專利名稱：一段單純皰疹病毒dna序列及應用的制作方法
技術領域：
:發明涉及一段單純皰疹病毒HSV的DNA序列及應用，屬于生物醫學技術領域。
背景技術：
:單純皰疫病毒(Herpes simplexvirus, HSv)呈球形,完整病毒由核心、衣殼、被膜(Tegument)及囊膜組成核心含雙股DNA，纏繞成纖絲卷軸。衣殼呈二十面體對稱，由162殼微粒組成，直徑lOOnm。衣殼外一層被膜覆蓋，厚薄不勻，最外層為典型的脂質雙層囊膜，上有突起。有囊膜的病毒直徑為150 200nm。囊膜表面含gb、gC、gD、gE、gG、gH糖蛋白，與病毒對細胞吸附/穿入(gB gC gD ge)、控制病毒從細胞核膜出芽釋放(gH)及誘導細胞融合(gbgC gD gH)有關。并有誘生中和抗體(gd最強)和細胞毒作用(已知的HSV糖蛋白均可)。HSV基因組為一線性DNA分子，由共價連接的長片段(L)和短片段(S)組成。每片段均含有單一序列和反轉重復序列。基因組中有72個基因，共編碼70各異的蛋白質，其中除24種蛋白的特性還不清楚外，有18種編碼蛋白組成病毒DNA結合蛋白及各種酶類，參予病毒DNA合成，包裝及核苷酸的代謝等。30多種不同蛋白組成病毒結構蛋白(如衣殼蛋白、囊膜蛋白)，在保護HSV的DNA，以及HSV的致病作用和誘導機體免疫應答中起重要作用。HSV可在多種細胞中生長，常用的細胞系有BHK細胞，Vero細胞、Hep-2細胞等。病毒初次分離時，原代乳兔腎細胞、人胚肺細胞較敏感。HSV感染動物范圍廣泛，多種動物腦內接種可引起皰疹性腦炎，小白鼠是足墊接種可引起中樞神經系統致死性感染，家兔角膜接種引起皰疹性角膜炎，豚鼠陰道內接種可引起宮頸炎和宮頸癌。接種雞胚絨毛尿囊膜上，形成增殖性白色斑塊。病毒主要通過直接密切接觸和`性接觸傳播。HSV經口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破損皮膚等多種途徑侵入機體。人感染非常普遍，感染率達80 90%，常見的臨床表現是粘膜或皮膚局部集聚的皰疹，偶而也可發生嚴重的全身性疾病，累及內臟。6個月以內嬰兒多從母體通過胎盤獲得抗體，初次感染約90%無臨床癥狀，多為隱性感染。原發感染常發生于I 15歲，常見的有齦口炎，系在口頰粘膜和齒齦處發生成群皰疹，破裂后，多蓋一層壞死組織。此外可引起唇皰疹、濕疹樣皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性腦炎等。生殖器皰疹多見于14歲以后，比較嚴重，局部劇痛，伴有發熱全身不適及淋巴結炎。HSV原發感染產生免疫力后，部分病毒可沿神經髓鞘到達三叉神經節和脊神經節細胞中或周圍星形神經膠質細胞內，以潛伏狀態持續存在，與機體處于相對平衡，不引起臨床癥狀。當機體發熱、受寒、日曬、月經、情緒緊張，使用垂體或腎上腺皮質激素，遭受某些細菌病毒感染等，潛伏的病毒激活增殖，沿神經纖維索下行至感覺神經末梢，至附近表皮細胞內繼續增殖，引起復發性局部皰疹。其特點是每次復發病變往往發生于同一部位。最常見在唇鼻間皮膚與粘膜交界處出現成群的小皰疹。皰疹性角膜炎、皰疹性宮頸炎等亦可反復發作。HSV通過胎盤感染，影響胚胎細胞有絲分裂，易發生流產、造成胎兒畸形、智力低下等先天性疾病。約40 60%的新生兒在通過感染的產道時可被感染，出現高熱、呼吸困難和中樞神經系統病變，其中60 70%受染新生」L可因此而死亡,幸存者中后遺癥可達95%
發明內容
:本發明在于通過生物信息學和分子生物學技術，確定了一段單純皰疫病毒HSV的DNA序列及其PCR引物，該序列和相應的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法進行一段單純皰疹病毒的診斷。本發明的技術方案為:本發明確定了長度為217bp的一段單純皰疹病毒(HSV)DNA序列及其引物，用所述的引物進行PCR擴增，其序列如下:GTCTGTTTGG GCTTGTCGTT ATGGGAGCCT GGGGGGCGTG GGGTGGGTCA CAGGCAACCG 60AATATGTTCT TCGTAGTGTT ATTGCCAAAG AGGTGGGGGA CATACTAAGA GTGCCTTGCA 120TGCGGACCCC CGCGGACGAT GTTTCTTGGC GCTACGAGGC CCCGTCCGTT ATTGACTATG 180CCCGCGTAGA CGGAATATTT CTTCGCTATC ACTGCCC217擴增PCR引物為:A.5’ -GTCTGTTTGG GCTTGTCGTT-3’B.5， -GGGCAGTGAT AGCGAAGAAA-3，。
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上述一段單純皰疹病毒(HSV)DNA序列用于診斷HSV的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進行PCR擴增，標記后進行雜交檢測或直接用于PCR診斷。本發明建立的臨床檢測技術所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低廉等優點。
: 圖1為臨床標本的PCR擴增圖譜。圖2為該序列的測序圖譜。圖3是用Blast軟件對PCR擴增產物的測序結果與預計序列的比較分析。圖4是基因數據庫中Blast搜索結果。圖5及圖5續是基因芯片雜交結果。
具體實施方式
:首先以單純皰疹病毒為關鍵詞，在基因數據庫中搜索皰疹病毒的核苷酸序列。共獲得數條關系密切的核苷酸序列，將這些核苷酸序列用NCBI網上的Blast在線使用軟件比對基因數據庫中的核苷酸序列(nr)，排除非特異性的核苷酸序列，獲得了 217bp特異性的核苷酸序列，以這段序列設計了 I對PCR引物，以臨床標本提取DNA，進行PCR擴增，篩選到一對適合進行PCR擴增的序列及引物，PCR擴增獲得的產物于預計大小一致，見圖1，圖中序號為:1.標準分子量DNA，分子量大小從上之下分別為:600, 500, 400, 300, 200, 100 ；2.臨床陽性標本，擴增產物很純，大小200左右，與預計大小一致；3.臨床陰性標本，沒有擴增產物。圖譜結果顯示用本發明中的引物能特異的擴增臨床樣品。然后用T-vector進行克隆，并測序，測序報告見圖2，從途中46開始，到262位，共217bp為克隆序列，其余序列為克隆載體序列，序列為217bp，通過Blast軟件比對預計序列，顯示與預計的序列一致，見圖3，所有序列均與預計序列一致，表明該序列可以被特異性的擴增，可用于HSV的PCR檢測。序列用NCBI網站的Blast搜索基因數據庫的DNA (包含cDNA)序列，該序列只與HSV的序列一致，而與其它物種序列沒有同源性，見圖4，搜尋結果表明，只有HSV的質粒DNA序列于本序列同源，并且是完全配對，而其它序列只有短序列與之配對，而且由于這些序列沒有引物與此配對，故在檢測中不會被檢測到。用這一序列標記后作為探針與含有泌尿生殖道感染性疾病及15亞型HPV的另外18種病毒的感染病原物的80個位點的基因芯片雜交，只有本發明序列與此有雜交信號，而其它所有序列與此無雜交信號，見圖5、圖5續，圖中是四個重復，雜交結果表明只有本序列有特異信號，而其它均無雜交信號，表明該序列為HSV病毒的特異序列。本發明可用于PCR方法或基因芯片方法進行泌尿生殖道感染性疾病及15亞型HPV的臨床檢測。用本發明提供的序列進行PCR擴增，根據PCR方法獲得產物是否出現和大小判斷是否為HSV病毒的感染。也可用于本序列為探針，作為基因芯片中的一個檢測位點，然后用本發明中的PCR引物序列擴增臨床標本，并標記后進行雜交檢測。HSV序列表說明書序列表Organization Applicant----------------------Street:云南省昆明市經開區信息產業基地海歸創業園3幢6樓City:昆明市State:云南 省Country:中國PostalCode:650000PhoneNumber:0871-8314895FaxNumber:0871-8318952EmailAddress:kmydshl999il63.com<110>0rganizationName:昆明寰基生物芯片開發有限公司Application Project-------------------<120>Title:<130>AppFileReference:<140>CurrentAppNumber:<141>CurrentFilingDate:_-—-—Sequence--------<213>0rganismName:Herpes simplex virus<400>PreSequenceString:GTCTGTTTGG GCTTGTCGTT ATGGGAGCCT GGGGGGCGTG GGGTGGGTCA CAGGCAACCG 60AATATGTTCT TCGTAGTGTT ATTGCCAAAG AGGTGGGGGA CATACTAAGA GTGCCTTGCA 120
TGCGGACCCC CGCGGACGAT GTTTCTTGGC GCTACGAGGC CCCGTCCGTT ATTGACTATG 180CCCGCGTAGA CGGAATATTT CTTCGCTATC ACTGCCC217<212>Type:DNA〈21 l>Length: 217
SequenceName: 一段單純痕疫病毒(HSV) DNA檢測序列。
權利要求
1.一段單純皰疹病毒DNA序列，其特征在于，該序列的長度為217bp，序列如下:GTCTGTTTGG GCTTGTCGTT ATGGGAGCCT GGGGGGCGTG GGGTGGGTCA CAGGCAACCG 60AATATGTTCT TCGTAGTGTT ATTGCCAAAG AGGTGGGGGA CATACTAAGA GTGCCTTGCA 120TGCGGACCCC CGCGGACGAT GTTTCTTGGC GCTACGAGGC CCCGTCCGTT ATTGACTATG 180CCCGCGTAGA CGGAATATTT CTTCGCTATC ACTGCCC217擴增PCR引物為:A.5’ -GTCTGTTTGG GCTTGTCGTT-3’B.5’ -GGGCAGTGAT AGCGAAGAAA-3’。
2.如權利要求1所述的一段單純皰疹病毒DNA序列的應用，其特征在于該序列作為用于檢測單純皰疹病毒的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進行PCR擴增，標記后進行雜交檢測或直接用于 PCR檢測。
全文摘要
本發明涉及一段單純皰疹病毒DNA序列及應用，屬于生物醫學技術領域。本發明通過基因數據庫資料的搜索和分析，確定了一段單純皰疹病毒DNA的特異性及PCR擴增引物，該序列長度為217bp。通過對人類單純皰疹病毒感染標本的PCR擴增，克隆，獲得該序列，測序證明與預計序列一致。再經生物信息學方法分析，基因芯片雜交分析，結果證實了該序列對于單純皰疹病毒DNA的特異性。本發明作為基因芯片診斷的探針及PCR擴增檢測序列，用于單純皰疹病毒的診斷。用本發明建立的臨床檢測技術所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優點。
文檔編號C12Q1/70GK103074337SQ20121051362
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者馬明星 申請人:昆明寰基生物芯片產業有限公司