拮抗抑制血管內皮細胞生長因子與其受體結合的單克隆抗體及其編碼序列與用途

拮抗抑制血管內皮細胞生長因子與其受體結合的單克隆抗體及其編碼序列與用途
【專利摘要】本發明公開了一種拮抗抑制血管內皮細胞生長因子（VEGF）與其受體（VEGF-R）結合的小鼠單克隆抗體及其重鏈可變區與輕鏈可變區氨基酸序列。本發明還公開了該抗體的人源化制備過程及該人源化抗體重鏈可變區與輕鏈可變區氨基酸序列。該人源化抗體或其衍生體可作為藥物組合物成分或制備成合適藥物制劑，單獨給藥或與化療藥物等其他治療手段合并使用，用于廣譜治療結腸癌、乳腺癌、橫紋肌肉瘤等各種實體瘤。
【專利說明】拮抗抑制血管內皮細胞生長因子與其受體結合的單克隆抗體及其編碼序列與用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術單克隆抗體領域。本發明涉及一種可拮抗抑制血管內皮細胞生長因子(VEGF)與其受體(即VEGF-R)結合的單克隆抗體及其用途。
【背景技術】
[0002]血管新生或增生(angiogenesis)在生物學上是指體內的已存在的血管(如毛細血管和微小動、靜脈)通過出芽或分裂的方式而產生新的血管的過程。血管新生在維持機體的許多正常的生理過程如組織胚胎發育、外傷傷口的癒合與修復等是有益的和必需的。但過度的血管新生或增生也與許多病理變化(如腫瘤的增生擴散、炎癥等)息息相關。體內的血管能夠不斷地增生與增長的關鍵是其內襯的血管內皮細胞具有不斷分裂增生及定向遷移置入已有的血管管壁的能力。血管內皮細胞生長因子(vascular endothelialgrowthfactor, VEGF)則是已知的最重要及最強烈的促血管內皮細胞分裂增生及血管增長的因子。VEGF在血管增生中的重要性已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被充分證實:因為只要當VEGF基因中的一份被敲除后，小鼠胚胎在僅發育至11至12天時就會因血管增生受阻及異常而死亡(Carmeliet P 等 Nature 1996, 380:435;Ferrara N 等 Nature 1996,380:439)。
[0003]VEGF在多種惡性腫瘤組織中(如結直腸癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、多發性骨髓瘤等)呈過度表達，且其表達水平高低與腫瘤生長與轉移復發程度呈高度正相關(DvorakHF 等 J Exp Medl991;174:1275-8 ；Brown LF 等 Cancer Res 1993;53:4727-35 ；ffeidnerN, Semple JP, Welch WR 及 Folkman J:N Engl J Med 1991 ;324:1-8.4-5)。近年來國內外一系列動物試驗及臨床實踐已證明:通過基因調控或給予外來藥物來阻斷體內VEGF及其受體(VEGF-R)介導的促血管增生，則可導致腫瘤組織因缺血而壞死，從而達到抑制腫瘤生長和轉移及延長患者生存期的良好療效。因此，以VEGF及其受體為靶點的抗腫瘤血管增生藥物已成為當今國內外藥物研發競爭熱點。
[0004]在以VEGF及其受體為靶點的抗腫瘤血管增生藥物的開發上，目前主要有兩大模式:
[0005]模式一是研制拮抗VEGF受體(VEGF-R)中位于細胞膜內的酪氨酸蛋白激酶活性的抑制劑，這類拮抗抑制劑一般都屬于小分子化學類藥，其中的代表性藥物為2006年由美國Pfizer (輝瑞)開發上市的Sutent (舒尼替尼)；及由德國Bayer (拜耳)與美國OnyxPharmaceuticals 開發上市的 Nexavar0
[0006]模式二是研制可直接阻斷VEGF與其受體(VEGF-R)結合的抗體或抗體Fe融合蛋白等大分子蛋白類生物制劑。該類代表性藥物為由Roche/Genentech公司研發生產并于2004年2月獲美國FDA批準上市的人源化抗VEGF單克隆抗體藥Bevacizumab(貝伐單抗)，商品名Avastin(阿瓦斯丁)。Avastin是目前為止全球市場上唯一的一個抗VEGF單克隆抗體藥物。Avastin通過與體內VEGF的高度特異結合，從而阻止VEGF與其受體的結合,進而達到阻斷血管增生與抑制腫瘤增生的療效(Presta LG等Cancer Res, 1997, 57:4593; Hurwitz H等N Engl J MeddOCMJSOJSSSXAvastin目前已獲美國FDA批準用于治療轉移性結腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)、晚期月市癌(advanced non-squamous non - smallcel I lung cancer, NSCLC)、腦膠質瘤(glioblastoma)、轉移性腎癌(metastatic kidneycancer, mRCC)等多種實體瘤。Avastin 2010年2月獲中國SFDA批準用于治療結腸癌。
[0007]Avastin其前身可追溯到代號為A4.6.1的小鼠單克隆抗體。該小鼠單克隆抗體的來源及分泌它的雜交瘤細胞系與用途在專利號為US6，582，959的美國專利(發明人:Kim, Kyung Jin,專利授權日期:June 24，2003,專利名稱:Antibodies to vascularendothelial cell growth factor);及專利號為 US7, 227，004 的美國專利(發明人:Kim,Kyung Jin 專利授權日期:June 5，2007,專利名稱:Antibodies to vascularendothelialcell growth factor)中都有所描述。該鼠源抗體及其人源化抗體rhuMab_VEGF (即Avastin)的序列及其制備方法在專利號為US6, 054, 297的美國專利(發明人:Carter;PaulJ.及Presta; LeonardG,專利 申請日期::May 9,1995,專利授權日期:April 25,2000,專利名稱:Humanized antibodiesand methods for making them)公開并在國際期刊雜志上發`表(Presta LG 等 Cancer Res,1997,57:4593)。
[0008]但該抗體還存在如下不足:
[0009]I)與大多數的單克隆抗體一樣，小鼠單克隆抗體A4.6.1及其人源化抗體Avastin也僅只是能結合VEGF抗原表位中的部分位點，無法結合或涵蓋VEGF抗原表位中眾多的其他位點。
[0010]2)先前在動物實驗中及近年來的臨床研究中發現僅單獨給予小鼠單克隆抗體A4.6.1或Avastin抗體,無法達到完全中和抑制體內VEGF及其介導的促血管新生。
[0011]因此，研制具有新的VEGF結合位點的，且可拮抗抑制VEGF與其受體(VEGF-R)結合的全新單克隆抗體或藥物制劑顯得很有意義與必要。

【發明內容】

[0012]本發明要解決的技術問題是提供一種拮抗抑制血管內皮細胞生長因子(VEGF)與其受體(VEGF-R)結合的抗體或其衍生體。該抗體包括人源化抗體或其衍生體如抗體Fab片段、單鏈抗體等。
[0013]本發明的另一個要解決的技術問題是提供編碼上述抗體的DNA分子或基因。
[0014]本發明的另一個要解決的技術問題是提供含有上述抗體的藥物組合物。
[0015]本發明的還一個要解決的技術問題是提供制備上述抗體的方法。
[0016]為解決上述技術問題，本發明一方面提供了一種拮抗抑制血管內皮細胞生長因子(VEGF)與其受體(VEGF-R)結合的鼠源單克隆抗體，該抗體的特征是其輕鏈可變區具有SEQID N0.:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID N0.:2所示的氨基酸序列。該鼠源單克隆抗體來源于代號為PV19-5的小鼠雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株已于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號為CGMCC No 5889.保藏地點:中國，北京)。此外，本發明還提供編碼上述鼠源單克隆抗體的DNA分子，其輕鏈可變區具有SEQ ID N0.:3所示的核苷酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID N0.:4的核苷酸序列。
[0017]本發明另一方面提供了來源于上述鼠源單克隆抗體的人源化單克隆抗體。與鼠源單克隆抗體相比，人源化單克隆抗體作為治療藥物具有在人體中半衰期長(可長達20天)及免疫原性低等優點，便于長期或反復多次體內使用。本發明中將上述鼠源單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區基因都進行了人源化改造，其中包括框架區和抗原結合區域/互補決定區臨近位點的氨基酸置換。該人源化單克隆抗體的特征是其輕鏈可變區具有SEQ IDN0.:5所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID N0.: 6所示的氨基酸序列。此外，本發明還提供編碼該人源化單克隆抗體可變區的DNA分子。其輕鏈可變區具有SEQ ID N0.:7所示的核苷酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID N0.:8的核苷酸序列。
[0018]本發明的第三方面是提供上述人源化單克隆抗體的衍生體，其特征是該衍生體的輕鏈抗原互補決定區(complementarity-determining regions, CDR-L)包含 SEQ ID N0.:9，SEQ ID N0.:10及SEQ ID N0.:11的氨基酸序列，其重鏈抗原互補決定區(⑶R-H)包含SEQ ID N0.:12, SEQ ID N0.:13 及 SEQ ID N0.: 14 的氨基酸序列。
[0019]本發明第四方面是提供了一種表達載體，它含有編碼上述人源化單克隆抗體的DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。
[0020]本發明第五方面提供了一種重組宿主細胞，它由上述表達載體轉化而成。該重組宿主細胞或其子代細胞表達上述人源化單克隆抗體。
[0021]本文所采用的術語“單克隆抗體(單抗)”指從一純系細胞得到的免疫球蛋白，具有相同的結構和化學特性，對單一抗原決定簇有特異性。單克隆抗體與常規多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤或重組工程細胞培養獲得，不會混雜有其它免疫球蛋白。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
`[0022]本文所采用的術語“人源化單克隆抗體”系將鼠源單克隆抗體的氨基酸序列除保留互補決定區(⑶R)外，其它序列(包括可變區中的框架區序列)全部或大部分替換成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以達到通過基因工程手段最大限度地降低鼠源性單克隆抗體的免疫原性。
[0023]本文所用的術語“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結構特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)。其后是多個恒定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一個恒定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。
[0024]本文所用的術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中于輕鏈和重鏈可變區中成為互補決定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為構架區(Frameworkregions, FR)。抗體重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β -折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR—起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH Publ.N0.91-3242，卷1，647-669頁(1991))。抗體恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性(ADCC)或補體介導毒性(CDC)。
[0025]本發明的抗體通常可以通過以下方法來制備。
[0026]首先，將含有編碼本發明的抗體的基因插入到含有合適的表達調控序列的表達載體中。
[0027]本文所用的術語“表達調控序列”通常指參與控制基因表達的序列。表達調控序列包括與目標基因操作性相連的啟動子和終止信號。編碼本發明抗體的基因(DNA)序列可用本領域技術人員熟知的常規手段，如根據本發明公開的蛋白質序列人工合成或用PCR法擴增得到。其后可用本領域熟知的各種方法將合成或PCR擴增得到的DNA片段插入到合適的表達載體中。本發明中所用的表達載體可以是本領域技術人員已知的市售表達載體，如Invitrogen公司的ρΟ)ΝΑ3.I表達載體。
[0028]用于接納表達載體轉化的合適宿主細胞一般包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。在本發明中，較佳的宿主細胞是哺乳動物細胞，尤其是中華倉鼠卵巢(CHO)細胞。
[0029]表達載體轉化的宿主細胞在合適的條件下(如以無血清培養基在細胞培養瓶或生物反應器中貼壁或懸浮培養)培養后，收獲培養上清液，然后用包括protein-A親和層析、離子交換層析、過濾等本領域技術人員熟知的常規分離步驟或手段純化得到本發明的抗體。
[0030]純化得到的本發明抗體可以溶于適當的溶劑如生理鹽水或PBS液體中，理想的最終溶度可以制備成0.1至100mg/ml之間。
[0031]本發明第六方面提供了一種藥物組合物，它含有藥學上有效量的如本發明中描述的人源化單克隆抗體或其衍生體以及藥學上可接受的載體。
[0032]本文所用的術語“藥學上可接受的”是指當該抗體和組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生過敏或其它不良反應。本文所用的“藥學上可接受的載體”應當與本發明的抗體蛋白相容，即能與其共混而不會大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子包括糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ;穩定劑；抗氧化劑；無熱原無菌注射用水；生理鹽水溶液；磷酸鹽緩沖劑等。
[0033]本發明的藥物組合物可根據需要制成各種劑型如凍干粉劑、注射劑、滴眼劑等給藥，并可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。
[0034]本發明第七方面提供了上述藥物組合物在制備治療與血管增生相關的疾病的藥物制劑中的應用。在本發明的具體實施實例中，描述了該人源化抗體在體內抑制人結腸癌、乳腺癌、橫紋肌肉瘤等多種移植腫瘤生長的應用。
[0035]本發明第八方面是提供制備上述人源化單克隆抗體的方法，該方法包括如下步驟:
[0036]a)提供一表達載體，該表達載體含有編碼所述人源化單克隆抗體的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列；[0037]b)用步驟a)所述的表達載體轉化宿主細胞；
[0038]c)在適合所述人源化單克隆抗體表達的條件下培養步驟b)所得的宿主細胞:和
[0039]d)從該宿主細胞培養液中分離純化獲得所述人源化單克隆抗體。
[0040]為獲得可拮抗抑制人VEGF蛋白與其受體(VEGF-R)結合的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系，本發明選取由酵母表達的重組人VEGF165蛋白為免疫抗原，通過反復多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌高效價的抗VEGF多克隆抗體；再從中挑取小鼠，取其脾臟細胞，通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合、再經藥物篩選及亞克隆等步驟而建立了多株穩定分泌抗人VEGF抗體的雜交瘤單克隆細胞。其中一代號為PV19小鼠雜交瘤細胞株，經ELISA、免疫印跡、免疫組化等多種方法鑒定，證實其所分泌的單克隆抗體能夠特異識別并高親合力結合人VEGF(包括VEGF121、165及VEGF189等主要亞型)。體外測試表明該鼠源單克隆抗體可高效抑制VEGF與其受體(VEGF-R)的結合。在人類移植腫瘤裸鼠模型上的測試結果還表明該鼠源單克隆抗體能有效抑制乳腺癌、橫紋肌肉瘤等多種腫瘤在體內的生長。
[0041]本發明通過蛋白分離純化及基因工程等手段獲得了編碼該鼠源抗體的重鏈及輕鏈可變區基因，并在此基礎上完成了該抗體的人源化改造。人源化改造后的抗體基因插入表達載體(P⑶NA3.1)后轉入中華倉鼠卵巢(CHO)細胞，獲得重組工程細胞，并從重組工程細胞培養液中分離純化得到具拮抗腫瘤體內增長生物活性的人源化抗體蛋白。該人源化抗體可作為藥物組合物成分或制備成合適藥物制劑，單獨給藥或與化療藥物等其他治療手段合并使用，用于廣譜治療結腸癌、乳腺癌、橫紋肌肉瘤等各種實體瘤。
[0042]本發明還公開了該抗體的人源化制備過程及該人源化抗體重鏈可變區與輕鏈可變區氨基酸序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1為本發明實施例1中以重組人VEGF165蛋白包板，以ELISA法檢測小鼠雜交瘤細胞(PV19)培養上清液與重組人VEGF蛋白結合的實驗結果示意圖。其中，M23為已知分泌抗人VEGF單抗的雜交瘤細胞上清液，為陽性對照。P16為非相關雜交瘤細胞培養上清液，為陰性對照；SP2/0代表未融合的骨髓瘤細胞培養上清液。
[0044]圖2為本發明實施例2中以SDS-PAGE分析鑒定從PV19瘤細胞的培養上清液中經親合層析柱純化獲得的鼠源PV19單克隆抗體蛋白。圖2中，泳道I為DTT還原的PV19抗體蛋白；泳道2為未還原的PV19抗體蛋白；Marker為蛋白質分子量標志。
[0045]圖3為本發明實施例3中競爭性ELISA結果的代表性示意圖。其中的mPV19&Biotin-VEGF為PV19鼠源抗體組，WlO&Biotin-VEGF為非相關的抗體組，作為陰性對照。
[0046]圖4為本發明實施例8中以SDS-PAGE分析鑒定從培養上清液中經親合層析柱純化獲得的人源化hPV19單克隆抗體蛋白。圖2中，泳道I為DTT還原的hPV19抗體蛋白；泳道2為未還原的hPV19抗體蛋白；Marker為蛋白質分子量標志。
[0047]圖5為本發明實施例8中以直接ELISA法比較由表達上清中純化獲得的人源化抗體(hPV19)、嵌合抗體(chPV19)及鼠源抗體UPV19)與人VEGF165蛋白結合的相對活性結果示意圖。其中的chP16為非相關嵌合抗體，作為陰性對照。
[0048]圖6為本發明實施例8中以競爭ELISA法比較人源化抗體(hPV19)、嵌合抗體(chPV19)及鼠源抗體(mPV19)體外阻斷生物素標記的人VEGF165蛋白(bio_VEGF)與其受體(VEGFRl)結合的相對活性的結果示意圖。其中的WlO為非相關嵌合抗體，作為陰性對照。
[0049]圖7為本發明實施例9中以ELISA法比較分析人源化hPV19抗體及Avastin抗體與野生型(VEGF165)及點突變型人VEGF蛋白(VEGF-G88/A)的結合活性的結果示意圖。
[0050]圖8A及圖8B為本發明實施例10中人源化hPV19單克隆抗體在裸鼠體內抑制人Ls-174-T結腸癌生長的實驗結果示意圖。其中圖8A為實驗期間各組相對腫瘤體積增長趨勢圖；圖88為實驗結束時與陰性對照組相比，各治療組平均腫瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)。
[0051]圖9A及圖9B為本發明實施例11中人源化hPV19單克隆抗體在裸鼠體內抑制人MD231-MBA乳腺癌生長的實驗結果示意圖。其中圖9A為實驗期間各組相對腫瘤體積增長趨勢圖；圖98為實驗結束時與陰性對照組相比，各治療組平均腫瘤瘤重下降率(瘤重抑制
率％)。
[0052]圖1OA及圖1OB為本發明實施例12中人源化hPV19單克隆抗體在裸鼠體內抑制人人A673橫紋肌瘤結果示意圖。其中圖1OA為實驗期間各組相對腫瘤體積增長趨勢圖；圖1OB為實驗結束時與陰性對照組相比，各治療組平均腫瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)。
[0053]圖1lA及圖1lB為本發明實施例13中人源化hPV19單克隆抗體在裸鼠體內抑制人HCT8結腸癌結果示意圖。其中圖1lA為實驗期間各組相對腫瘤體積增長趨勢圖；圖1lB為實驗結束時與陰性對照組相比，各治療組平均腫瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)。
[0054]代號為PV19-5的小鼠雜交瘤細胞株已于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微`生物中心(保藏編號為CGMCCN0.5889 ;保藏地點:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)。
【具體實施方式】
[0055]下面將結合實施實例來進一步描述本發明，這些實施例只是為了起說明作用，而不是用來限制本發明。
[0056]實施例1:分泌抗血管內皮細胞生長因子抗體的小鼠雜交瘤細胞系的建立與篩選鑒定
[0057]步驟1.重組人VEGF165蛋白(免疫抗原)的制備
[0058]利用PCR技術從人肺組織細胞cDNA文庫中擴增得到編碼人VEGF165完整開放讀碼框架序列(openreading frame, 0RF)的基因片斷,經序列測定鑒定正確,用限制性內切酶處理后，將其克隆到酵母表達載體pPic9K(Invitrogen公司)載體中，獲得重組表達質粒pPic9K-VEGF165，用其轉化畢赤酵母菌后，篩選出高效表達酵母菌。酵母菌經發酵、誘導表達，分離純化后，獲得純度95%以上的重組人VEGF165蛋白。
[0059]步驟2、動物免疫
[0060]將上述純化的重組人VEGF165蛋白與弗氏完全佐劑混合，于皮下多點注射Balb/c小鼠(100 μ I/只，共IOyg VEGF165蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再給予皮下多點注射含VEGF165蛋白與不完全佐劑的混合物，加強免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被人VEGF165蛋白的96-板以ELISA法檢測小鼠血清中抗VEGF蛋白抗體的效價，取效價高者小鼠的脾細胞用于下一步的細胞融合。[0061]步驟3、細胞融合
[0062]在末次免疫后3天，無菌制備小鼠脾細胞懸液，與小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞(購自中國科學院上海生命科學院細胞保藏中心)，以5:1的比例在50%PEG-1000 (Sigma公司產品)作用下融合。融合按常規法(KohlerG.and Milstein CiNature 1975; 256:495-497)，PEG用量lml，I分鐘內緩慢加完。反應90秒后，以無血清的RPM1-1640培養基終止反應，1000rpm離心10min，去除上清液，再將離心沉淀下的細胞以含10%HAT(H為次黃嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，為Sigma公司產品)的RPMI 1640_10%FCS培養基將細胞濃度調節至I X IO6/ml，加入96孔平底細胞培養板(每孔200μ 1)，于37°C，5%C02培養箱中培養2_3周。
[0063]步驟4、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)篩選抗體分泌陽性的小鼠雜交瘤細胞[0064]以重組人VEGF165 蛋白(2μ g/ml，pH 9.6,0.1M NaHC03 液)包被酶標板，37°C包被2小時或4°C過夜；2%牛血清白蛋白(BSA) 4°C封閉過夜。經PBS-0.l%Tween20液洗滌后加入待檢雜交瘤細胞培養上清(以未融合的SP2/0骨髓瘤細培養上清為陰性對照)37°C孵育2小時；經PBS-0.l%Tween20液洗滌后，加入辣根過氧化物酶(HRP)-標記的羊抗小鼠IgG(Sigma公司產品)，37°C孵育I小時；再經PBS-0.l%Tween20液充分洗滌后，加入鄰苯二胺(OPD) -0.1%H202 底物液顯色 10-15min,以 0.1M HCl 終止反應。在 MK3_Multiskan 酶標儀(Thermo Scientific公司產品)中讀取492nm處OD值。測得的OD 492值比陰性對照高5-10倍的雜交瘤細胞再克隆化，并進行擴增凍存。
[0065]步驟5、陽性雜交瘤細胞的亞克隆-有限稀釋法
[0066]將上述初篩得到的陽性細胞以RPM1-1640_10%FCS培養基稀釋至每孔1_10個細胞，鋪于96-孔細胞培養板，于37°C，5%C02培養箱中培養2_3周。待克隆長成，取上清液以ELISA再次檢測鑒定抗VEGF抗體的分泌。經檢測鑒定，獲得多個抗體分泌陽性細胞株。其中，經再次亞克隆鑒定，獲得了一株代號為P19-5(簡稱PV19)的穩定分泌抗VEGF單克隆抗體的雜交瘤細胞株。圖1為以ELISA法檢測鑒定PV19雜交瘤細胞上清液與重組人VEGF165蛋白結合，結果證明該雜交瘤細胞上清液含高效價抗人VEGF165蛋白的抗體。該抗體經鑒定為IgG類。該雜交瘤細胞株再經大量擴增，長期傳代培養并于2012年03月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號為CGMCC No 5889.保藏地點:中國，北京)。
[0067]實施例2.鼠源抗人VEGF單克隆抗體(PV19)的體外制備及純化
[0068]本實施例中，鼠抗人VEGF單克隆抗體(PV19)的分離純化采用親合層析法。
[0069]其純化步驟如下:
[0070]將PV19雜交瘤細胞擴增后，接種于200ml無血清的1640培養基中，37 °C培養5天，隨后收集培養上清，經過0.45 μ m濾膜過濾后上樣至含Protein G-Sepharose FastFlow (購自通用電氣GE公司)親合層析柱；層析柱先以PBS液漂洗去除雜蛋白后，再以低pH(2.7-3.0)甘氨酸(0.1M)液洗脫被吸附的PV19抗體蛋白。洗脫液以lmol/L Tris (pH
8.5-9.0)調節pH至7.0，再對10倍體積的PBS液透析12~16后(期間換液2_3次)，透析后的樣品再經0.45 μ m濾膜過濾后即獲得純化的PV19抗體。
[0071]將純化的PV19抗體按常規方法在DTT還原及未還原條件下進行經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)(分離膠為10%，濃縮膠5%)。圖2為該電泳分析結果圖譜，其中泳道I為DTT還原的PV19抗體，泳道2為未還原的PV19抗體。如圖2所示:與未還原的PV19抗體樣品相比后，DTT還原的PV19抗體分離為2條主帶，其中處于上面的條帶為PV19抗體重鏈，處于下面的條帶為PV19抗體輕鏈。
[0072]實施例3鼠源PV19單克隆抗體生物活性測定:競爭性ELISA法檢測鑒定鼠源PV19單克隆抗體體外阻斷VEGF與其受體的結合
[0073]鼠源PV19單克隆抗體的生物活性測定方法之一是競爭性ELISA法檢測鑒定抗體體外阻斷VEGF與其受體的結合。該競爭性ELISA法的基本原理與過程是先將生物素標記的人VEGF165蛋白與不同溶度的單克隆抗體混合，之后再將混合物轉入預先包被有重組可溶性VEGF受體蛋白(如可溶性VEGFRl蛋白)的96-孔板，經孵育及洗脫后，加入酶標記的Avidin (如辣根過氧化物酶標記的Avidin)。再經孵育及洗脫后，加入底物顯示并測定OD值。
[0074]檢測具體步驟如下:
[0075]1)用重組可溶性人VEGFRl蛋白(美國R&D公司產品)包被96-孔板(2yg/ml，50y I/孔)，4°C過夜；
[0076]2)經PBS液漂洗及2%BSA(稀釋在PBS_0.l%tween20液中)室溫封閉后，分別加入固定溶度的生物素標記的VEGF165單克隆抗體(Bio-VEGF，1:1000)與不同溶度的PV19抗體，或非相關的抗體(W10)，37°C孵育2h ；
[0077]3)經PBS-T洗脫后，加入辣根過氧化物酶標記的Avidin (1:5000)，37°C孵育1h ；
[0078]4)經PBS-T洗脫后，加入顯色液(鄰苯二胺)-3%雙氧水，室溫10min至顯色；
[0079]5)加入HCL終止反應，以酶聯免疫儀測定492nm波長處各孔的吸光值。
[0080]圖3為競爭性ELISA結果的代表性示意圖。如圖3所示:在PV19抗體(mPV19&Biotin-VEGF)組中，其OD值與抗體蛋白量成反比關系:即加入的PV19抗體的量越高，其OD值越低。而非相關的抗體(WlO&Biotin-VEGF)組，各孔OD值不受加入的抗體蛋白量影響。此結果表明PV19抗體體外可阻斷VEGF與其受體(VEGFRl)的結合。
[0081]實施例4.編碼鼠源PV19抗體可變區基因的克隆
[0082]取純化的鼠源PV19抗體，在DTT還原條件下經SDS-PAGE分離重鏈和輕鏈，然后將電泳條帶轉印至PVDF膜，用考馬斯亮藍R250顯色后，分別剪取PV19抗體重鏈和輕鏈蛋白條帶，用Edman降解法進行N-端氨基酸測序，獲得該抗體輕鏈的N-端氨基酸序列。抗體重鏈由于N-端封閉，常規氨基酸N-端測序未獲結果。
[0083]1).PV19抗體輕鏈可變區基因的克隆
[0084]步驟1、采用試劑盒(江蘇海門碧云天公司產品)從小鼠PV19雜交瘤細胞中提取出總 RNA ；
[0085]步驟2、采用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法在印pendorf管獲得cDNA模板。其中用于逆轉錄 PCR 引物(mlg-kappa)序列為:TGTCGTTCACTGCCATCAAT (SEQ ID N0.:15);
[0086]其中RT-PCR反應體系如下:
[0087]
【權利要求】
1.一種拮抗抑制血管內皮生長因子與其受體結合的鼠源單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的輕鏈可變區具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
2.一種編碼權利要求1所述抗體的DNA分子或基因，其特征在于，其輕鏈可變區具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
3.一種拮抗抑制血管內皮生長因子與其受體結合的人源化單克隆抗體，其特征在于，將權利要求1所述的重鏈可變區和輕鏈可變區基因進行人源化改造，包括框架區和抗原結合區域/互補決定區的氨基酸置換；所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區具有SEQ IDN0:5所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
4.一種編碼權利要求3所述人源化單克隆抗體的DNA分子或基因，其特征在于，其輕鏈可變區具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
5.一種如權利要求3所述的人源化單克隆抗體的衍生體，其特征在于，所述衍生體的輕鏈抗原互補決定區具有SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10及SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；其重鏈抗原互補決定區具有SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
6.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求4所述的DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。
7.—種重組宿主細胞，其特征在于，它由權利要求6所述的表達載體轉化而成。
8.根據權利要求7所述的重組宿主細胞或其子代細胞，其中所述重組宿主細胞或其子代細胞表達權利要求3的人源化單克隆抗體。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有藥學上有效量的權利要求3所述的人源化單克隆抗體或權利要求5所述的人源化單克隆抗體的衍生體以及藥學上可接受的載體。`
10.權利要求9所述的藥物組合物在制備治療與血管增生相關的疾病的藥物制劑中的應用。
11.如權利要求10所述的應用，其特征在于，所述疾病包括結腸癌、乳腺癌、橫紋肌肉瘤。
12.—種制備權利要求3所述的人源化單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: a)提供一表達載體，該表達載體含有權利要求4所述的DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列； b)用步驟a)所述的表達載體轉化宿主細胞； c)在適合所述人源化單克隆抗體表達的條件下培養步驟b)所得的宿主細胞:和 d)采用親合層析從宿主細胞培養液中分離純化獲得所述人源化單克隆抗體。
【文檔編號】C12N15/13GK103864932SQ201210543652
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優先權日:2012年12月14日
【發明者】羅師平, 胡紅群, 陳蕞, 蔡明文, 孫亞男, 劉海云, 周建鷹, 宋曉琦, 平小芽, 陳思宇, 石東紅, 徐一清, 周群敏 申請人:蘇州思坦維生物技術有限責任公司