雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發明屬于分子生物學中基因克隆領域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70（HSP70）基因序列及其克隆方法。雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列為SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本發明首次從雙齒圍沙蠶中克隆到一種熱休克蛋白70基因，該序列cDNA全長2161bp，其中開放閱讀框位于49-2019位核苷酸，編碼656個氨基酸殘基。雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因的成功克隆和測序，為進一步分析HSP70影響下生物抗逆能力，為HSP70其它功能的篩選及應用奠定了基礎；也為利用HSP70基因對不同濃度污染物的表達情況來作為污染早期預警工具提供了方法學的指導。
【專利說明】雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列及其克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學中基因克隆領域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70 (HSP70)基因序列及其克隆方法。
【背景技術】
[0002]熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是指細胞在應激原特別是環境高溫誘導下所產生的一組蛋白質。HSP首先是在果蠅體內發現的。1962年，發現將果蠅的培養濕度從25°C提高到30°C (熱休克環境溫度升高)，30分鐘后就可在多絲染色體上看到蓬松現象(或稱膨突puff)，提示這些區帶基因的轉錄加強并可能有某些蛋白質的合成增加。1974年，人們從熱休克果蠅幼蟲的唾液腺等部位分離到了 6種新的蛋白質，即熱休克蛋白。除環境高溫以外，其他應激原如缺氧、寒冷、感染、饑餓、創傷、中毒等也能誘導細胞生成熱休克蛋白。因此，熱休克蛋白(HSP)又稱應激蛋白(stress protein，SP)，但習慣上仍稱為HSP。近年研究表明:熱休克蛋白的生成，不僅見于果蠅，而且普遍存在于從細菌至人類的整個生物界(包括植物和動物)。絕大部分生物細胞生成的HSP分子量都在80~110kD、68~74kD和18~30kD之間。作為一個具有多成員的龐大糖蛋白超基因家族，根據其同源程度及相對分子質量大小可分為 HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小 HSP (HSP25、HSP27、HSP28)五大家族。此外，還有一部分HSP是以相關糖蛋白來分類的，如糖相關蛋白94和糖相關蛋白7。不同分子量的熱休克蛋白，在細胞內的分布也有所不同，例如，在酵母菌中發現的分子量為89kD的HSP分布于細胞漿中，而分子量為68kD、70kD、110kD的HSP卻主要分布于細胞核或核仁區域。
[0003]熱休克蛋白70是最為保守和重要的一個熱休克蛋白家族，具有多種生物學功能，包括分子伴侶功能、參與免疫反應、抗細胞凋亡功能、抗氧化功能、提高細胞的應激耐受性、促進細胞增殖、參與細胞骨架的形成和修復等，其廣泛的生物學功能使之成為當今生命科學研究的熱點，因此，研究這類進化上非常保守的蛋白基因表達調控機制和相關的信號轉導是非常重要的。
[0004]雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)屬環節動物門多毛綱沙蠶科，作為潮間帶地區的常見物種，是各種魚類、甲殼類和海鳥的重要食餌。由于沙蠶位于水陸生態食物鏈的底部，能攝食底泥中的沉積物、有機碎屑和微生物等，此外，對重金屬和某些工業有機污染物具有一定積累和消化作用，因此被認為是多毛類中耐污染能力較強的底棲生物。多毛類沙蠶可以很好地利用底質中的有機污染物和一些重金屬轉化為自身的生產力，它們作為海洋食物鏈中的一個分室既是生產單元，又能夠凈化底質，使系統內部的廢棄物再利用和循環，增加環境生態效益，其體內必然存在某種解毒和防御機制，而在其中HSP家族基因是必不可少的研究對象。因此，研究沙蠶熱休克蛋白基因為揭示和利用其解毒防御系統功能具有重要意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70 (HSP70)基因序列及其克隆方法。
[0006]為實現上述目的本發明采用的技術方案為:
[0007]—種雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列,雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0008]雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白，雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0009]雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列的克隆方法，首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA ;而后采用下游外側特異性引物HSP70-0uter-R (5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’)和下游內側特異性引物 HSP70-1nner-R (5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’)進行 5’-RACE 反應，克隆得到熱休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F進行RT-PCR反應，克隆得到熱休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’ -GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’ ；通過序列片段拼接矯正，最終獲得熱休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0010]本發明具有如下優點:
[0011]1.采用本發明對雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因的成功克隆和測序，首次確定其全部編碼序列和部分非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設計引物再克隆該基因，也可以根據該序列或該序列所推導的氨基酸序列對該基因進行重組表達或基因轉移。
[0012]2.雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因的成功克隆和測序，為進一步分析HSP70影響下生物抗逆能力，為HSP70其它功能的篩選及應用奠定了基礎；
[0013]3.利用本發明所得HSP70基因對不同 濃度污染物的表達情況來作為污染早期預警工具提供了方法學的指導。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例提供的雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70在不同濃度Cu脅迫下的表達效果圖。
【具體實施方式】
[0015]本發明通過對雙齒圍沙蠶差減文庫中所獲得的表達序列標簽(EST)與NCBI上的HSP70的EST序列進行比對分析，利用DNAstar中的SeqMan軟件分析所有HSP70的同源性區域設計簡并引物；其克隆方法包括:(I)通過分析近源物種熱休克蛋白70的EST序列及CDS序列的保守區設計簡并引物HSP70-0uter-R、HSP70-1nner-R和反向引物HSP70-F ；(2)從鮮活健康的雙齒圍沙蠶成體組織中提取總RNA ; (3)利用TaKaRa 5’_Full Race試劑盒及下游外側特異性引物HSP70-0uter-R和下游內側特異性引物HSP70_Inner-R進行5’-RACE反應，克隆得到熱休克蛋白70基因5’端序列；(4)利用反向引物HSP70-F進行RT-PCR反應，克隆得到熱休克蛋白70基因3’端序列；另外，該反向引物還可以為序列表中SEQ IDN0.1核苷酸序列片段；(5)通過序列片段拼接矯正，最終獲得熱休克蛋白70基因核苷酸序列 SEQ ID N0.1。
[0016]本發明首次從雙齒圍沙香中克隆到一種熱休克蛋白70基因，該序列cDNA全長2161bp，其中開放閱讀框位于49-2019位核苷酸，編碼656個氨基酸殘基。
[0017]實施例1
[0018]雙齒圍沙蠶HSP70基因如SEQ ID N0.1所示:
【權利要求】
1.一種雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列,其特征在于:雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—種權利要求1所述的雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白，其特征在于:雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氣基酸序列所不。
3.—種權利要求1所述的雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列的克隆方法，其特征在于:首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA;而后采用下游外側特異性引物HSP70-0uter-R (5，-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’)和下游內側特異性引物 HSP70_Inner-R(5，-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’ )進行5’ RACE反應，克隆得到熱休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F進行RT-PCR反應，克隆得到熱休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’ -GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’ ；通過序列片段拼接矯正，最終獲得熱休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID N0. 1。
【文檔編號】C12N15/10GK103882025SQ201210563321
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】張倩茹, 魏樹和, 張靖宜, 牟文燕, 周啟星 申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所