專利名稱：一種l-組氨酸高產菌及其應用的制作方法
技術領域：
一種L-組氨酸高產菌及其應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
L-組氨酸對嬰幼兒是必需氨基酸，成人體內可和合成L-組氨酸，因此對成人是半必需氨基酸。L-組氨酸主要用于氨基酸輸液及綜合氨基酸試劑，心臟循環器官藥品及消化道潰瘍藥，治療貧血、風濕性疾病、過敏癥等。L-組氨酸具有多種生理功能，廣泛應用于醫藥、飼料及食品行業。目前國內主要是從豬血粉水解液中以離子交換工藝提取L-組氨酸，由于成本較高，水解損失率高，造成環境污染，不適合工業化生產，因此加快發酵法生產L-組氨酸迫在眉睫。·
發酵法生產L-組氨酸是通過誘變處理，選育結構類似物抗性、營養缺陷型或分支酶缺陷型突變株。國外在這方面起步較早。日本的清志中山和村田荒木以谷氨酸棒桿菌為出發菌株，進行誘變，定向選育L-組氨酸結構類似物2-噻唑丙氨酸和1，2，4-三唑丙氨酸抗性突變株，打破了菌株正常代謝調節，產酸達6-8g/L(Agric BiolChem. 1971，35(13) :2081-2088)。后又將突變株誘變，得到嘌呤、嘧啶結構類似物抗性菌株，使產酸達到 15g/L(Agric Biol Chem. 1974，38(11) :2091-2096)。國內此方面研究起步較晚。曾瑩等以黃色短桿菌為出發菌株，通過復合誘變得到的高產突變菌株可產L-組氨酸128. 28mg/L (氨基酸和生物資源，2005, 27(1) :46-48)。顧正華[21]等以谷氨酸棒桿菌為出發菌株進行誘變，選育D-組氨酸和6-氮鳥嘌呤抗性突變株，產酸1. 6g/L (無錫輕工大學學報.2002, 21 (5) : 533-535)。隨著DNA重組技術的快速發展，人們開始利用分子生物學和微生物學手段進行菌種改造，改變微生物代謝途徑，從而提高產量。日本的川島利用枯草芽孢桿菌K的組氨酸產生菌AJ12111 DAN進行克隆，獲得枯草芽孢桿菌互補質粒pAH3。從pAH3上切除包含hisj的基因片段，通過載體導入AJ12111，L-組氨酸產量從6. 3g/L提高到8. 8g/L(JMol Biol. 1988，203(3) :585-606)。倉橋修等將枯草芽孢桿菌誘變，得到L-組氨酸產生菌AJl 1733，培養至對數期，提取DNA。再將AJl 1733誘變得到缺陷型菌株AJl 1732，培養成為具有吸收DNA能力的細胞。將DNA導入AJl 1733，得到AJl 1734。從AJl 1734中提取L-組氨酸合成及拮抗體耐受基因，導入AJl 1733，得到高產菌株AJl 1735，產酸從I lg/L提高到23g/L (J. Bacteriol, 1987，169(2):823-829)。
發明內容
本發明的目的是提供一種L-組氨酸高產菌及其應用。本發明技術方案為一種L-組氨酸高產菌，于2012年4月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012144，其分類學命名為粘質沙雷氏菌ZJZG25Serratia marcescens ZJZ G25,地址中國武漢,武漢大學。所述菌株具有3-氨基-1，2，4-三氮唑抗性，抗性濃度為2mg/mL。
所述菌株具有6-巰基嘌呤抗性,抗性濃度為3mg/mL。所述菌株具有組氨酸甲酯抗性，抗性濃度為3mg/mL。 所述菌株具D-組氨酸抗性，抗性濃度為3mg/mL。所述菌株的應用方法，將菌株接入發酵培養基，所述發酵培養基由葡萄糖，(NH4)2SO4,玉米漿，KH2PO4, MgSO4O. 5-1. 5 和 CaC0320-40 組成。具體而言，經過優化搖瓶發酵培養基為(g/L):葡萄糖130-160，(NH4)2SO4 20-40,玉米漿 15-25，KH2PO41. 0-1. 5，MgSO4 0. 5-1. 5，CaCO3 20-40。發酵罐上使用的發酵培養基為(g/L):葡萄糖110-130，玉米漿7. 0-10. 0，硫酸銨20-40，磷酸二氫鉀1. 0-2. 0，硫酸鎂0. 5-1. 5，碳酸鈣10. 0-20. 0，生物素30 y g/L，檸檬酸鈉 2，VB1 4mg/L，葡萄糖酸鈣 5-20, pH 調至 7. O。本發明提供得生產L-組氨酸的菌株,是以粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 31026為出發菌株，經過硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)和紫外(UV)逐級誘變，在斜面基本培養基中添加L-組氨酸結構類似物3-氨基-1，2，4-三氮唑、6-巰基嘌呤、組氨酸甲酯、2-硫尿嘧啶和D-組氨酸，經培養篩選和復篩得到。出發菌株粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC31026。發酵法生產L-組氨酸所用培養基組分為種子培養基(g/L):葡萄糖25，玉米漿 20，尿素1. 25，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.5，pH 調至1. 0-7. 2 ；發酵培養基為(g/L):葡萄糖130-160，(NH4)2SO4 20-40，玉米漿 15-25，KH2PO41.0-1. 5,MgSO4 0. 5-1. 5，CaCO3 20-40(分消)，pH調至7. O。將菌株以10%的接種量轉接到發酵培養基，旋轉式搖床轉速為200-250r/min，pH 6. 8-7. 0，培養溫度30°C，培養時間72h。3L罐上流加發酵基礎培養基(g/L):葡萄糖110-130，玉米漿7. 0-10.0，硫酸銨20-40，磷酸二氫鉀1. 0-2. 0，硫酸鎂0. 5-1. 5，碳酸鈣10. 0-20. 0，生物素30 y g/L，檸檬酸鈉2，VB1 4mg/L，葡萄糖酸鈣 5-20, pH 調至 7. O。發酵罐上工藝為通氣量為lvvm, 0 15h控制攪拌轉速為700r/min, 15h后控制攪拌轉速為600r/min，并進行適當補料，L-組氨酸在發酵液中積累。本發明的有益效果從粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens) ATCC 31026選育的L-組氨酸結構類似物抗性突變株粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZJZGzs(AMre-MP1rHE1^-TUlrDff)，解除了 L-組氨酸的反饋抑制，因此表現出積累高水平L-組氨酸的能力。用該菌已通過搖瓶水平和3L發酵罐水平的發酵法生產L-組氨酸的實驗，L-組氨酸產量分別達到9. 7g/L、18. lg/L，為工業化奠定了基礎。
圖1L-組氨酸選育譜系圖生物材料樣品保藏一株生產L-組氨酸的菌株，于2012年4月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012144，其分類學命名為粘質沙雷氏菌ZJZ G25 SerratiamarcescensZJZ G25,地址中國武漢，武漢大學。
具體實施例方式實施例1出發菌株初始產量的測定將出發菌株粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens) ATCC 31026劃線活化,制備種子培養基，并轉接發酵培養基，測得初始產量為2. lg/L。實施例2制備對3-氨基-1，2，4-三氮唑有抗性的突變株將出發菌株粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 31026用濃度2%的硫酸二乙酯在301下誘變處理20111111，涂布到3-氨基-1，2，4-三氮唑(2mg/mL)抗性平板上，30°C培養36h，挑取在此培養基上長出的菌株，作為對3-氨基-1，2，4-三氮唑有抗性的突變株。然后進行L-組氨酸發酵試驗，在這些突變株中，L-組氨酸產量最高的突變株稱為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)A 07, L-組氨酸產量為 3. 5g/ L。實施例3制備對6-巰基嘌呤有抗性的突變株將實施例2獲得的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens) A 07用250 U g/mL的亞硝基胍在30°C下誘變處理20min，涂布到6-巰基嘌呤(3mg/mL)抗性平板上，30°C培養36h，挑取在此培養基上長出的菌株，作為對6-巰基嘌呤有抗性的突變株。然后進行L-組氨酸發酵試驗，在這些突變株中，L-組氨酸產量最高的突變株稱為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)M 20, L-組氛酸產量為 4. 6g/L。實施例4制備對組氨酸甲酯有抗性的突變株將實施例3獲得的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)M 20在15W紫外燈下30cm處紫外照射誘變處理40s，涂布到組氨酸甲酯(3mg/mL)抗性平板上，30°C培養36h，挑取在此培養基上長出的菌株，作為對組氨酸甲酯有抗性的突變株。然后進行L-組氨酸發酵試驗，在這些突變株中，L-組氨酸產量最高的突變株稱為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens) H 35, L-組氨酸產量為 5. 2g/L。實施例5制備對2-硫尿嘧啶有抗性的突變株將實施例4獲得的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)H 35先后經過紫外(15W, 30cm, 40s)和硫酸二乙酯(2%，20min，30°C )誘變處理，涂布到2-硫尿嘧啶(2mg/mL)抗性平板上，30°C培養36h，挑取在此培養基上長出的菌株，作為對2-硫尿嘧啶有抗性的突變株。然后進行L-組氨酸發酵試驗，在這些突變株中，L-組氨酸產量最高的突變株稱為粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)T 17, L-組氨酸產量為6. 9g/L。實施例6制備對D-組氨酸有抗性的突變株將實施例5獲得的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)T 17先后經過紫外(15W, 30cm, 40s)和亞硝基胍(250 y g/mL，20min，30°C )誘變處理，涂布到D-組氨酸(3mg/mL)抗性平板上，30°C培養36h，挑取在此培養基上長出的菌株，作為對D-組氨酸有抗性的突變株。然后進行L-組氨酸發酵試驗，在這些突變株中，L-組氨酸產量最高的突變株稱為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ZJZ G25, L-組氨酸產量為7. 6g/L。實施例7以ZJZ 625發酵法生產L-組氨酸從新鮮斜面上接種一環ZJZ G25菌種到種子培養基(50mL/500mL三角瓶)，30°C，200r/min，培養18h，以10% -15%接種量接入發酵培養基。種子培養基和發酵培養基的成分如本說明書所述。搖瓶培養250mL三角瓶裝液量為15mL，30°C，200r/min,培養72h，L-組氨酸產量為 7. 6g/L。實施例8以ZJZ G25在3L發酵罐上分批發酵合成L-組氨酸斜面種子培養和發酵接種條件同實施例7，3L發酵罐中培養基體積為1.8L，通氣量為lvvm，接種量10%，培養溫度31 土 TC，采用雙階段供氧控制模式，即前IOh轉速為700r/min, IOh 后為 600r/min。發酵 56h，L-組氨酸產量為 14. lg/L。實施例9以ZJZ G25在3L發酵罐上補料分批發酵合成L-組氨酸在實施例8雙階段供氧控制基礎上，當葡萄糖濃度下降到20g/L時，開始補料。采取的補料策略是每次補10g/L，補料后四小時殘糖量基本與補料前相同，葡萄糖消耗至20g/L，再進行補料，共補料四次。發酵60h，L-組氨酸產量為18. lg/L。補料液為500g/L的·葡萄糖。可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種L-組氨酸生產菌，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO M2012144。
2.根據權利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具有3-氨基-1，2，4-三氮唑抗性，抗性濃度為2mg/mL。
3.根據權利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具有6-巰基嘌呤抗性，抗性濃度為3mg/mL。
4.根據權利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具有組氨酸甲酯抗性，抗性濃度為3mg/mL。
5.根據權利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具D-組氨酸抗性，抗性濃度為3mg/mL。
6.權利要求1所述菌株在L-組氨酸發酵生產中應用。
7.根據權利要求6所述方法，其特征在于，將權利要求1所述菌株接入發酵培養基，所述發酵培養基由葡萄糖，(NH4)2SO4,玉米漿，KH2PO4, MgSO4O. 5-1. 5和CaC0320_40組成。
8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述發酵培養基還含有生物素，檸檬酸鈉，VB1和葡萄糖酸鈣。
9.根據權利要求8所述方法，其特征在于，發酵前IOh轉速為700r/min，IOh后為600r/min。
10.根據權利要求8所述方法，其特征在于，發酵液中葡萄糖濃度下降到20g/L時開始補料。
全文摘要
一種L-組氨酸高產菌及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明提供一種粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZJZ G25，是以粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 31026為出發菌株，經過硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)和紫外(UV)逐級誘變，通過在基本培養基中添加3-氨基-1,2,4-三氮唑、6-巰基嘌呤、組氨酸甲酯、2-硫尿嘧啶、D-組氨酸等L-組氨酸的結構類似物篩選得到。用所述菌株發酵法生產L-組氨酸，與出發菌株相比，表現出積累高水平L-組氨酸的能力。ZJZ 625搖瓶培養72h，L-組氨酸產量可以達到9.7g/L。3L發酵罐發酵60h，L-組氨酸產量可以達到18.1g/L。
文檔編號C12R1/43GK103013876SQ20121053959
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者陳堅, 李江華, 侯穎, 堵國成 申請人:江南大學