[0089]〈211〉長度:20
[0090]序列編號:5
[0091]〈213〉物種:人
[0092]<400> 序列:
[0093]cagctggaga caagtcagga20
[0094]〈212〉類型:DNA
[0095]〈211〉長度:20
[0096]序列編號:6
[0097]〈213〉物種:人
[0098]<400> 序列:
【權利要求】
1.常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，包括步驟: 1)提取受:檢者樣本DNA； 2)對樣本DNA進行遺傳變異的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標記，所述遺傳變異包括:rs505922、rs2294008、rs2279744、rs738409、rs2274223、rs667282、rs6983267 和rs2231142 ； 3)熒光素標記的PCR產物進行基因芯片雜交，檢測目的基因的SNP位點； 4)根據步驟3)得到的基因分型結果，分析受檢者對抗腫瘤藥物的療效和毒副作用。
2.如權利要求1所述的常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，其特征在于:所述步驟2)中的rs505922的引物是SEQ ID N0:1~2所示序列的引物、rs2294008的引物是SEQID N0:3~4所示序列的引物、rs2279744的引物是SEQ ID NO:5~6所示序列的引物、rs738409的引物是SEQ ID NO: 7~8所示序列的引物、rs2274223的引物是SEQ ID NO: 9~10所示序列的引物、rs667282的引物是SEQ ID NO: 11~12所示序列的引物、rs6983267的引物是SEQ ID NO:13~14所示序列的引物、rs2231142 的引物是SEQ ID NO: 15~16所示序列的引物。
3.如權利要求1所述的常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，其特征在于:所述步驟2)中的片段化是將純化的PCR產物經測定濃度后，用DNase I進行片段化； 所述熒光素標記是將片段化PCR產物利用脫氧核苷酸轉移酶在3’末端進行熒光素標記。
4.如權利要求1所述的常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，其特征在于:所述步驟3)基因芯片的制備是將預先設計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片或硅片材質的固相載體片基上，其中，探針是SEQ ID NO: 17~SEQ ID NO:32所示序列的DNA探針。
5.如權利要求1或4所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。
6.如權利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物含有SEQID NO:1~SEQ ID NO: 16所示序列的核苷酸鏈或其互補鏈。
7.如權利要求1所述的常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，其特征在于:所述步驟4)中的基因分型結果根導入分析軟件對受檢者常見惡性腫瘤的易感性進行評估。
8.如權利要求1或7所述的常見惡性腫瘤易感基因檢測芯片，其特征在于:所述常見惡性腫瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、白血病、食管癌和結直腸癌。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898197SQ201210570393
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】郜恒駿, 張可浩, 張新, 盛海輝 申請人:泰州醫藥城博奧邦科生物科技有限公司