專利名稱：烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達載體和工程菌的制作方法
烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達載體和工程菌技術領域
本發明屬于基因工程領域，具體涉及到一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶-精氨酸激酶(Arginine Kinase, AK)及其原核表達載體。
背景技術：
精氨酸激酶屬于磷酸原激酶家族中的重要一員，廣泛的存在于無脊椎動物如昆蟲、奸、蟹及軟體動物中,起著類似于脊椎動物中肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)的作用， 是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶。磷酸原激酶家族可逆催化肌酸或精氨酸與ATP之間的轉磷酰基反應，形成高磷酸化的肌酸或磷酸精氨酸。高能磷酸原在能量儲備方面起關鍵作用，因為當需要ATP再生時，可以在磷酸原激酶的催化下由磷酸原轉化而來。磷酸原不僅是一個能量儲備庫，而且在不斷耗能的體系中它是一個能量傳送體。近年來，磷酸原激酶的抑制作用研究越來越受到關注，不同來源的磷酸原激酶家族成員因其在能量代謝中的重要地位而成為研究酶抑制作用的靶目標。例如，針對有害昆蟲體內AK進行有效抑制劑的篩選，可以為開發環境友好的殺蟲劑提供新的方向。
雖然磷酸原激酶家族(包括CK和AK)在功能上有很多相似之處，但CK和AK在催化機制上有很大的差異。肌酸激酶是脊椎動物中唯一的磷酸原激酶，而精氨酸激酶是節肢動物和軟體動物中的唯一磷酸原激酶。CK通常存在于動物的骨骼肌、心肌以及腦部等組織的細胞漿和線粒體中。它不僅在脊椎動物能量代謝中起了重要作用，而且還參與了脊椎動物生命過程中的其他的一些生理活動肌漿內質網和細胞表面的離子跨膜運輸，巨噬細胞的吞噬作用，糖酵解的調控，腦神經突觸中依賴ATP的神經遞質的釋放，非肌肉細胞中有絲分裂的供能等。除此之外，CK在臨床診斷上也具有十分重要的意義。Wyss等已發現CK系統的調控紊亂與一系列的疾病相關，在肌肉、腦、心臟和腎臟相關疾病以及癌癥的發生過程中均發現了 CK系統的紊亂。當肌肉萎縮和心肌梗塞等病變發生時，人血清中CK水平迅速升高，目前認為CK的活性測定在心肌梗塞的診斷中比做心電圖更為可靠。CK重要的生理功能和臨床應用價值引起了人們的廣泛重視和深入研究。
相對于CK，目前對AK的研究還比較少。作為磷酸家族中的重要一員，AK在無脊椎動物的細胞能量代謝中起重要的作用，其廣泛分布于各種需能組織中。因此對該基因的克隆與原核表達，可以直接應用于研究該酶的結構及功能，并為其在其它方面的應用奠定基礎。發明內容
本發明的任務是提供一種烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達載體和工程菌。
實現本發明任務的方案是
本發明提供的 烏賊精氨酸激酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示， 該精氨酸激酶基因編碼的精氨酸激酶蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
本發明還提供了含有上述精氨酸激酶基因的原核表達載體，所述的原核表達載體是含有組氨酸標簽(His標簽)的原核表達載體pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7 啟動子的下游。
本發明還提供了表達上述精氨酸激酶的工程菌，它是將以上所述的重組表達載體導入到宿主菌后得到的重組菌，所述的宿主菌可以是腸桿菌BL21菌株。
本發明提供的精氨酸激酶(AK)基因來源于曼氏無針烏賊(sepiella maindroni)。本發明提供了表達烏賊AK基因的原核表達載體pET30a_AK，該載體含有AK基因，AK基因的上游有T7啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG 誘導的操作子序列，AK基因的N端和C端均帶有6XHis標簽。
本發明實驗資料
AK全長基因的克隆
(I)AK基因3’端和5’端序列的獲得
對Genbank中的一段烏賊EST序列(GT618444.1)進行生物信息學分析，結果表明該序列與其他無脊椎動物的精氨酸激酶基因同源性較高，屬于磷酸原激酶家族成員，因此命名為AK。根據該序列設計擴增所需的特異引物。其中
AK-Fl 5/ -GCGGTGTTGGTATCTATGCTTG-3'和
AK-F2 5/ -ATGGCTTCCCTCCAGTCCTCAC-3'用來擴增 AK 基因的 3'端；
AK-Rl 5/ -GTCTTGTCCTGGTTGAAGTAAAT-3'和
AK-R2 5/ -ATTGTCCACTCAGTTCACCCTC-3'用來擴增 AK 基因的 5'端。提取烏賊肝臟的總RNA，并以該RNA為模板，用M-MLV反轉錄酶合成cDNA后，使用上述引物和半巢氏 PCR技術分別擴增AK基因的3'和5'端序列。擴增產物分別經I %瓊脂糖凝膠檢測及回收后連入PMDlS-Tsimple，轉入大腸桿菌中，鑒定出陽性克隆并測序，從而分離出該基因的端和:V端序列并拼接出其全長序列。
(2) AK基因ORF序列的獲得
根據拼接的AK全長序列設計兩對引物
AK-F3 5/ -AGACGAACAGCTACGCCATGTC-3'；
AK-R3 5/ -AGCAGAGTGACGCCAGTGAG-3'；
AK-F4 5/ -CGGGATCCATGTCTGACGCCGATGAACTC-3;
(劃線處為BamHI酶切位點)；
AK-R4 5/ -CCCAAGCTTGGCAGACTTCTCCAAACGGATG-3;
(劃線處為HindIII酶切位點)。
以烏賊的cDNA為模板，然后進行巢氏PCR擴增AK基因開放閱讀框序列，經1%瓊脂糖凝膠檢測，膠回收，并將其連接到PMD18-T simple，轉入 大腸桿菌中。獲得的陽性克隆經PCR、酶切鑒定和測序。最終獲得該基因的開放閱讀框，并構建到pMD18-T simple載體中。全長1050bp，編碼349個氨基酸。
1、AK基因原核表達載體的構建
分別提取連在pMD18-T simple載體上的AK基因質粒和pET30a空載體的質粒，使用BamHI和HindIII對這兩種質粒進行雙酶切，分別獲得5^和:V末端分別帶有BamHI和 HindIII酶切位點的AK基因和pET30a空載體，瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收，然后16°C 連接16h后轉化，再經菌落PCR、酶切和測序鑒定后，最終獲得原核表達載體pET30a-AK。
2、AK基因原核表達、純化及酶活的鑒定
原核表達載體pET32a_AK用熱刺激法導入大腸桿菌蛋白表達專用受體菌株BL21 中，獲得陽性轉化子菌落。然后用IPTG進行誘導表達AK重組蛋白，并對其表達時間、IPTG 濃度和溫度條件進行優化，確定重組蛋白的最優表達條件，同時并對其進行了酶活及其反應條件的初步鑒定。實驗結果顯示該蛋白的最優表達條件為ImM IPTG于37°C誘導4h，酶活的最適反應溫度和PH值分別為30°C與8. 3。
本發明的技術優點及效果本發明中克隆的AK基因是在頭足類動物烏賊中首次擴增得到的，并對其進行了原核表達和蛋白純化，獲得了 AK的重組蛋白。這不僅將解決目前因缺乏該蛋白而無法在體外研究其分子結構和功能的問題，并為在體外研究無脊椎動物體內的能量代謝、儲存和利用奠定了基礎；而且該純化的蛋白還可以直接用作抗原來生產抗體。AK蛋白特異性抗體是檢測無脊椎動物中AK蛋白表達水平的有效工具。目前尚未有頭足類動物烏賊AK基因原核表達及制備AK抗體的報道。
圖1為本發明中烏賊總RNA的電泳檢測示意圖。
圖2為本發明用5' RACE獲得的AK基因的5'端PCR產物的1%瓊脂糖電泳圖 (A)和用3' RACE獲得的AK基因的3'端PCR產物的I %瓊脂糖電泳圖(B)，其中M是DNA Marker II ; I是AK基因相應片段的PCR產物。
圖3為本發明中AK基因全長開放閱讀框PCR產物的1%瓊脂糖電泳圖(電泳條帶1-5)。
圖4為本發明中AK蛋白與其它同源AK蛋白的系統發育分析圖。
圖5為本發明中pET30a_AK雙酶切鑒定結果(電泳條帶1_4)。
圖6重組質粒pET30a_AK結構示意圖。
圖7是本發明BL21的菌液PCR檢測電泳圖。其中M是DNA Marker III，1-13為挑取的單菌落菌液PCR的結果，14為空白對照，15-16為陽性質粒對照。
圖8粗提和純化后AK蛋白SDS-PAGE分離結果。其中1:蛋白質marker_MP204，2-3轉 pET-30a 的 BL21 (37 °C，ImM IPTG 誘導 4h)，4-5 :轉 pET30a_AK 的 BL21 (37 °C，ImM IPTG 誘導 4h)，6 -M pET30a-AK 的 BL21 (37°C，ImM IPTG 誘導 4h)全蛋白經 N1-NTA 純化樹脂層析和透析后的目標條帶。
圖9不同溫度(a)和不同pH(b)對精氨酸激酶酶活的影響。
具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。
本實施例中采用的試劑主要為分子生物學實驗試劑、各種限制性內切酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP等，各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP為日本寶生物工程有限公司(大連)產品，質粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術有限公司，其余試劑均為國產分析純，儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。
所用引物序列均在上海生工合成，本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1 :曼氏無針烏賊RNA的提取與檢測
烏賊總RNA的提取使用TRIzoL Reagent (RNA提取試劑，Invitrogen)試劑,對說明書方法稍做修改后進行。取烏賊肝臟O. lg，加入Iml的TRIzoLRNA提取液，混勻室溫靜置 5min,加入O. 2ml氯仿,振蕩混勻，4°C, 12000rpm/min離心15min。轉移上清液,加入O. 5ml 異丙醇，混勻室溫放置IOmin后12000rpm/min離心lOmin。棄上清,75%的乙醇Iml清洗沉淀兩次，4°C，7500rpm/min離心5min，干燥后用20 μ I焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解 RNA。取Iul RNA用1. 2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果(見圖1)說明提取到的RNA質量符合要求。
實施例2烏賊cDNA第一條鏈的合成
以烏賊總RNA 為模板，使用 RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (反轉錄試劑盒，Fermentas)進行 cDNA 的合成。取植物總 RNA O. 1-0. 5 μ g, Oligo (dT) 50ng, oligo (dT) I μ 1，用DEPC處理水補足至12 μ 1，混勻后，短暫離心將其收集于管底，置于65°C 水浴鍋中水浴5min，然后迅速在冰上冷卻，再加入反應混合物8μ I (5 X Reaction Buffer 4 μ I, IOmM dNTP 2 μ I, RNA 酶抑制劑 I μ I, RevertAid M-MuLV Reverse TranscriptaseIμ I)，混勻，短暫離心將其收集于管底，42°C保溫60min，然后70°C保溫5min以終止反應，-70°C保存備用。
實施例3AK cDNA全長序列的克隆
首先對Genbank中的一段烏賊EST序列(GT618444.1)進行生物信息學分析， 結果表明該序列與其他無脊椎動物的AK基因同源性較高，但是位于AK序列的中間， 因此我們根據該中間序列設計了擴增其3'與5,端序列所需的兩對特異引物。其中 AK-Fl 5 '
權利要求
1.一種來源于曼氏無針烏賊(sepiella maindroni)的精氨酸激酶基因,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
2.由權利要求1所述的精氨酸激酶基因編碼的精氨酸激酶蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.—種重組表達載體，其特征在于，它是含有權利要求1所述的精氨酸激酶基因的原核表達載體。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述的原核表達載體是含有組氨酸標簽(His標簽)的原核表達載體pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7啟動子的下游。
5.一種表達精氨酸激酶的工程菌，其特征在于，它是將權利要求3或4所述的重組表達載體導入到宿主菌后得到的重組菌。
6.根據權利要求5所述的表達精氨酸激酶的工程菌，其特征在于，所述的宿主菌是腸桿菌BL21菌株。
全文摘要
本發明公開了一種烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達載體pET30a-AK，具體涉及到一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶——精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)及其原核表達載體。本發明是利用RACE PCR技術從烏賊肝臟中克隆了AK基因的全長cDNA，然后將其蛋白編碼序列克隆到原核表達載體pET30a-AK上，并在大腸桿菌表達菌株BL21中進行了表達與純化。分離得到的重組蛋白，不僅可作為抗原用于AK抗體的制備，并對研究無脊椎動物體內的能量代謝調節規律具有重大價值。
文檔編號C12N15/70GK103060345SQ201210559059
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者何光源, 陳利紅, 張揚, 李肖, 楊廣笑, 汪越勝, 王敏, 吳常文 申請人:華中科技大學