專利名稱：一種麥芽糖底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種環糊精糖基轉移酶及制備方法，特別是一種麥芽糖底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶及其制備方法。
背景技術：
L-抗壞血酸(L-AA，維生素C)是水溶性維生素，參與很多體內的生理活動，在保持和促進人體健康中起到重要的作用，是人體無法自身合成的必需的營養元素。但L-AA極不穩定，在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸，破壞分子中的共軛體系，發生不可逆裂解反應， 特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下，反應更迅速，使L-AA的生理活性減弱甚至消失，這使得它在應用上受到很大的限制。因此，如何增強L-AA的穩定性是目前國內外學術界和產業界所關注的焦點問題。2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是將一個糖基以α -I, 4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易發生氧化反應，所以在水溶液中特別穩定，并且AA-2G沒有直接還原性，有效地保護了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發現的穩定性和性能最佳的L-AA替代品。目前，AA-2G主要通過糖基轉移酶生物催化生成，其中環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _環糊精或β _環糊精為糖基供體，將葡萄糖基催化轉移到受體L-AA上。然而，若以α-環糊精為糖基供體，成本太高；若以β-環糊精為糖基供體，由于它的溶解度較低，酶促反應效率受到較大限制。因此，選擇一種既便宜又易溶的糖基供體(如麥芽糖)將會大大減少AA-2G的生產成本，提高其利潤。但是，由于目前環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)對麥芽糖的底物特異性(轉化率)較低，因此，通過分子改造CGTase技術提高其對麥芽糖的底物特異性，將推動與L-AA糖基衍生物相關行業的快速發展。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種麥芽糖底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶，以GenbankAF047363. I所示的環糊精葡萄糖基轉移酶為出發序列，第47位的賴氨酸突變成苯丙氨酸K47F、酪氨酸K47Y或脯氨酸K47P。其中優選突變為脯氨酸。所述環糊精葡萄糖基轉移酶來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)。所述環糊精葡萄糖基轉移酶的獲得方法為以Genbank AF047363. I公布的基因為出發基因，將第47位的賴氨酸突變成苯丙氨酸K47F、酪氨酸K47Y或脯氨酸K47P。產所述環糊精葡萄糖基轉移酶的基因工程菌或轉基因細胞系也為本發明要求保護的范圍。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種產環糊精葡萄糖基轉移酶基因工程菌的構建方法，具體步驟如下
I)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼所述環糊精葡萄糖基轉移酶基因；2)將步驟I)獲得的環糊精葡萄糖基轉移酶基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體；3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)得到基因工程菌。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種應用所述基因工程菌發酵生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法，以產環糊精葡萄糖基轉移酶突變體的基因工程菌為生產菌株，活化后按4%接種量將種子發酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養基；大腸桿菌在30°C搖床培養至0D_=0. 6，加入O. OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續培養發酵90h后，將發酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集富含環糊精葡萄糖基轉移酶的上清液。 軟化類芽孢桿菌(Peanibacillusmacerans) JFB05-01 (CCTCC NO :M208063)，已在中國專利CN101294149公開，
公開日2008年10月29日。來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGTase)的三種突變體酶K47F，K47Y及K47P，它們相比于野生型CGTase利用麥芽糖為糖基供體生產AA-2G時，產量分別提高17. 1%, 22. 1%和32. 9%。本發明的有益效果本發明構建了 3個有意義的突變體，均實現了環糊精糖基轉移酶對麥芽糖的底物特異性的提高，以此為糖基供體所產AA-2G產量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工業化生產。
圖I不同反應時間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G的產量。■:野生型 CGTase ；· K47F ；▲ K47Y ; :Κ47Ρ。
具體實施例方式實施例I :底物特異性提高的環糊精葡萄糖基轉移酶本發明的環糊精糖基轉移酶是在GenBank AF047363. I公布的基因序列基礎上，將其47位點的賴氨酸突變成苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸，分別為K47F、K47Y和K47P。可以通過化學全合成或定點突變的方式將其成熟區的47位點進行氨基酸的取代。實施例2 :底物特異性提高的環糊精葡萄糖基轉移酶的制備方法本例以PCR方法為例進行說明，但被發明的保護并不限于僅通過PCR方法獲得突變的方法。突變體酶K47F、K47Y和K47P的制備方法如下I)定點突變單突變體酶K47F、K47Y和K47P的定點突變，利用快速突變試劑盒MutanBEST kit,以表達載體cgt/pET-20b (+)1為模板，引入K47F密碼子的頂點突變引物為正向引物5’-CCAATTTGTTCCTCTATTTCGGGGG-3’，下劃線為突變堿基；反向引物5’-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3’；引入K47Y密碼子的頂點突變引物為
正向引物5’ -CCAATTTGTACCTCTATTTCGGGGG-3’，下劃線為突變堿基；反向引物5’ -ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3’ ；引入K47P密碼子的頂點突變引物為正向引物5’-CCAATTTGCCGCTCTATTTCGGGGG-3’，下劃線為突變堿基；反向引物5’-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3’。PCR 反應體系均為5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ L, 2. 5mMdNTPs4 μ L, 10 μ M 正向弓丨物 I μ L，10 μ M 反向弓丨物 I μ L，模板 DNAl μ L, 2. 5U/ μ LPrimeSTARTaq HSO. 5 μ L，加入雙蒸水至50 μ L ;PCR產物擴增條件均為98 V預變性3min ;隨后進行98 V IOs, 62 V 15s， 72°C 6min30個循環；最后72°C保溫IOmin ；PCR產物經MutanBEST kit處理，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，感受態細胞在含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基培養過夜后，挑單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，后提取質粒，將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受:態細胞，所有質粒均測序正確；2)突變體表達與純化挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養生長8 10h，按4%接種量將種子發酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養基；大腸桿菌在30°C搖床培養至0D_=0. 6，加入O. OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續培養發酵90h后，將發酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集上清液。上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4°C、IOOOOrpm離心20min,取沉淀物用適量含20mM磷酸鈉、O. 5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7. 4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過O. 22 μ m膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫，流速lmL/min，檢測波長為280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脫液；活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液(pH=6)中透析過夜后，分別得到純化突變體酶K47F、K47Y和K47P。實施例3 :本實施例說明酶活分析及AA-2G的合成及檢測。I)酶活測定方法甲基橙法測定α-環化活力的方法取適當稀釋的酶液O. lmL，加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH6. 5)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40°C下反應IOmin后，加入I. OmLl. OM的鹽酸停止反應，再加入I. OmL用50mM磷酸緩沖液配制的O. ImM甲基橙，在16°C下保溫20min，在505nm下測定吸光度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成I μ mol α -環糊精所需酶量。淀粉水解活力測定方法將適量的酶液加入到含1%可溶性淀粉的50mM磷酸緩沖液中(pH6. 5)，50°C反應lOmin，然后用DNS法測定還原糖濃度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成I μ mol還原糖所需酶量。歧化反應活力測定方法將含有6mM供體底物4-硝基苯基-a-D-麥芽庚糖-4-6-0-亞乙基(EPS)和IOmM受體底物麥芽糖的IOmM檸檬酸緩沖液(pH6. O)在50°C保溫IOmin中，然后加入適當稀釋的酶液O. ImL反應,每O. 5min取100 μ L反應樣品加入20 μ LI. 2MHC1 (4°C )，然后在 60°C保溫 IOmin 使 CGTase 失活。隨后，加入 20 μ LI. 2Μ NaOH中和，將樣品加到磷酸緩沖液(ΡΗ7. 0)，并加入60 μ L (IU) α -糖苷酶于37°C反應60min。加入ImLlM碳酸鈉使樣品pH升至8以上，在401nm波長下側吸光值(ε 401=18. ^iT1)。I單位酶活定義為每分鐘轉化I μ mol的酶的量。AA-2G的合成及檢測方法將適量酶液加入含有麥芽糖和L-AA (終濃度為5%)的醋酸-醋酸鈉緩沖液中(PH5. 5)，于避光避氧條件下37°C反應24h，然后加入10U/mL糖化酶在65°C，pH5. 5條件下反應24h，通過HPLC方法檢測AA-2G產量。HPLC檢測AA-2G產量方法酶反應樣品通過O. 22 μ m濾膜過濾，使用AmethystC18-H 柱(4. 6 X 250mm, Sepax, America)檢測。檢測波長238nm ;流動相0. 05M KH2P04/H3PO4(pH2. O);流速0. 6mL/min。在此條件下,在大約IOmin時會出現AA-2G的流出峰。AA-2G濃度通過峰面積計算而得。 2)酶活比較實驗結果見下表，將上述突變體表達獲得的突變體純酶制品與野生菌純酶制品相比，可以發現與野生型CGTase相比突變體酶K47F、K47Y和K47P α -環化活力分別降低44. 9%, 52. 5%和2. 6% ；突變體酶K47F略微提高6. 5%，Κ47Υ和Κ47Ρ淀粉水解活力分別降低了 62. 2%和68. 7% ；突變體酶K47F、Κ47Υ和Κ47Ρ歧化活力分別提高了 12. 5%, 18. 1%和30. 2% ；突變體酶K47F、Κ47Υ和Κ47Ρ以麥芽糖為糖基供體生成AA-2G產量分別提高了 17. 1%，21· 1% 和 32. 8%ο
相對_fg (%)*AA-2G 產量(g/L)
α-環化活力淀粉水解活歧化話力 +老芽糖為糖S供休
力
.................................CG7kse...............................................................................................................100.................................................................................................................................................100.....................................................................................................................100..............................................................................................................................0J6±0'^03......................................................
K47F55.1 土I. 2士0力 112.5士1.40.89±0.05
K47Y47.5土 L O3 .8±0.8 118.1=0.90.92±0.04
K47P97.4+1.531.3±1.1 130.2 土 1.51.01 ±0.033)不同反應時間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G產量的比較結果列于圖1，可以發現，突變型K47F酶在反應16h時AA-2G達到最高產量；野生型，突變型K47Y和K47P在反應20h時AA-2G達到最高產量。
權利要求
1.一種麥芽糖底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶，以GenbankAF047363. I所示的環糊精葡萄糖基轉移酶為出發序列，其特征在于第47位的賴氨酸突變為苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸。
2.權利要求I所述的環糊精糖基轉移酶，其特征在于第47位的賴氨酸突變脯氨酸。
3.權利要求I所述的環糊精葡萄糖基轉移酶，其特征在于環糊精葡萄糖基轉移酶來源于軟化類芽抱桿菌(Peanibacillus macerans)。
4.一種獲得權利要求I或2所述的環糊精葡萄糖基轉移酶的方法，其特征在于以GenbankAF047363. I公布的基因為出發基因，將第47位的賴氨酸突變成苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸。
5.產權利要求I所述環糊精葡萄糖基轉移酶的基因工程菌或轉基因細胞系。
6.權利要求4所述產環糊精葡萄糖基轉移酶基因工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟 1)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求I所述環糊精葡萄糖基轉移酶基因； 2)將步驟I)獲得的環糊精葡萄糖基轉移酶基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體； 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
7.權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述表達載體為pET-20b(+)。
8.應用權利要求5所述基因工程菌發酵生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法，其特征在于以產環糊精葡萄糖基轉移酶突變體的基因工程菌為生產菌株，活化后按4%接種量將種子發酵液接到含100 u g/mL氨芐青霉素的TB液體培養基；大腸桿菌在30°C搖床培養至OD600=O. 6，加入0. OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續培養發酵90h后，將發酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集富含環糊精葡萄糖基轉移酶的上清液。
全文摘要
本發明公開了一種麥芽糖底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶及其制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領域。本發明通過對P.macerans strain JFB05-01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的47位的賴氨酸(Lys)分別替換為苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)，使AA-2G產量分別提高了17.1%，22.1%和32.9%。這些突變株比野生型CGTase更利于利用麥芽糖為糖基供體生產AA-2G，具有重要的工業應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102965353SQ201210527870
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 韓瑞枝 申請人:江南大學