專利名稱：一種同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物保護領域，特別涉及番茄黃化曲葉病毒、臺灣番茄曲葉病毒、廣東番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄曲葉病毒這4種病毒單獨或混合侵染引起番茄黃化曲葉病的快速檢測方法及試劑盒。
背景技術：
對于番茄黃化曲葉病毒等植物病毒的檢測鑒定，現有技術主要有2種血清學檢測方法和聚合酶鏈式反應(PCR)檢測鑒定方法。血清學檢測方法，主要包括制備抗體、病樣制備、包被檢測板、加入抗體、加標記的羊抗兔抗體、顯色反應等步驟。雖然市場上可以購買到少數植物病毒的商品化抗體，但絕大部分植物病毒的抗體還是需要研究者自己制備；另外，血清學檢測時，抗體還會與親緣關系較近的病毒存在交叉反應，產生假陽性結果。對于上述引起番茄黃化曲葉病的4種病毒尤其如此，它們的外殼蛋白較保守，其抗體與不同病毒間均存在不同程度的血清學交叉反應。因此，事先制備出待檢測病毒特異、高效價的抗體是該技術的關鍵。該技術工作量大，專業性強；同時，該鑒定過程至少需要2天，鑒定時間較長，需要購買特殊設備酶標儀。PCR檢測鑒定方法，主要包括根據已知病毒保守序列設計PCR引物、在PCR管中加入反應成分、PCR儀上進行反應及瓊脂糖凝膠電泳檢測等步驟。該方法較特異、快速、靈敏，成本也較低，需要購買PCR儀。目前利用PCR檢測一種病毒需要6小時左右，若檢測鑒定4種病毒,至少需要24小時。番爺黃化曲葉病是我國目前番爺生產上重要病害，番爺黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus, TYLCV)、臺灣番爺曲葉病毒(Tomato leaf curlTaiwan virus,ToLCTWV)、廣東番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curlGuangdong virus, TYLCGuV)和廣東番爺曲葉病毒(Tomato leaf curl Guangdongvirus,ToLCGuV)等侵染均可引起該病害。由于這些病毒侵染均引起番茄黃化、曲葉癥狀，無明顯差異，加之田間番茄常受2種或2種以上病毒混合侵染，要明確某一病樣是哪種或幾種病毒侵染引起的，用上述這二種方法中任何一種方法進行檢測與鑒定，均需要24小時以上，而且血清學檢測方法還難以鑒定到病毒種類。
發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法，這4種病毒分別為番茄黃化曲葉病毒、臺灣番茄曲葉病毒、廣東番爺黃化曲葉病毒和廣東番爺曲葉病毒。本發明的另一目的在于提供實現上述方法的試劑盒。本發明的目的通過下述技術方案實現一種同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法，所述病毒分別為番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)、臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV)、廣東番茄黃化曲葉病毒(TYLCGuV)和廣東番茄曲葉病毒(ToLCGuV)，包括如下步驟(I)設計檢測上述病毒的引物，其位置簡圖見圖1。檢測番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的引物為TYF和TYR，PCR擴增產物大小為321bp ；TYF : 5 ’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3，；TYR :5，-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3，；檢測臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV)的引物為TWF和TWR，PCR擴增產物大小為209bp ；TWF :5，-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3，；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ； 檢測廣東番茄黃化曲葉病毒(TYLCGuV)的引物為TYGF和TYGR，PCR擴增產物大小為 118bp ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；檢測廣東番茄曲葉病毒(ToLCGuV)的引物為TGF和TGR，PCR擴增產物大小為81bp ；TGF :5，-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3，； TGR : 5 ’ -TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3，。(2)采用CTAB方法提取待檢病樣品的總DNA。(3) PCR 反應以步驟(2)中提取的總DNA為模板，步驟(I)中的4對引物為引物在同一體系中進行PCR反應。(4)結果鑒別將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察，如有321bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由番茄黃化曲葉病毒侵染引起的；如有209bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由臺灣番茄曲葉病毒侵染引起的；如有IlSbp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由廣東番茄黃化曲葉病毒侵染引起的；如有81bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由廣東番茄曲葉病毒侵染引起的；如產生上述2條、3條或4條特異帶，則表明病樣品分別是由相應的2種、3種或4種病毒混合侵染引起的；如無上述任何特異條帶，則該病樣品不是4種病毒中任何I種侵染引起的。步驟(3)中所述的PCR反應體系優選為50 μ L反應體系包括2 μ L待檢病樣品的總DNA、0. 25μ L濃度為5U/y L的Taq DNA聚合酶、5 μ L IOXTaq DNA聚合酶緩沖液(Mg2+濃度為 15mM)、l μ L 濃度 IOmM 的 dNTPs、濃度為 3 μ M 的 TYF、TYR、TWF、TWR、TYGF、TYGR、TGF和TGR 8個引物各1. 5 μ L，滅菌雙蒸水29. 75 μ L0步驟(3)中所述的PCR反應的條件優選為94°C預變性8min ;94°C變性30sec、60°C退火45sec、72°C延伸45sec，32個循環；72°C最終延伸lOmin。步驟(4)中所述的瓊脂糖凝膠電泳優選為在質量體積百分比為(w/v)1. 5 2. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，100 125V恒壓電泳35 50min。實現上述方法的試劑盒，包括Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶緩沖液和引物。所述引物分別為
TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；TYR :5，-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3，；TWF :5，-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3，；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；TYGF :5，-TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3，；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；TGF :5，-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3，；TGR : 5，-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3，。 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)快速簡便本發明的方法鑒定周期為4小時內，而且非專業人員均可操作，鑒定方法適應性強；而無論是傳統的血清學檢測鑒定方法或單一 PCR檢測鑒定方法，其周期均較長，二者均至少需要24小時以上。(2)準確本發明是根據4種病毒的基因組序列設計特異的PCR引物，鑒定結果準確可靠；而血清學檢測方法，由于本發明所說的4種病毒的外殼蛋白較保守，它們之間或多或少存在血清學反應，實際檢測中無法確定一個病樣品具體是由哪一種病毒侵染引起的，難以定論。(3)低成本本發明所使用的材料均較低廉，所用的PCR儀目前在國內已很普及，PCR所用的酶、瓊脂糖等試劑和藥品均是開放式，可以在多家公司購買到，鑒定一個樣品的成本在9. 5元以內；血清學檢測方法，由于需要每種病毒的特異性抗體，而非專業技術人員難以制備出某一病毒的抗體，如向專業試劑公司購買抗體，其價格十分昂貴，檢測一個樣本約24元左右。單一 PCR檢測，其成本較本發明至少增加4倍。
圖1是4種病毒的基因組結構及特異引物位置簡圖。圖2是檢測4種病毒侵染引起的番茄黃化曲葉病的工藝流程圖。圖3是實施例2的PCR產物電泳檢測圖。圖4是實施例3的PCR產物電泳檢測圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1引物的設計根據引起番茄黃化曲葉病的4種病毒番茄黃化曲葉病毒(TYLCV，國際GenBank登錄號為JQ867092)、臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV，國際GenBank登錄號為DQ237918)、廣東番茄黃化曲葉病毒(TYLCGuV，國際GenBank登錄號為AY602166)和廣東番茄曲葉病毒(ToLCGuV,國際GenBank登錄號為AY602165)的基因組序列，設計了了 4對特異引物，其位置簡圖見圖1。檢測番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的引物為TYF和TYR，PCR擴增產物大小為321bp ；TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；
TYR :5’ -TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’ ；檢測臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTffV )的引物為TWF和TWR，PCR擴增產物大小為209bp ；TWF :5’ -TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’ ；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；檢測廣東番茄黃化曲葉病毒(TYLCGuV)的引物為TYGF和TYGR，PCR擴增產物大小為 118bp ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；檢測廣東番茄曲葉病毒(ToLCGuV )的引物為TGF和TGR，PCR擴增產物大小為81bp ；TGF : 5 ’ -TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3，；TGR : 5，-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3，。實施例2對已知病樣品的檢測與鑒定已知病樣品包括TYLCV、ToLCTWV、TYLCGuV和ToLCGuV單獨侵染的病樣各I份，TYLCGuV和ToLCGuV混合侵染的番茄病樣品I份，另取一份健康番茄樣品作對照。檢測鑒定4種病毒侵染引起的番茄黃化曲葉病的方法流程圖如圖2所示。(I)提取番爺樣品總DNA用無菌的新刀片從待檢樣品的葉片上取IOOmg葉組織，液氮研磨成粉末，置1. 5mL離心管中；加入65°C預熱的500 μ L番茄病樣總DNA提取緩沖液，該緩沖液成分包括2%(w/v) CTAB,1. 4M NaCl、0. 02M EDTA、0. OlM Tris-HCl，使用前加入 O. 2% (v/v)巰基乙醇；置于65°C水浴40分鐘；加入500yL氯仿異戊醇(體積比為24:1)，輕輕旋轉搖勻，4°C、12000rpm離心15分鐘；吸取450 μ L上清液到一支新的1. 5mL離心管中，加入50 μ L的3mol/L NaAc (pH 5. 2)、1000 μ L預冷的無水乙醇，混勻后放置于_20°C 20分鐘以上，然后40C、12000rpm離心15分鐘；棄上清液，加入ImL 70%乙醇(體積百分比)漂洗沉淀2 3次；4°C、12000rpm離心10分鐘；倒去液體，倒置離心管于滅菌的吸水紙，室溫下干燥DNA ;加入40 μ L TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 8. 0)，并在37°C中保溫直至DNA完全溶解。(2) PCR 反應配制PCR反應體系，50 μ L反應體系包括2 μ L上述番茄樣品總DNA溶液、O. 25 μ L濃度為5U/yL的Taq DNA聚合酶、5 μ LPCR IOXTaq DNA聚合酶緩沖液(Mg2+濃度為15mM)、I μ L 濃度為 IOmM 的 dNTPs、濃度分別為 3 μ M 的上述引物(TYF、TYR、TWF、TWR、TYGF, TYGR、TGF和TGR)各1. 5 μ L，加滅菌的雙蒸水29. 75 μ L至總體積為50 μ L。PCR 反應條件為94°C預變性 8min，94°C變性 30min、60°C退火 30sec、72°C延伸45sec，32個循環，72°C最終延伸lOmin。(3)結果鑒別PCR反應結束后，取各反應產物10 μ L分別點樣于質量體積百分比為(w/v)l. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，進行電泳，125V恒壓電泳45min ;在凝膠成像系統中觀察，并拍照；根據電泳結果做出判定。電泳結果如圖3 所示1 :標準分子量(DL1000);2-6 :以 TYLCV、ToLCTWV、TYLCGuV、ToLCGuV及TYLCGuV和ToLCGuV復合侵染的番茄植株葉片總DNA為模板進行PCR反應結果；7 :陰性對照(以健康番茄植株葉片總DNA為模板進行PCR反應結果)；8 :標準品(以包含4種病毒全長的質粒混合物為模板進行PCR反應結果)。分別以4種病毒單獨或混合侵染的番茄病樣葉組織的總DNA溶液為模板，可成功地擴增到預期大小為321bp、209bp、118bp和Slbp的特異目的片段，這些片段大小與以標準品為模板擴增出的片段大小一致，而作為對照的健康番茄樣品未出現特異擴增條帶，說明該檢測方法是準確可靠的。實施例3對未知病樣品的檢測與鑒定試驗對來自廣東多個地區采集到的10份番茄樣品進行取樣，共取得10個樣品并進行編號，各號樣品所對應的采集地點以及癥狀表現等信息見表I。檢測鑒定所采用的方法同實 施例2所用方法相同，并用單一 PCR (單一 PCR反應體系中只分別加入上述4對引物中的I對引物，其余條件與實施例2相同)對每個樣品進行檢測，加以比較驗證。結果如圖4及表I所示，圖4中M :標準分子量(IOObp梯度)；1 10 :分別為汕頭市澄海、廣州市增城、肇慶市高要、肇慶市高要、廣州市花都、廣州市花都、佛山市三水、廣州市增城、茂名市信宜和廣州市白云等來源的待檢樣品；11 :標準品(以包含4種病毒全長的質粒混合物為模板進行PCR反應結果)。待檢的10個樣品中1、2、9號樣品中含有ToLCTWV，4、10號樣品中含有TYLCGuV，5號樣品中含有ToLCGuV，7號樣品中含有TYLCV，說明這些病樣是由這些病毒分別侵染引起的；而6號樣含有TYLCGuV和ToLCGuV，說明是由這2種病毒復合侵染引起的；而3號和8號樣品為陰性，即該樣品中不含TYLCV、ToLCTWV、TYLCGuV和ToLCGuV 4種病毒，不是由這4種病毒侵染引起的不正常。上述結果與單一 PCR檢測結果一致。表I應用本發明方法檢測與鑒定不同來源待檢番茄樣品的結果
樣品編號~I癥狀表現 [HlI檢測結果
1黃化、卷曲汕頭市澄海 ToLCTWV
2黃化、卷曲廣州市增城 ToLCTWV
3輕微黃化肇慶市高要 ~
4黃化、卷曲肇慶市高要 TYLCGuV
5黃化、皺縮廣州市花都 ToLCGuV
6黃化、曲葉廣州市花都 TYLCGuV+ToLCGuV
7黃化、皺縮佛山市三水 TYLCV
8廣州市增城 ~
9黃化、卷曲茂名市信宜 ToLCTWV
10黃化、卷曲廣州市白云 TYLCGuV上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之 內。
權利要求
1.一種同時檢測引起番爺黃化曲葉病4種病毒的方法,所述病毒分別為番爺黃化曲葉病毒、臺灣番爺曲葉病毒、廣東番爺黃化曲葉病毒和廣東番爺曲葉病毒，其特征在于包括如下步驟(1)設計檢測上述病毒的引物檢測番茄黃化曲葉病毒的引物為TYF和TYR，PCR擴增產物大小為321bp ；TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；TYR :5’ -TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’ ；檢測臺灣番茄曲葉病毒的引物為TWF和TWR，PCR擴增產物大小為209bp ；TWF :5’ -TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’ ；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；檢測廣東番茄黃化曲葉病毒的引物為TYGF和TYGR，PCR擴增產物大小為118bp ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；檢測廣東番茄曲葉病毒的引物為TGF和TGR，PCR擴增產物大小為81bp ；TGF :5’ -TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’ ；TGR :5’ -TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’ ；(2)采用CTAB方法提取待檢病樣品的總DNA；(3)PCR反應以步驟(2)中提取的DNA為模板，步驟(I)中的4對引物為引物在同一體系中進行PCR反應;(4)結果鑒別將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察，如有321bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由番茄黃化曲葉病毒侵染引起的；如有209bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由臺灣番茄曲葉病毒侵染引起的；如有IlSbp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由廣東番茄黃化曲葉病毒侵染引起的；如有81bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由廣東番茄曲葉病毒侵染引起的；如產生上述2條、3條或4條特異帶，則表明病樣品分別是由相應的2種、3種或4種病毒混合侵染引起的；如無上述任何特異條帶，則該病樣品不是4種病毒中任何I種侵染引起的。
2.根據權利要求1所述的同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法，其特征在于步驟(3)中所述的PCR反應體系為50 μ L反應體系包括2μ L待檢病樣品的總DNA、O.25 μ L濃度為5U/y L的Taq DNA聚合酶、5 μ L IOXTaq DNA聚合酶緩沖液、I μ L濃度IOmM的dNTPs、濃度為3μΜ的上述引物各1. 5 μ L、滅菌雙蒸水29. 75 μ L0
3.根據權利要求1所述的同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法，其特征在于步驟(3)中所述的PCR反應的條件為94°C預變性8min ;94°C變性30sec、60°C退火45sec、72°C延伸 45sec，32 個循環；72°C最終延伸 IOmin0
4.根據權利要求1所述的同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法，其特征在于步驟(4)中所述的瓊脂糖凝膠電泳為在質量體積百分比為1. 5 2. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，100 125V恒壓電泳35 50min。
5.實現權利要求1 4任一項所述的同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶緩沖液和引物； 所述引物分別為TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；TYR :5’ -TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’ ；TWF :5’ -TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’ ；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；TGF :5’ -TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’ ；TGR :5’ -TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測引起番茄黃化曲葉病4種病毒的方法及試劑盒，這4種病毒分別為番茄黃化曲葉病毒、臺灣番茄曲葉病毒、廣東番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄曲葉病毒，屬于植物保護領域。本發明設計了4對特異引物，通過提取待檢病樣品的總DNA，以所提DNA為模板、4對特異引物為引物在同一個體系中進行PCR反應，對PCR產物進行檢測，根據PCR產物片段大小即可鑒別待檢病樣品是何種病毒侵染引起。本發明快速簡便、準確、成本低，可同時檢測出引起番茄黃化曲葉病的4種病毒，可應用到實際生產中，對植物病樣進行準確有效地快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103014179SQ201210554759
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者何自福, 杜振國, 湯亞飛, 佘小漫 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所