高產葉黃素轉基因小球藻及其制備方法

專利名稱：高產葉黃素轉基因小球藻及其制備方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及一種高產葉黃素轉基因小球藻及其制備方法。
背景技術：
葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，其在生物體內起著十分重要的作用。葉黃素具有抗氧化活性，能夠預防癌癥、心血管疾病和年齡相關黃斑變性等疾病。此外，作為一種天然色素，葉黃素可作為食品、醫藥和保健品的色素添加劑。目前，葉黃素主要來源于萬壽菊，然而由于勞動力和土地成本提高，從萬壽菊獲取葉黃素受到一定限制。小球藻中含有豐富的葉黃素，而且小球藻具有生長速度快、可異養培養、易于進行規模化培養和藻種改良的優點，利用小球藻合成葉黃素越來越受人們的關注。目前，應用于小球藻轉基因的方法有電轉化法、基因槍法、PEG-CaCl2介導的轉化方法和根癌農桿菌介導轉化的方法。其中，根癌農桿菌介導的轉化方法具有轉化方法簡單、成本低，能夠將大片段的DNA轉入細胞的轉錄活性區，且以低拷貝的形式整合和重組等特點。根癌農桿菌介導轉化的方法已經成功應用于小球藻Chlorella vulgaris、衣藻、雨生紅球藻、杜氏鹽藻、裂壺藻和微擬球藻等微藻中。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種培育轉基因小球藻的方法。本發明提供的方法，為將IPP異構酶編碼基因導入目的小球藻中，得到轉基因小球藻，所述轉基因小球藻的葉黃素產量大于所述目的小球藻；所述IPP異構酶的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述方法中，所述IPP異構酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。上述方法中，所述IPP異構酶編碼基因以IPP異構酶編碼基因表達盒的形式導入目的小球藻；所述IPP異構酶編碼基因表達盒包括CAMV35S啟動子、IPP異構酶編碼基因和CYCl終止子；所述IPP異構酶編碼基因表達盒的核昔酸序列具體為序列表中的序列I。上述方法中，所述IPP異構酶編碼基因表達盒通過重組載體導入目的小球藻；所述重組載體為將所述IPP異構酶編碼基因表達盒插入表達載體中得到的載體；所述表達載體具體為PCAMBIA2301 ;所述重組載體具體為將序列表中序列I插入PCAMBIA2301載體的HindIII和BamH I酶切位點間得到的載體。上述方法中，所述重組載體通過重組農桿菌導入目的小球藻；所述重組農桿菌為將所述重組載體導入農桿菌中得到的重組菌。上述目的小球藻為小球藻STI002CGMCC No. 6951。由上述方法得到的轉基因小球藻也是本發明保護的范圍。
小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 6951,建議的分類命名為 Chlorella vulgaris。本發明的另一個目的是提供一種重組載體。本發明提供的重組載體，為將IPP異構酶編碼基因表達盒插入表達載體中得到的載體；所述表達載體具體為PCAMBIA2301 ；所述IPP異構酶編碼基因表達盒包括CAMV35S啟動子、IPP異構酶編碼基因和CYCl終止子；所述IPP異構酶編碼基因表達盒的核昔酸序列具體為序列表中的序列I。本發明的第三個目的是提供一種重組菌。本發明提供的重組菌，為將上述的重組載體導入農桿菌中得到的重組菌。上述的轉基因小球藻、上述的重組載體或上述的重組菌在制備葉黃素中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的第四個目的是提供一種生產葉黃素的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟I)無水乙醇超聲破碎由上述方法得到的轉基因小球藻或上述的轉基因小球藻，再加入KOH水溶液后超聲皂化，得到溶液A ；2)將所述溶液 A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。上述方法具體如下I)無水乙醇超聲破碎轉基因小球藻30min ;再加入20% (質量百分含量)KOH水溶液超聲皂化(超聲功率70%，溫度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；2)將溶液A加入二氯甲烷和蒸餾水萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。本發明的實驗證明，本發明將IPP異構酶編碼基因表達盒導入野生型小球藻中，得到轉基因小球藻，該轉基因小球藻的葉黃素含量和野生型小球藻相比最高提高30. 95% ；葉黃素產量和野生型相比最高提高36. 77%，為高產葉黃素小球藻。


圖1為重組質粒pCAMBIA2301_idi的構建過程示意2為基因工程小球藻的表型鑒定結果左圖為小球藻原生質體與農桿菌共培養后涂布于篩選培養基有藻落長出，右圖為小球藻原生質體未與農桿菌共培養涂布于篩選培養基沒有藻落長出圖3為基因工程小球藻在篩選培養基中進一步鑒定圖4為PCR驗證基因工程小球藻中idi基因的插入情況圖5為PCR驗證基因工程小球藻中NPTII基因的插入情況圖6為基因工程小球藻和野生型小球藻的生物量示意7為基因工程小球藻和野生型小球藻的葉黃素含量示意8為基因工程小球藻和野生型小球藻的葉黃素產量示意圖
具體實施方式
以下實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中所用的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特別說明，均購自常規生化試劑商店。克隆載體pBluescript II SK+ Stratagene, Catalog Number#212205o雙兀載體pCAMBIA2301 CAMBIA, Canberra, Australia。質粒pGAPZ a A :1nvitrogen, Catalog Number V205-20。農桿菌菌株LBA4404 :1nvitrogen, Catalog Number 18313-015。酶處理液由溶質和溶劑組成；溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液(pH5. 8);溶質及其濃度如下2% (質量百分比)纖維素酶,2% (質量百分比)蝸牛酶和O. 2M KCl0FC培養基由水和溶質組成；溶質及其終濃度如下葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，牛肉浸膏 lg/L，酵母浸膏 lg/L，FeSO4 · 7H20 2mg/L。TYNG培養基由水和溶質組成；溶質及其終濃度如下10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、O. 2g/L 的 MgSO4 · 7H20，其余為水；pH7. 5。頂培養基由水和溶質組成；溶質及其終濃度如下=NaCl O. 15g/L、MgSO4 · 7H200. 25g/L、Κ2ΗΡ042· 28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4O. 0025g/L、(NH4) 2S040. 53g/L、葡萄糖1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。篩選培養基由FC培養基、KC1、G418、氨芐青霉素和頭孢霉素組成，KCl的濃度為O. 2mol/L, G418的濃度為450ug/mL，氨芐青霉素的濃度為300ug/mL，頭孢霉素的濃度為300ug/mL。實施例1、重組質粒pCAMBIA2301_idi的構建一、大腸桿菌idi基因的克隆及相關載體的構建1、大腸桿菌idi基因的克隆以大腸桿菌DH5 α為材料，用酚-氯仿法提取大腸桿菌DH5 α基因組；具體如下取500uL DH5a菌液，12000r離心5min，獲得菌體。加650uL裂解液，振蕩2min，放入65°C水浴鍋直至裂解澄清。加入等體積的平衡酚氯仿異戊醇(25:24:1)，振蕩混勻，13000r離心15min。吸上清輕移至新管中，再用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提一次，13000r離心15min。吸上清移至新管中，加入1/10體積的NaAcJP 2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min，13000r離心15min，棄上清。用700uL 75%的乙醇洗兩次，室溫開蓋放置5min，讓剩余的乙醇揮發完全。加20uL水溶解，后加O. 5uL RNase，放置于37°C 10分鐘以除去RNA，-20°C保存。根據genebank公布的大腸桿菌idi基因序列(如序列表的序列I自5’末端第545-1093位核苷酸)，設計兩端引物id1-F :5’-GGAATTCATGCAAACGGAACACGTC-3’ ；id1-R :5’-AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3’。以大腸桿菌DH5 α基因組為模板，id1-F和idi_R為引物，進行PCR擴增。PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性45s，58°C退火Imin，72°C延伸lmin30s，運行32個循環后，72°C延伸15min。得到549bp的PCR產物，即為idi基因。2、重組質粒pBS-1di的構建I)用限制性內切酶EcoR I和Pst I雙酶切上述I得到的PCR產物，回收酶切產物；2)用限制性內切酶EcoR I和Pst I雙酶切克隆載體pBluescript IISK+，回收296 Ibp載體骨架；3)將步驟I)的酶切產物和步驟2)的載體骨架連接，得到重組質粒pBS-1di。二、重組質粒 pCAMBIA2301-1di 的構建(I)啟動子CAMV35S的獲得設計兩端引物CAMV35S-F :5’-CCCAAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCA-3’ ；CAMV35S-R :5’-GGAATTCAGTCCCCCGTGTTCTCT-3’。以質粒pCAMBIA2301為模板，以CAMV35S-F和CAMV35S-R為模板，PCR擴增，得到538bpPCR產物，即為啟動子CAMV35S。PCR 反應條件為94°C預變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運行32個循環后，72 °C延伸15min。(2)用限制性內切酶HindIII和EcoR I雙酶切(I) PCR產物，回收酶切產物。(3)用限制性內切酶HindIII和EcoR I雙酶切上述一得到的重組質粒pBS_idi，回收4372bp載體骨架。(4)將步驟(2)的酶 切產物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質粒pBS-CAMV35S-1di0(5 )終止子CYCl的獲得以質粒pGAPZ a A為模板，CYCl-F和CYCl-R為引物，PCR擴增得到318bpPCR產物，即為終止子CYCl。設計兩端引物CYCl-F :5’-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3’ ;CYCl-R:5’-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3’PCR 反應條件為94°C預變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運行32個循環后，72 °C延伸15min。(6)用限制性內切酶Pst I和BamH I雙酶切(5)得到的PCR產物，回收酶切產物。(7)用限制性內切酶Pst I和BamH I雙酶切(4)得到的重組質粒pBS-CAMV35S-1di,回收 4907bp 載體骨架。(8)將步驟(6)的酶切產物和步驟(7)的載體骨架連接，得到重組質粒PBS-CAMV35S -1d1-CYCl。(9)用限制性內切酶HindIII和BanH I雙酶切重組質粒pBS_CAMV35S -1d1-CYCl,回收1418bp酶切產物(idi基因表達盒CAMV35S -1d1-CYCl)；(10)用限制性內切酶HindIII和BamH I雙酶切雙元載體pCAMBIA2301，回收11608bp載體骨架。(11)將步驟(9)的酶切產物和步驟(10)的載體骨架連接，得到重組質粒pCAMBIA2301-1di。重組質粒pCAMBIA2301-1di的結構示意圖及構建流程圖見圖1。將重組質粒pCAMBIA2301_idi送去測序，結果該質粒為將序列表中序列I插入PCAMBIA2301載體的HindIII和BamH I酶切位點間得到的載體。序列表中序列I (idi基因表達盒CAMV35S -1d1-CYCl)自5’末端第1-538位核苷酸為啟動子CAMV35S，自5’末端第545-1093位核苷酸為基因idi，自5’末端第1100-1418位核苷酸為終止子CYCl。實施例2、高產葉黃素的轉idi小球藻的獲得一、轉idi小球藻的獲得采用農桿菌介導小球藻的轉化，具體如下( I)小球藻原生質體的制備小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 6951,建議的分類命名為 Chlorella vulgaris。挑取小球藻STI002 (CGMCC 6951 ;也稱為野生型小球藻)單藻落接種于FC培養基中，28 °C搖床培養至藻體長出。以1%的接種量轉接于50mL新鮮的FC培養基，28°C搖床培養至對數期。以4000rpm的轉速4°C離心7min收集藻細胞，用遇冷的無菌水洗滌藻細胞一次后，用預處理劑(預處理劑由溶質和溶劑組成；所述溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液配制(pH5. 8);所述溶質及其濃度為50mmol/L EDTA, 25mmol/L DTT)處理 30min。

4000rpm的轉速離心7min收集藻細胞，加入IOmL酶處理液，28 °C搖床消化14小時，得到小球藻原生質體。(2)重組質粒pCAMBIA2301-1di通過電轉化方法轉化農桿菌菌株LBA4404，得到重組農桿菌 LBA4404/pCAMBIA2301-1di (HindIII 和 BamH I 酶切，得到 1418bp 的為陽性)。(3)挑取重組農桿菌LBA4404/pCAMBIA2301-1di至TYNG培養基中，28°C搖床培養至對數期。離心收集菌體，用誘導培養基頂培養基重懸，調整農桿菌濃度為0D600=0. 6-0. 8加入終濃度為150umol/L的乙酰丁香酮，25°C預誘導5小時，收集菌液。(4)離心收集步驟(I)的原生質體，用誘導培養基頂培養基重懸后，加入步驟(3)得到的菌液中，25°C侵染24小時，得到藻體與農桿菌的共培養物。(5)離心收集步驟(4)中的藻體與農桿菌的共培養物，涂布于固體的篩選培養基，28°C培養7天，有藻落長出，得到轉idi小球藻。同時，以未與農桿菌共培養的小球藻原生質體做陰性對照，將其涂布于篩選培養基。與農桿菌共培養的藻體涂布于篩選培養基后有藻落(即轉idi小球藻)長出(圖2A),而未與農桿菌共培養的藻體涂布于篩選培養基后沒有藻落長出(圖2B)。采用同樣的方法將空載體pCAMBIA2301轉入小球藻中，得到轉空載體小球藻。二、轉idi小球藻鑒定及表型分析1、二次篩選和表型鑒定將獲得的轉idi小球藻培養后在篩選培養基中劃線，同時以野生型小球藻和轉空載體小球藻做陰性對照。結果如圖3所示，Il至17為轉idi小球藻藻株，WT為野生型小球藻藻株；可以看出，轉idi小球藻能夠在篩選培養基上生長，而野生型小球藻不能生長。
轉空載體小球藻與野生型小球藻的結果無顯著差異。2、轉idi小球藻分子鑒定PCR驗證外源基因在轉idi小球藻基因組中的整合情況，具體如下提取轉idi小球藻和野生型小球藻的基因，以基因組為模板，分別用引物id1-F/id1-R 和 NPTI1-F/NPTI1-R 進行 PCR 擴增。id1-F :5’-GGAATTCATGCAAACGGAACACGTC-3’ ；id1-R :5’-AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3’。NPTI1-F : 5’-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3’ ；NPT' I1-R :5’-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3’。PCR反應條件為941預變性51^11，941變性458，581退火lmin，72°C延伸lmin30s，運行32個循環后，72°C延伸15min。取5uL PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4 (idi基因片段PCR鑒定)和圖5 (NPTII基因片段PCR鑒定)所示，其中，Il至17為轉idi小球藻藻株，WT為野生型小球藻藻株；可以看出，轉idi小球藻的基因組能夠擴增出約549bpidi基因片段，而野生型小球藻的基因組中不能擴增出idi基因片段；轉idi小球藻的基因組能夠擴增出798bpNPTII基因片段，而野生型小球藻的基因組中不能擴增出798bpNPTII基因片段。結果表明，外源 基因已經插入小球藻基因組中，進一步證明轉idi小球藻構建成功。轉空載體小球藻基因組中不能擴增出idi基因片段，但能夠擴增出798bpNPTII基因片段。3、轉idi小球藻生物量的測定將轉idi小球藻、轉空載體小球藻和野生型小球藻以5%的量接種于含有IOOmL FC培養基的250mL三角燒瓶中，28°C、180r/min搖床培養5天，得到藻液。將藻液8000r/min離心IOmin收集藻體，除去上清液，藻體冷凍干燥后，稱量干重。結果如圖6所示，小球藻轉化子I1、12、13、14和15的生物量與野生型無明顯差異，但16和17的生物量和野生型相比有所降低。結果表明，農桿菌介導idi基因的轉化對大部分小球藻的生長沒有顯著影響。轉空載體小球藻與野生型小球藻的結果無顯著差異。三、轉idi小球藻產生葉黃素含量的測定研磨轉idi小球藻、轉空載體小球藻和野生型小球藻為粉狀，準確稱取O. 05g轉idi小球藻粉、轉空載體小球藻粉和野生型小球藻藻粉，加入2. 5mL無水乙醇超聲破碎30min (超聲功率70%，溫度35°C)，后加1. 5mL 20%K0H (質量百分含量)超聲皂化(超聲功率70%,溫度35°C )IOmin ;得到溶液A ;用二氯甲燒、蒸懼水各20mL萃取,5000r/min離心5min,棄去上層水相，收集二氯甲烷相，40°C低壓旋轉蒸發干燥，提取物用色譜純甲醇定容至5mL ；稀釋5倍，過O. 22um濾膜后進行HPLC檢測。HPLC檢測的色譜條件為流動相為甲醇和水(體積比為95:5)，流速為O. 8mL/min，進樣量10uL，檢測波長為444nm。轉idi小球藻為轉idi 小球藻 I1、12、13、14、15、16、17。結果如圖7所示，轉idi小球藻I1、12、13和14的葉黃素含量與野生型的差異較大，野生型小球藻、轉idi小球藻I1、12、13和14的葉黃素含量分別為O. 64mg/g、0. 75mg/g、0. 71mg/g、0. 73mg/g、0. 84mg/g, 14的葉黃素含量最高,與野生型相比提高了 30. 95%。進一步分析每升藻液(野生型和各個轉idi小球藻每升藻液的干粉量不同，具體為如圖6所示生物量；藻液的獲取方式在實施例2的二的3。)中葉黃素的產量，結果如圖8所示，轉idi小球藻I1、13和14的葉黃素產量相對于野生型有一定提高，野生型小球藻、轉idi 小球藻 I1、13 和 14 的葉黃素產量分別為1. 45mg/L、l. 77mg/L、l. 71mg/L、l. 98mg/L，其中14的葉黃素產量最高，比野生型提高了 36. 77%。轉空載 體小球藻與野生型小球藻的結果無顯著差異。
權利要求
1.一種培育轉基因小球藻的方法，為將IPP異構酶編碼基因導入目的小球藻中，得到轉基因小球藻，所述轉基因小球藻的葉黃素產量大于所述目的小球藻； 所述IPP異構酶的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在在于所述IPP異構酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在在于所述IPP異構酶編碼基因以IPP異構酶編碼基因表達盒的形式導入目的小球藻； 所述IPP異構酶編碼基因表達盒包括CAMV35S啟動子、IPP異構酶編碼基因和CYCl終止子； 所述IPP異構酶編碼基因表達盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在在于 所述IPP異構酶編碼基因表達盒通過重組載體導入目的小球藻； 所述重組載體為將所述IPP異構酶編碼基因表達盒插入表達載體中得到的載體；所述表達載體具體為PCAMBIA2301。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在在于 所述重組載體通過重組農桿菌導入目的小球藻；所述重組農桿菌為將所述重組載體導入農桿菌中得到的重組菌。
6.由權利要求1-5所述方法得到的轉基因小球藻。
7.—種重組載體，為將IPP異構酶編碼基因表達盒插入表達載體中得到的載體；所述表達載體具體為PCAMBIA2301 ； 所述IPP異構酶編碼基因表達盒包括CAMV35S啟動子、IPP異構酶編碼基因和CYCl終止子； 所述IPP異構酶編碼基因表達盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
8.—種重組菌，為將權利要求7所述的重組載體導入農桿菌中得到的重組菌。
9.由權利要求6所述的轉基因小球藻、權利要求7所述的重組載體或權利要求8所述的重組菌在制備葉黃素中的應用。
10.一種生產葉黃素的方法，包括如下步驟 1)無水乙醇超聲破碎由權利要求1-5所述方法得到的轉基因小球藻或由權利要求6所述的轉基因小球藻，再加入KOH水溶液后超聲皂化，得到溶液A ； 2)將所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。
全文摘要
本發明公開了一種高產葉黃素轉基因小球藻的制備方法。本發明提供了一種培育轉基因小球藻的方法，為將IPP異構酶編碼基因導入目的小球藻中，得到轉基因小球藻，所述轉基因小球藻的葉黃素產量大于所述目的小球藻；所述IPP異構酶的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發明的實驗證明，本發明將IPP異構酶編碼基因表達盒導入野生型小球藻中，得到轉基因小球藻，該轉基因小球藻的葉黃素含量和野生型小球藻相比最高提高30.95%；葉黃素產量和野生型相比最高提高36.77%，為高產葉黃素小球藻。
文檔編號C12N15/63GK103045626SQ201210563819
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者林祥志, 馬瑞娟, 榮輝, 林汝榕, 程汝濱, 王昭凱, 楊善軍, 馬勇, 陳水波, 柯秀蓉, 李惠麗 申請人:國家海洋局第三海洋研究所