專利名稱：一種對枇杷枝條和葉片同時致病的真菌以及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物真菌，特別是，屬于一種可以同時對枇杷葉片和枝條致病的真菌以及對該真菌的用途。
背景技術：
枇杷iEriobotrya Japonica )是一種亞熱帶果樹,原產中國，果實酸甜可口，葉片可入藥，具有清熱、潤肺、止咳化痰等功效。
擬盤多毛孢屬iPestalotiopsis)真菌可引起枇杷上多種葉部病害，在葉片上形成圓形或不規則形灰褐色病斑，直徑2-13mm，發病重時病斑可連接在一起，病害后期病斑處長出黑色小點。如 Pestalotiopsis eriobotrifolia、Pestalotiopsiseriobotryae-japonica引起的枇杷葉部病害。通常可從葉片的病健交界處分離獲得致病菌，并純化保存菌種，可以利用這些菌種對枇杷進行抗病性鑒定和篩選，最終獲得抗該病原菌的枇杷新品種，也可以利用這些菌種進行其它實驗研究，例如用于研究和開發防治或防止枇杷該病害的藥劑。
發明內容
本發明研究小組在枇杷枝條上發現一種新的致病菌，聚多擬盤多毛孢iPestalotiopsis sydowiana),該病菌既可以對枇杷的葉片致病，也可以使枇杷枝條致病。這與其他以往只在枇杷葉片上發現的擬盤多毛孢屬致病菌不同。基于其在枇杷枝條上的新致病性狀，該致病菌可以作為枇杷抗病性育種的一種新的便利工具。利用該病原菌進行抗病性鑒定可以獲得的抗該病害的枇杷新品種，篩選出葉片和枝條均抗聚多擬盤多毛孢iPestalotiopsis sydowiana)的批杷新品種。一方面，本發明提供一種對枇杷枝條和葉片同時致病的真菌，該真菌為中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC NO. 6493的聚多擬盤多毛孢(Pestalotiopsissydowiana)
一方面，本發明提供一種用于枇杷枝條抗病性育種篩選的真菌，該真菌為在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC NO. 6493的聚多擬盤多毛孢(Pestalotiopsis sydowiana)。優選的方式中，該病菌既可以讓枇杷葉片感病，又可以讓枇杷的枝條發病。另一方面，本發明提保藏號為CGMCC NO. 6493的聚多擬盤多毛孢{Pestalotiopsis sydowiana)真菌，作為枇杷抗病性育種篩選的應用。在優選的方式中，把病菌同時接種在枇杷葉片和枇杷的枝條上。在一些優選的方式中，用IO6個/mL的該真菌的分生孢子懸浮液接種到離體的枇杷嫩莖或活體的枇杷嫩莖上。本發明還提供一種篩選枇杷抗病性品種的方法，該方法包括提供保藏號為CGMCC NO. 6493的真菌，或通過培養保藏號為6493的真菌，聚多擬盤多毛孢(Pestalotio^is yoWiaflaA獲裔分生孢子懸浮液,濃度為IO6個/mL;把菌絲或分生孢子懸浮液接種到枇杷的枝葉上；接種處用透明塑料袋包裹，內置棉花保濕，置于20-30°C的溫室大棚培養48 h ;然后去除塑料袋，進行日常的栽培管理；
觀察枇杷的枝條感病或抗病，獲得抗聚多擬盤多毛孢sydowiana)的枇杷品種。保藏信息
編號NNH-B-4的菌株的保藏日期為2012年9月3日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為=CGMCC No. 6493，中文名稱為聚多擬盤多毛孢，拉丁文學名為-.Pestalotiopsis sydowiana。
有益效果
本發明分離純化的真菌即可以對枇杷的葉片和枝條致病，為鑒定篩選抗該真菌的枇杷新品種提供了新的途徑，可以避免傳統方法篩選出現假抗病的現象。
實施例實施例I :病原分離物的分離純化
于2012年2月15日采集于浙江寧波寧海的枇杷干枯病的典型病枝，切取病健交界的小塊莖或葉片組織，置于弱酸性PSA培養基(土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂18 g，水IOOOmL,pH 6.0)，培養3 d。對長出的所有不同菌落，挑取少量菌絲進行分離。對分離后的不同分離物進行單胞培養，獲得病原分離物13個。這些病原分離物在25°C光照培養箱進行培養，至產生大量分生孢子器。實施例2 :致病性接種初步鑒定
對在實施例I中獲得的13個病原分離物進行致病性接種鑒定。鑒定方法采用枇杷離體嫩莖接種方法分別用分離物的菌絲塊(5X20 mm)和分生孢子懸浮液(IO6個/mL)接種離體的枇杷嫩莖。嫩莖截成8 cm長的小段，菌絲塊接種在傷口上，傷口用棉花保濕，緊密包裹嫩莖。分生孢子液用小型噴霧器均勻噴灑在嫩莖上；各處理置于9 cm的培養皿中，于25°C光照培養箱保濕培養10 d (12 h光照/12 h黑暗)，每個處理重復3次。其中接種4 d和10 d后編號為NNH-B-4的菌絲塊和分生孢子液接種處分別出現了莖部褐變癥狀。而其他12個分離物則與對照相同，沒有明顯癥狀。對照處理為無菌水，接種方法和處理時間同上。實施例3 :致病性接種田間活體鑒定
為了進一步說明NNH-B-4的致病性，用I年生的原寄主“寧海白”枇杷苗進行活體接種分別用NNH-B-4的菌絲塊和分生孢子液接種枇杷苗，接種莖干和葉片，接種方法同上，接種處用透明塑料袋包裹，內置棉花保濕，置于20-30°C的溫室大棚培養48 h。然后去除塑料袋，進行日常的栽培管理。每個處理3個重復。接種4 d后，菌絲塊接種的枇杷苗最先出現病癥——莖部變褐，葉片自葉柄沿葉脈向外枯黃變褐；接種15 d后，分生孢子液接種處出現干枯病的典型病癥。因此，分離物NNH-B-4是引起枇杷干枯病的致病真菌。實施例4 :病原培養鑒定
于25°C培養病原菌NNH-B-4，其在PSA培養基上形成白色絨毛狀菌落，具痂狀輪紋，背面密黃色。25°C培養7 d后產生黑色小團狀子實體(485. 4 - 385. 6 μ m)。分生孢子5細胞，梭形或紡錘形，直或略彎曲，20. 9-29.8X7. 1-14. 5 μ m ;中間3色胞異色，第1、2色胞深褐色，第3色胞淺褐色，分隔處縊縮；頂孢無色，三角形，具2-3根附屬絲，大角度分開，長12. 0-33. I μ m ;尾孢無色，三角形或圓錐形，具中生式柄I根，長3. 3-7. 8 μ m,尾孢細胞大于頂孢細胞。根據該分離物的形態特征初步鑒定該菌為sydowiarm。實施例5 :病原菌分子鑒定
用引物 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和 ITSl (5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ) PCR擴增該病原菌的rDNA Internal Transcibed Spacer序列(ITS),經測序獲得一個 550 bp 的序列，具體序列如下TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTATAGAGITTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTA ATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。該序列在 Genbank 中檢索發現其與Pestalotiopsis sydowiana 的相似性高達 99%。綜合培養形態與ITS分子鑒定結果認為引起枇杷干枯病的病原菌為擬盤多毛孢屬聚多擬盤多毛抱{Pestalotiopsis sydowiana) 實施例6 :病原菌的用途
Pestalotiopsis屬真菌可引起枇杷上多種葉部病害,在葉片上形成圓形或不規則形灰褐色病斑，直徑2_13mm,發病重時病斑可連接在一起，病害后期病斑處長出黑色小點。如Pestalotiopsis eriobotri folia'Pestalotiopsis eri obo tryae-japoni ca 弓 I起白勺樸匕把口十部病害。尚未有報道由屬病原菌引起的枇杷枝條病害。以往的文獻資料報道聚多毛孢對杜醇、茶樹等植物致病，這是首次發現sydowiana能夠對枇杷致病。其能引起枇杷的嫩莖枯萎，葉片產生大病斑(直徑大于20 mm)，枝條枯死，嚴重時整棵樹死亡。用A eriobotrifolia (由浙江大學農業生物技術學院徐同教授惠贈)、P.eri obo tryae-japoni ca (由浙江大學農業生物技術學院徐同教授惠贈):私本發明的P.
的菌絲塊對枇杷離體葉片和枝條進行接種比較。5 mm2的菌絲塊對枇杷莖的接種方法同上，每個莖接種一個菌絲塊；5 mm2的菌絲塊等距離放置在枇杷葉片葉脈的一偵牝每個菌絲塊相距約40 mm, 一個葉片最多放置3個菌絲塊，每個處理重復3次。于25°C光照培養箱保濕培養10 d (12 h光照/12 h黑暗)，結果發現A eriobotrifolia M P.eri obo tryae-japoni ca只能對枇杷葉片致病,產生小的圓形或不規則形病斑；而本發明的P. SjOrOffiaaa對葉片和枝條都有非常好的致病效果。A SjOrOffiaaa接種4 d后枝條和葉片出現病癥，枝條發病處褐變，僵硬，長約5mm ;枝條病斑擴展稍緩慢，而葉片病斑擴展迅速，接種第8天時葉片病斑已經大于20 mm，其病斑初期主要在葉肉間擴展，后期侵染葉脈，導致葉片整個死亡。表I /I eriobotrifolia、P. eriobotryae-japonica 取P. SjOrOffiaaa 的致病性。
權利要求
1.一種對枇杷枝條和葉片同時致病的真菌，該真菌為中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC NO. 6493的聚多擬盤多毛孢的NNH_B_4 菌株。
2.—種篩選枇杷抗病性品種的方法，該方法包括通過培養保藏號為CGMCC NO. 6493的聚多擬盤多毛孢sydowiana)的NNH_B_4菌株，資淳分生孢子懸浮液，讓其濃度為IO6個/mL;把菌絲或分生孢子懸浮液接種到枇杷的枝條和頁葉上；接種處用透明塑料袋包裹，內置棉花保濕，置于20-30°C的溫室大棚培養48 h;然后去除塑料袋，進行日常的栽培管理；觀察枇杷的枝條感病或抗病情況，獲得抗聚多擬盤多毛孢(Pes talo ti op si s sydowiana)的批杷品種。
3.—種利用中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC NO. 6493的聚多擬盤多毛孢sydowiana)的NNH-B-4菌株作為枇杷抗病育種的用途。
全文摘要
本發明提供一種對枇杷枝條和葉片同時致病的真菌，該真菌為中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC NO.6493的聚多擬盤多毛孢(Pestalotiopsissydowiana)以及該真菌的用途。本發明分離純化的真菌既可以對枇杷的葉片和枝條致病，為鑒定篩選抗該真菌的枇杷新品種提供了新的途徑，可以避免傳統方法篩選出現假抗病的現象。
文檔編號C12R1/645GK102965289SQ201210515360
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者方麗, 王漢榮 申請人:浙江省農業科學院