專利名稱：Lmx1a介導的與神經干細胞共培養誘導rASCs為DA能神經元的方法
技術領域：
本發明屬于分子細胞生物學，特別是誘導干細胞替代缺損的神經元細胞以治療帕金森氏病的方法。
背景技術：
帕金森氏病(Parkinson，s disease, PD)是一種中老年常見的慢性神經系統退行性變性疾病，主要病理特征是黑質多巴胺(Dopamine，DA)能神經元的選擇性變性丟失和殘存于神經元內含大量a-突觸核蛋白(a-synuclein)、synphilin_l和Parkin等成分的路易小體(Lewy bodies)形成對于帕金森氏病。臨床治療多以藥物治療為主，不能從根本上去除病因，也不能延緩疾病的進程，而且隨著長期用藥和疾病的發展，效果進行性下降，副作用日趨嚴重。在腦血管病人增加、與環境污染導致的重金屬和化學物質接觸以及生活壓力等多重因素影響下，帕金森病呈增長趨勢，出現年輕化，患者和社會的負擔越來越重。細胞替代治療是重建受損神經系統的組織結構，恢復神經系統功能的一種有效策略。按照傳統觀念，成年哺乳動物的中樞神經系統(central nervous system, CNS)屬于完全有絲分裂后的組織，不具有自我更新和修復的能力。因此，研究者把重建神經系統功能的重點放在胚胎組織的移植上，利用胚胎腦組織移植治療神經系統疾病動物模型和患者，在實驗和臨床研究中取得了成功的經驗。但移植胚胎組織存在形成畸胎瘤的風險和倫理道德要求，限制了移植治療的廣泛應用。因此，較為理想的方法就是找到能產生多巴胺的細胞或能分化成多巴胺能神經元的干細胞，從根本上解決多巴胺能神經元細胞的來源。研究早期，研究人員將胚胎干細胞直接移植到帕金森病小鼠模型體內，胚胎干細胞可以部分分化為TH陽性的神經元，但把小劑量的胚胎干細胞移植到帕金森病小鼠模型黑質核團，數周后約 20%的小鼠的大腦內出現畸胎瘤。細胞替代療法尤其是帕金森氏病的細胞治療要解決的關鍵問題是選擇合適的替代細胞。間充質干細胞由于具有組織修復特性、自我更新及增殖分化、取材簡單、資源豐富等特點而成為了 ro細胞替代治療的理想候選細胞。目前，盡管中胚層間充質干細胞向DA能神經元定向分化尚無十分高效的誘導方法，但卻受到研究人員重視，其分子機制逐漸被揭示和認識。在胞外發育信號的誘導下，月旨肪來源的間充質干細胞(Rhesus adipose stem cells,rASCs)能夠向其他的細胞系誘導分化，但其分化分子機制卻知之甚少。研究表明，Lmxla是多巴胺能神經元發育過程中的關鍵調控因子，能夠啟動神經元細胞的發育程序，使小鼠胚胎干細胞分化為多巴胺能神經元。但是，多巴胺能神經元的分化是多因素、多步驟誘導的復雜過程，需要細胞內部和外部多條信號通路在不同時間協調作用，激活多種轉錄因子，引起細胞廣泛的基因表達譜的變化。神經干細胞(Neural stem cells, NSCs)是存在于中樞神經系統中具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。除了在體內能分化為神經元、星形膠質細胞核少突膠質細胞外，還能夠分泌大量的營養因子，如⑶NF、Neuturin等,對神經元細胞進行營養保護。
發明內容
本發明的目的是以恒河猴為研究對象，提供一種采集恒河猴的脂肪間充質干細胞進行體外培養，進而在Lmxla介導下與神經干細胞共培養將rASCs轉分化為DA能神經元的方法。本發明Lmxla介導的與NSCs共培養誘導rASCs為DA能神經元的方法，包括以下步驟:
步驟(I):構建Lmxla基因克隆及重組質粒 以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)為模板，引物為:
Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',
Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3',
通過PCR擴增獲得帶Sal I和EcoR V酶切位點的DNA片段，將該片段插入pShuttIe-CMV中，通過SalI和EcoR V雙酶切鑒定，得到重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla，測序并與理論
結果一致;
步驟(2):構建與包裝重組腺病毒Ad-Lmxla
將步驟(I)重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI線形化和CIAP進行5'去磷酸化，其產物經純化后與腺病毒基因組PAdEasy-1同時電轉感受態細胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重組質粒,篩選陽性克隆,與pAdEasy-1成功進行同源重組的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段；
篩選出的pAdEasy-1重組質粒經鑒定后轉化XL_10 (Gold)，擴增、提取質粒,使質粒濃度達到0.1 ii g/ ii L，將質粒線性化后轉染HEK-293細胞，使重組腺病毒質粒在HEK-293細胞中包裝重組腺病毒重組腺病毒Ad-Lmxla，10天后細胞病變脫落呈串珠狀，漂浮于上清液中，收集腺病毒顆粒；
步驟(3):將感染Ad-Lmxla的rASCs與NSCs共培養分化為DA能神經元Ca)誘導前,取rASCs第二代細胞,接種于放有玻片且包被過多聚賴氨酸的六孔培養板，培養液為含10%FBS的L-DMEM ;培養的NSCs接種于transwell小室中，培養液為含2%B27 的 Neural Basal 培養液。(b)以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs，并將培養液更換為含2% B27的NeuralBasal培養液，使細胞貼壁率維持在85%，三天后再換液為DMEM/F12誘導液I進行預誘導，部分細胞開始聚集；
(c)將接種有NSCs的transwell小室放入接種有(b)的產物細胞的六孔板中，NSCs與
(b)的產物細胞在含2% B27的Neural Basal培養液中共培養24h，細胞數目明顯增多，3天后將誘導液換液為Neural Basal正式誘導液II，每隔3天換一次誘導液II，直至21天；以上DMEM/F12誘導液I由以下成分組成:
2%FBS,
1.7 m SHH,
20 ng/mLbFGF,
6 mM 3 -巰基乙醇，DMEM/F12培養基。以上Neural Basal正式誘導液II由以下成分組成:
2%B27,
1.7 m SHH,
100 ng/mLFGF-8,
20 ng/mLbFGF,
1% N2 supplement,
20 m & -NADP,
Neural Basal 培養基。所述的方法是步驟(3)中rASCs第二代細胞的培養:
Ca)氯胺酮麻醉恒河猴，無菌條件下取6kg成年恒河猴大網膜脂肪組織f2g。PBS中洗滌去除殘存的血跡,分離血管和纖維成分，0.1%1型膠原酶，37°C消化Ih ；
(b)消化完成后，加入與I型膠原酶等體積的含10%新生小牛犢血清的L-DMEM培養液終止消化，過濾，1500 r/min離心3 min,棄上清,吸取底部沉淀用于rASCs培養；
(c)以1\106接種于1'-25培養瓶中，371:，5%0)2條件下細胞培養中培養4天，至單層貼壁細胞貼壁率接近90%時，0.25%胰蛋白酶消化，1:2傳代，之后隨細胞擴增至90%時，按1:2持續體外傳代 培養。所述的方法是步驟(3)中NSCs的培養:
取孕14天的SD大鼠，在無菌條件下取出子宮置于預冷的Hanks緩沖液中，分離出SD胎鼠，在解剖顯微鏡下取腹側中腦區，加入0.025%胰酶，37°C消化10 min,用DMEM/F12終止消化，吹勻，1500 r/min離心10 min，用含20 ng/mL bFGF和2%B27的DMEM/F12重懸細胞，接種至T-25培養瓶，懸浮培養；
每隔48h半量換液一次，每4天1:2傳代一次，待細胞團增殖換液為新鮮的含2% B27的Neural Basal培養基。本發明的有益效果是:
本發明對克隆球貼壁分化后得到的細胞進行鑒定，發現至少60%細胞表達酪氨酸羥化酶(TH)，說明我們從中腦分離得到的NSCs更易分化為多巴胺能神經元細胞，能更多的釋放促進細胞分化為多巴胺能神經元的細胞因子，含有細胞因子的NCM在整個誘導過程中起到很好的誘導作用。眾所周知，細胞間聯系對培養細胞的生長十分重要，以往文獻中采用的培養神經干細胞的方法是將克隆球分散為單個細胞，該方法造成細胞的機械損傷，使得較多的細胞在傳代后死亡。我們試驗表明，分離神經干細胞關鍵的是吹打細胞的力度。本發明參照Clive分離培養方法減少了細胞死亡，較好的保留了細胞間聯系，克隆球細胞群較多，增殖速度很快，能在短期內獲得更多的干細胞，使Clive采用的干細胞傳代方法，適合于神經干細胞研究。既往研究表明，理想的基因轉移載體是進行基因修飾和治療的關鍵。與其他間充質干細胞比，間充質干細胞不表達或低表達免疫排斥相關標記，免疫原性低，是一類免疫缺陷細胞，不須經過嚴格配對使用，異體移植無免疫排斥反應，適宜于不同個體之間的移植，這一點在治療神經系統疾病方面顯得尤為重要。恒河猴作為非人靈長類動物，分離得到的脂肪間充質干細胞與人類更為接近，與嚙齒類動物研究相比，所取得的研究資料更為珍貴。本發明以ASCs為原料，取材方便且體外培養操作簡單，可以為將來可能的臨床實驗研究提供充足的細胞源。多能干細胞分化為特定的組織細胞類型及相關分子機制研究一直是干細胞研究的重要方向，尤其是分子機制研究較少。研究表明，SHH/Lmxla/Msxl信號通路在早期DA神經元分化成熟過程中起到非常重要的調控作用，但在脂肪間充質干細胞分化為神經元研究中還未見報道。本研究提出SHH/Lmxla/Msxl信號通路結合NSCs共培養對多能干細胞分化為神經元細胞具有重要作用更屬首例。本發明通過實驗證明，在共培養環境中，通過腺病毒將Lmxla基因傳遞至rASCs能夠使rASCs分化形成多巴胺能神經元細胞。Lmxla對rASCs的分化方向進行調控,與來源于胎鼠中腦的NSCs共培養后，在所指出的誘導方案下，分化出來的神經元樣細胞能夠表達多種特異性表達于多巴胺能神經元細胞中的蛋白標志物，可評價誘導rASCs為多巴胺能神經元細胞。本發明誘導后的細胞可以傳導電信號或分泌神經遞質，證明誘導細胞為神經元細胞。
圖1是Lmxla基因克隆及其重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla篩選結果(A) I,DNA marker DL, 2000; 2，Lmxla PCR產物(1149bp) ; (B) I, J and K酶切分析重組質粒 pShuttleCMV-Lmxla ; 2, DNA marker DL, 15000。圖2是重組腺病毒質粒pAdEasy-Lmxla和pAdEasy-NGF/NTN的篩選。1、2、3是重組腺病毒質粒經Pac I酶切，分別產生4.5kb和3.0 kb的片段；
4,DNA marker DL, 15000。圖3是重組腺病毒在HEK-293中的包裝產生的細胞病變(200 X )及透射電鏡觀察重組腺病毒負染結果。(A)對照細胞(B)病變細胞(C)重組腺病毒負染結果。圖4是rASCs形態觀察及BrdU熒光染色。圖5是透射電鏡觀察rASCs多能性細胞特征。圖6是rASCs向脂肪細胞和成骨細胞誘導分化及鑒定(A)成脂誘導后的rASCs ；(B)油紅0染色鑒定脂肪細胞；(C)ALP染色鑒定成骨細胞；(D)茜素紅染色鑒定成骨細胞。圖7是NSCs和由NSCs誘導的神經元的鑒定。圖8是rASCs感染Ad-Lmxla與NSCs共培養誘導方案及細胞形態變化示意圖。圖9是RT-PCR和免疫熒光檢測誘導rASCs特異性神經元蛋白轉錄和表達情況:(A)免疫熒光結果；(B) RT-PCR結果；(C)神經元特異性蛋白免疫熒光統計結果。圖10是ELISA檢測誘導rASCs多巴胺釋放情況。以下結合附圖對本發明做進一步說明。
具體實施例方式一、Lmxla介導的與神經干細胞共培養誘導rASCs為DA能神經元的方法
(I)Lmxla基因克隆及重組質粒的構建以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)為模板，引物為:
Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',
Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3',
通過PCR擴增獲得帶Sail和EcoR V酶切位點的DNA片段，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，擴增的條帶與理論分子量吻合，結果見圖1A。將擴增片段插入pShuttle-CMV中，通過Sal I和EcoR V雙酶切鑒定，得到重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla，結果見圖1B。重組克隆進行測序，測序結果與理論結果一致。以上 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)購買自 GeneCopoeiaTM 公司。購買。(2)重組腺病毒的構建與包裝
將步驟(I)重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI線形化和CIAP進行5'去磷酸化，其產物經純化后與腺病毒基因組PAdEasy-1同時電轉感受態細胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重組質粒，涂布含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，與pAdEasy-1成功進行同源重組的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段，結果見圖2。篩選出的pAdEasy-1重組質粒經鑒定后轉化XL_10 (Gold)，擴增、提取質粒，使質粒濃度達到0.1 ii g/ ii L，將質粒線性化后轉染HEK-293細胞，使重組腺病毒質粒在HEK-293細胞中包裝重組腺病毒重組腺病毒Ad-Lmxla，10天后，細胞病變脫落呈串珠狀，漂浮于上清液中，收集腺病毒顆粒，在透射電鏡下可見典型腺病毒顆粒。見圖3。(3)感染Ad-Lmxla的rASCs與NSCs共培養分化為多巴胺能神經元
Ca)誘導前,取rAS Cs第二代細胞,接種于放有玻片且包被過多聚賴氨酸的六孔培養板，培養液為含10%FBS的L-DMEM ;培養的NSCs接種于transwell小室中，培養液為含2%B27 的 Neural Basal 培養液。(b)按照圖8的誘導方案，以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs,rASCs生長狀態良好，出現少數細胞漂起，并將培養液更換為含2% B27的Neural Basal培養液，使細胞貼壁率維持在85%，三天后再換液為DMEM/F12誘導液I進行預誘導，部分細胞開始聚集；
以上DMEM/F12誘導液I由以下成分組成:
2%FBS,
1.7 m SHH,
20 ng/mLbFGF,
6mM 3 -巰基乙醇，
DMEM/F12培養基。(c)將接種有NSCs的transwell小室放入接種有(b)的產物細胞的六孔板中，NSCs與(b)的產物細胞在含2% B27的Neural Basal培養液中共培養24h，細胞數目明顯增多，3天后將誘導液換液為Neural Basal正式誘導液II，每隔3天換一次誘導液II，直至21天；
以上Neural Basal正式誘導液II由以下成分組成:
2%B27,
1.7 m SHH,
100 ng/mLFGF-8,20 ng/mLbFGF,
1% N2 supplement,
20 m & -NADP,
Neural Basal 培養基。誘導21天后，發出細長的突觸，相互連接最后交聯形成網絡狀，誘導后細胞存活較好，結果如圖8所示。(2)本發明方法的產物之多巴胺能神經元的鑒定
I) RT-PCR檢測誘導后細胞的神經元特異性基因轉錄情況
提取誘導后的細胞和對照細胞的總RNA，提取步驟按試劑盒操作說明進行。抽提所得細胞總RNA使用比色法測定RNA濃度后，分別利用cDNA合成試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。利用表I所示的所有基因引物對逆轉錄成的cDNA進行PCR，1%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，并拍照記錄。結果顯示:與P -actin相比較,在對照rASCs細胞和誘導rASCs細胞中，Nurrl 和 3-tubulin III 均有轉錄。誘導 21 天時,誘導組中 Nurrl、0-tubulin II1、Nefm、nestin、GFRa 2基因轉錄水平上調，nestin在誘導后14天出現上調，并且多巴胺能神經元特異性基因TH也出現轉錄，結果如圖9B所示。2)免疫熒光檢測誘導后細胞的神經元特異性蛋白表達 對共培養誘導后的rASCs進行神經元特異性蛋白質NSE、P -tubuIinIII和TH免疫熒光檢測。與對照細胞相比，在共培養誘導后21天時，誘導組細胞特異性表達NSE、^ -tubulin III和TH蛋白，未檢測到MAP-2的表達，對熒光蛋白陽性細胞進行統計后，發現隨誘導時間的延長，NSE、^ -tubulin III和TH的表達率不斷增加(圖9A)。3)誘導后神經元細胞多巴胺分泌測定
利用多巴胺檢測試劑盒，測定誘導后的rASCs是否會釋放神經遞質多巴胺。結果顯示，在本發明誘導方案下，Lmxla轉導的rASCs在誘導后比不轉導Lmxla的rASCs多分泌1.2倍的多巴胺，約為180pg/105細胞，而在Ad-LacZ感染后的未誘導的rASCs中不能檢測到多巴胺的釋放(圖10)。二、本發明rASCs的培養及鑒定
無菌條件下，氯胺酮麻醉恒河猴，取恒河猴大網膜脂肪組織。PBS沖洗4遍，分離可見的血管和纖維成分，0.1% I型膠原酶，37 °C消化I h。消化完成后，加入與I型膠原酶等體積的含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養液終止消化，過濾，1500 r/min離心3 min,棄上清，吸取底部沉淀用于rASCs培養。培養的脂肪干細胞大部分于24 h內即貼壁，在倒置顯微鏡下觀察，貼壁細胞呈梭形，胞漿豐富、核大、核仁明顯，可見細胞呈克隆樣生長。傳代后，于倒置顯微鏡下可見成纖維樣細胞形態，細胞呈平行排列生長或旋渦狀生長，在形態上與骨髓來源的MSCs類似，通過BrdU摻入實驗檢測rASCs增殖指數為 40% (圖 4)。為了鑒定rASCs的多能性，我們取rASCs第一代細胞I3BS洗兩次，1500 r/min離心lOmin，2.5%戊二醛-0.2 mol/L 二甲砷酸固定，透射電鏡觀察細胞核以及細胞器特征。細胞表面有許多微絨毛，分布于胞體一側，胞核不規則，細胞器豐富，胞漿內核糖體、線粒體、粗面型內質網、高爾基體、溶酶體較多，符合多能性細胞特征(圖5)。為了鑒定我們分離培養得到的rASCs具有多向分化潛能，我們將rASCs向脂肪細胞和成骨細胞進行誘導。誘導方法如下:
I)成脂誘導:取rASCs第三代細胞，接種于放有玻片的六孔板。當細胞匯合率達95%時，換液為含10%FBS，I u M地塞米松，10 u g/mL胰島素和0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的H-DMEM。四天后換液為H-DMEM(含10%FBS)，I y M地塞米松，10 y g/mL胰島素，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和200 ii M吲哚美辛。每隔3天換一次液，18天時，用油紅O染色鑒定。2)成骨誘導:取rASCs第三代細胞，接種于放有玻片的六孔板。當細胞匯合率達95%時，換液為H-DMEM，含10%FBS，10 nM地塞米松，10 mM P甘油磷酸鈉和150 yM L抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽。每隔3天換一次液，21天時，ALP和茜素紅染色鑒定。結果表明，rASCs在上述誘導條件下能夠向脂肪細胞和成骨細胞分化，具有多向分化潛能(圖6)。三、本發明NSCs的培養及鑒定
取孕14天的SD大鼠,在無菌條件下取出子宮至于預冷的Hanks緩沖液中，分離出SD胎鼠，在解剖顯微鏡下找到腹側中腦區，加入0.025%胰酶，37°C消化10 min,用DMEM/F12終止消化，吹勻，1500 r/min 離心 10 min,用 DMEM/F12 (含 20 ng/ml 的 bFGF 和 2%B27)重懸細胞，接種至T-25培養瓶，懸浮培養。每隔48h半量換液一次，每4天1:2傳代一次，待細胞團增殖到一定數目時，換液為新鮮的Neural Basal培養基(含2% B27)。胎鼠中腦分離的神經干細胞生長狀態良好，在原代培養第3d開始能觀察到細胞分裂現象，雜質較多；培養第7天時能看到直徑約為100 的克隆球，克隆球狀態良好，球周圍附著輪廓清晰的圓形的單個細胞，雜質逐漸減少；培養第IOd時多數克隆球直徑達到200 iim;隨著培養時間的逐漸延長，克隆球中心逐漸變黑，有的克隆球貼壁生長，球周圍有細胞呈放射樣生長。傳代培養細胞增殖較原代培養快，在傳代培養第7天時能形成直徑約200iim的克隆球。 為了鑒定本發明分離得到的細胞是否為神經干細胞，我們將經過單克隆培養的神經干細胞克隆球連同培養基一通倒入50ml離心管，1000r/min離心5min,倒掉上清液后，用DMEM/F12培養基重懸其細胞沉淀。臺盼藍計數后，接種于已包被有多聚賴氨酸的放置于六孔培養板的玻片上，再未加血清的培養基培養3天后，神經球吸附在玻片上，對神經球進行nestin免疫熒光檢測，檢測結果為陽性(圖7)。同時，在同一塊六孔培養孔的不同培養孔中，將無血清培養基DMEM/F12 (含2%B27和20ng/ml的bFGF)換液為含10%FBS的DMEM/F12培養基，對神經干細胞進行體外誘導。誘導10天后，對誘導NSCs進行TH的免疫熒光鑒定，檢測結果為陽性(圖7)，證明分離得到的細胞團為神經干細胞，且能向神經元細胞分化。
權利要求
1.Lmxla介導的與神經干細胞共培養誘導rASCs為DA能神經元的方法，包括以下步驟: 步驟(I):構建Lmxla基因克隆及重組質粒 以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)為模板，引物為:Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3', 通過PCR擴增獲得帶Sail和EcoR V酶切位點的DNA片段，將該片段插入pShuttle_CMV中，通過SalI和EcoR V雙酶切鑒定，得到重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla，測序并與理論結果一致; 步驟(2):構建與包裝重組腺病毒Ad-Lmxla 將步驟(I)重組穿梭質粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI線形化和CIAP進行5'去磷酸化，其產物經純化后與腺病毒基因組PAdEasy-1同時電轉感受態細胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重組質粒,篩選陽性克隆,與pAdEasy-1成功進行同源重組的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段； 篩選出的pAdEasy-1重組質粒經鑒定后轉化XL_10 (Gold)，擴增、提取質粒,使質粒濃度達到0.1 ii g/ ii L，將質粒線性化后轉染HEK-293細胞，使重組腺病毒質粒在HEK-293細胞中包裝重組腺病毒Ad-Lmxla，10天后細胞病變脫落呈串珠狀，漂浮于上清液中，收集腺病毒顆粒； 步驟(3):將感染Ad-Lmxla的rASCs與NSCs共培養分化為DA能神經元Ca)誘導前,取rASCs第二代細胞,接種于放有玻片且包被過多聚賴氨酸的六孔培養板，培養液為含10%FBS的L-DMEM ;培養的NSCs接種于transwell小室中，培養液為含2%B27 的 Neural Basal 培養液; (b)以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs，并將培養液更換為含2%B27的Neural Basal培養液，使細胞貼壁率維持在85%，三天后再換液為DMEM/F12誘導液I進行預誘導，部分細胞開始聚集； 以上DMEM/F12誘導液I由以下成分組成:2%FBS,.1.7 m SHH,20ng/mLbFGF, .6 mM 3 -巰基乙醇， DMEM/F12培養基； (c)將接種有NSCs的transwell小室放入接種有(b)的產物細胞的六孔板中，NSCs與(b)的產物細胞在含2% B27的Neural Basal培養液中共培養24h，細胞數目明顯增多，3天后將誘導液換液為Neural Basal正式誘導液II，每隔3天換一次誘導液II，直至21天； 以上Neural Basal正式誘導液II由以下成分組成:2%B27,.1.7 m SHH,.100 ng/mLFGF-8,.20 ng/mLbFGF,1% N2 supplement，20m & -NADP, Neural Basal 培養基。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(3)中rASCs第二代細胞的培養: Ca)氯胺酮麻醉恒河猴，無菌條件下取6kg成年恒河猴大網膜脂肪組織f 2g， PBS中洗滌去除殘存的血跡，分離血管和纖維成分，0.1%1型膠原酶，37°C消化Ih ； (b)消化完成后，加入與I型膠原酶等體積的含10%新生小牛犢血清的L-DMEM培養液終止消化，過濾，1500 r/min離心3 min,棄上清,吸取底部沉淀用于rASCs培養； (c)以1\106接種于1'-25培養瓶中，371:，5%0)2條件下細胞培養中培養4天，至單層貼壁細胞貼壁率接近90%時，0.25%胰蛋白酶消化，1:2傳代，之后隨細胞擴增至90%時，按1:2持續體外傳代培養。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(3)中NSCs的培養: 取孕14天的SD大鼠，在無菌條件下取出子宮置于預冷的Hanks緩沖液中，分離出SD胎鼠，在解剖顯微鏡下取腹側中腦區，加入0.025%胰酶，37°C消化10 min,用DMEM/F12終止消化，吹勻，1500 r/min離心10 min，用含20 ng/mL bFGF和2%B27的DMEM/F12重懸細胞，接種至T-25培養瓶， 懸浮培養； 每隔48h半量換液一次，每4天1:2傳代一次，待細胞團增殖換液為新鮮的含2% B27的Neural Basal培養基。
全文摘要
Lmx1a介導的與神經干細胞共培養誘導rASCs為DA能神經元的方法，屬于誘導干細胞替代缺損的神經元細胞治療帕金森氏病的方法。本發明步驟有構建Lmx1a基因克隆及重組質粒，構建與包裝重組腺病毒Ad-Lmx1a，將感染Ad-Lmx1a的rASCs與NSCs共培養分化為DA能神經元；以及rASCs和NSCs傳代細胞的培養等。本發明誘導的神經元樣細胞能分化出表達多巴胺能神經元細胞蛋白標志物，且誘導后的細胞可傳導電信號或分泌神經遞質，證明誘導細胞為神經元細胞。
文檔編號C12N7/01GK103215226SQ201210543400
公開日2013年7月24日 申請日期2012年12月16日 優先權日2012年12月16日
發明者周艷, 李鴻鈞, 孫茂盛, 嚴敏, 吳晉元 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所