專利名稱：一種米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種新型A 型阿魏酸酯酶(faeA)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
阿魏酸(ferulic acid)是肉桂酸的一種，化學名是(3-甲基_4_輕基)_3_苯基-2-丙烯酸，或者3-甲基-4-羥基肉桂酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，其在植物細胞壁結構中起著重要的作用，可以在植物細胞壁的木質素與木質素之間、木質素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構成一個骨架結構，使得整個細胞壁變得堅硬。在谷物的細胞壁中，阿魏酸的單體和多種二聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上。阿魏酸主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國、日本已允許用作食品添加劑，目前在醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)中廣泛應用。
阿魏酸酯酶(EC. 3. I. I. 73)又稱肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的一個亞類，也是一種胞外水解酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯鍵， 一方面促進半纖維素、木素與纖維素的分離，有利于纖維素的進一步利用；另一方面促進阿魏酸等酚酸類物質的分離。阿魏酸酯酶在生物乙醇生產(chǎn)、制漿造紙、動物飼料生產(chǎn)和生物合成中具有廣泛的應用價值。目前對于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于對原始菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化以增加產(chǎn)酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高阿魏酸酯酶的酶活。
近年來，隨著對自然界半纖維素資源的開發(fā)利用，尤其是反式阿魏酸優(yōu)越的生理功能，人們對不同來源和不同特性的阿魏酸酯酶進行了深入地研究，阿魏酸酯酶的應用領域得到了不斷地拓展，除了在食品方面的利用，其在造紙、飼料、紡織、釀酒、醫(yī)藥、環(huán)境和能源等工業(yè)領域逐步開始了廣泛的應用。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種源于Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，為該阿魏酸酯酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎。根據(jù)氨基酸序列以及底物特異性等，將阿魏酸酯酶分為A、B、C、D四類，Shin等研究表明這四類阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根據(jù)同源比對，Aspergillus oryzae CICC 40186分泌的為A型阿魏酸酯酶，命名為Aor FaeA，其相應的基因命名為Aor faeA。
A. oryzae菌株購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(China Center of Industrial CultureCollection，CICC)，編號為 40186。
本發(fā)明的技術方案一種源自A. oryzae CICC 40186的新型的A類阿魏酸酯酶 (Aor FaeA)，其基因(Aor faeA)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ ID NO 10
所述的由成熟肽cDNA序列所推導的Aor FaeA氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組阿魏酸酯酶的活性測定方法以對硝基苯酚阿魏酸酯(pNPF)作為反應底物，反應體系為200 μ L，緩沖體系為25mmol/LpH6. 4的磷酸緩沖液(含2. 5% Tritonx-100)，對硝基苯酚阿魏酸酯(溶于DMS0)終濃度為O. 6mmol/L，加入100 μ L的酶，測定產(chǎn)物對硝基苯酚在410nm處吸光度。同時設置空白對照(100 μ L粗酶液于沸水浴中滅、酶3min，其他操作步驟同上)。醋酶活力定義在上述反應條件下，每分鐘催化底物水解生成IymoL對硝基苯酚所需要的酶量為一個活力單位(U)。所述的Aor faeA成熟肽cDNA序列的克隆和表達的方法如下(I)從已報道的Aspergillus oryzae RIB 40基因組信息中找出編碼米曲霉A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據(jù)預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下FAE-F :5，GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3，F(xiàn)AE-R :5’ GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3’提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到AorfaeA成熟肽cDNA序列。(2)將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA(圖I)，并對重組質粒進行序列測定。(3)GS115/faeA的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用Sac I對pPIC9K_faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種來源于A. oryzae CICC 40186的新型的阿魏酸酯酶成熟肽基因cDNA序列的克隆及表達的方法，生物信息學分析表明該阿魏酸酯酶屬于此類酶的A類，所以命名為Aor FaeA，其相應的基因命名為Aor faeA。本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應用潛力及經(jīng)濟價值，也為其他菌株新型阿魏酸酯酶的研究奠定了理論基礎。
圖I :重組質粒pPIC9K_faeA的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1A. oryzae CICC 40186 faeA成熟肽cDNA序列的克隆以A.oryzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和FAE-F為引物進行第一輪PCR，其反應條件為940C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s，51。。30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ;以 FAE-F 和 FAE-R 為引物進行第二輪 PCR，其反應條件為94°C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s,54°C 30s, 72°C lmin)， 72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-Aor faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
實施例2Aor faeA成熟肽基因在畢赤酵母GSl 15中的表達
將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切， 回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA，并對重組質粒進行序列測定。
用Sac I對pPIC9K_faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選， 得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA。該基因工程菌用I. 0%甲醇誘導表達96h，采用紫外吸收法測得發(fā)酵液中重組阿魏酸酯酶活性達68IU/mL。
權利要求
1.一種來源于Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類阿魏酸酯酶,其核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
2.A. oryzae CICC 40186新型A類阿魏酸酯酶基因序列克隆及表達的方法 (1)從已報道的Aspergillusoryzae RIB 40基因組信息中找出編碼黑曲霉A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據(jù)預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下FAE-F :5，GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3，F(xiàn)AE-R :5’ GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3’提取 A. oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說明書進行RT-PCR擴增；將兩輪PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接(pUCm-T-faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到AorfaeA成熟肽cDNA序列； (2)將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoRI和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA(圖I)，并對重組質粒進行序列測定； (3)GS115/faeA的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用SacI對pPIC9K_faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。
全文摘要
一種米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達。本發(fā)明提出了一種源于Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，相應的氨基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為Aor faeA。本發(fā)明還公開了產(chǎn)阿魏酸酯酶工程菌的構建以及重組阿魏酸酯酶的高效表達的方法，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12N9/18GK102978180SQ201210562540
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權日2012年12月24日
發(fā)明者鄔敏辰, 曾妍, 龔燕燕, 李劍芳 申請人:江南大學