專利名稱：一種普魯蘭酶XWPu2及其基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說是一種嗜堿性類芽孢桿菌XW-6-66來源的I型普魯蘭酶XWPu2及其基因。
背景技術：
普魯蘭酶(Pullulanase, E C 3.2. I. 41)即a -糊精-6-葡聚糖水解酶,能專一性地水解多糖的a -1,6-糖苷鍵,使支鏈型多糖的分支鏈脫支,形成一系列鏈長不一的直鏈淀粉(Yu B，Wang J P，Zhang H X，et al. Molecules, 2011，16:3010-3017)。在淀粉水解過程中，普魯蘭酶與a-淀粉酶、糖化酶配合使用，可以將淀粉徹底降解為葡萄糖；與
淀粉酶配合用時可以將淀粉完全轉化成麥芽糖，在淀粉加工中發揮著重要作用。另外，普魯蘭酶與其他糖苷水解酶類協同作用于不同類型底物還可以獲得不同類型的終產物，因此，普魯蘭酶在化工和制藥等行業中是一種不可或缺的酶類。普魯蘭酶是一種重要的工業用酶，然而天然菌株產酶低、難以大量生產，生產成本高，限制了其推廣應用。利用分子生物學手段構建高效生物反應器，可以提高普魯蘭酶的表達量，實現其大規模工業化生產。本文從嗜堿性類芽孢桿菌sp.)XW-6-66基因組中克隆普魯蘭酶基因JT/如 與表達載體pET28a(+)連接后，轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導表達并對普魯蘭酶XWPu2酶學性質及水解淀粉、多糖進行了初步研究，為后期推廣普魯蘭酶的應用奠定了一定的基礎。
發明內容
本發明的目的是提供一種普魯蘭酶XWPu2。本發明的再一目的是提供編碼上述普魯蘭酶XWPu2的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發明所述普魯蘭酶XWPu2來自嗜堿性類芽孢桿菌iPaenibacillus sp. )，XWPu2的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發明的普魯蘭酶XWPu2總共含有653個氨基酸，理論分子量為74. 02 kDa。以普魯蘭糖為底物最適溫度50°C ;最適pH5. 8-6. 8 ;終濃度I mM的P -巰基乙醇和I mM金屬離子 Ca2+、Mn2+、Fe2+ 和 K+ 對酶有較強的激活作用，Cu2+、Hg+、Co+、Zn2+、Pb+、SDS 和 EDTA有較強的抑制作用；普魯蘭酶XWPu2熱穩定性研究表明，37 1和50 °C保溫140 min殘余酶活依次在84%和52%以上；pH穩定性研究表明，pH5. 0、pH5. 8和pH8. 6的緩沖液下處理90 min殘余酶活依次在74%、74. 5%和57%以上；普魯蘭酶XWPu2的比活力為383. 5 U/mg。此外，薄層層析定性分析普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普魯蘭酶XWPu2在食品、化工、制藥、能源等行業中有潛在的應用前景。本發明提供了編碼上述普魯蘭酶的基因XWPu2，該基因序列如SEQ ID NO. 2。
本發明通過PCR的方法克隆了普魯蘭酶XWPu2的編碼基因JT/如 ，其全長1959bp,起始密碼為 ATG,終止密碼為 TAA。經 BLAST 在 GeneBank(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)數據庫進行比對分析,該普魯蘭酶基因編碼的氨基酸序列與GeneBank中Paenibacillus Iactis 154來源的潛在I型普魯蘭酶(ZP_09000293. I)具有最高一致性，
'與Paenibac illus vortex V453來源潛在 I 型普魯蘭酶(ZP_07901047. I)具有最高一致性，為65%，說明普魯蘭酶JT/如 是一種新的普魯蘭酶。本發明還提供了包含上述普魯蘭酶基因JT/如 的重組載體，優選為pET-JT/如 。將本發明的普魯蘭酶基因插入到表達載體合適的限制性內切酶位點之間，使其核苷酸序列與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，將本發明的普魯蘭酶基因插入到質粒pET-28a(+)上的及^7 I和通o I限制性酶切位點之間，得到重組大腸桿菌表達質粒 pET-JT/^J。本發明還提供了包含上述普魯蘭酶基因JT/如 的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株現^ (DE3)/ XWPu2。本發明制備普魯蘭酶XWPU2的方法按以下步驟進行
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養重組菌株，誘導重組普魯蘭酶表達；
3)回收并純化所表達的普魯蘭酶XWPu2。其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株現之2 (DE3)/ XWPu2。本發明提供了一個新的普魯蘭酶基因，其編碼的普魯蘭酶以普魯蘭糖為底物最適溫度50°C;最適pH5. 8-6. 8 ;終濃度I mM的P -巰基乙醇和I mM金屬離子Ca2+、Mn2+、Fe2+和K+對酶有較強的激活作用，Cu2+、Hg+、Co+、Zn2+、Pb+、SDS和EDTA有較強的抑制作用；普魯蘭酶XWPu2熱穩定性研究表明，37°C和50 °C保溫140 min殘余酶活依次在84%和52%以上；pH穩定性研究表明，pH5. 0、pH5. 8和pH8. 6的緩沖液下處理90 min殘余酶活依次在74%,74. 5%和57%以上；普魯蘭酶XWPu2的比活力為383. 5 U/mg。此外，薄層層析定性分析普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普魯蘭酶XWPu2在食品、化工、制藥、能源等行業中有較廣的應用前景。
圖I :在大腸桿菌中表達的重組普魯蘭酶XWPu2的SDS-PAGE分析，其中，M :低分子量蛋白質Marker ；1 :純化的重組普魯蘭酶XWPu2。圖2 :重組普魯蘭酶XWPu2的最適溫度。圖3 :重組普魯蘭酶XWPu2的熱穩定性。圖4 :重組普魯蘭酶XWPu2的最適pH。圖5 :重組普魯蘭酶XWPu2的pH穩定性。圖6 :不同金屬離子及化學試劑對重組普魯蘭酶XWPu2活性的影響。圖7 :薄層層析定性分析重組普魯蘭酶XWPu2的水解產物，其中圖7- (A) :1，麥芽糖標準品；2，普魯蘭糖對照；3，普魯蘭酶XWPu2水解普魯蘭糖；4，麥芽三糖標準品；5，糊精；圖7- (B) 1, a-環糊精對照；2，普魯蘭酶XWPu2水解a -環糊精；3，普魯蘭酶XWPu2水解P -環糊精；4，^ -環糊精對照；5，普魯蘭酶XWPu2水解玉米支鏈淀粉；6，玉米支鏈淀粉對照；7，普魯蘭酶XWPu2水解糊精；8，糊精對照；9，糊精。
具體實施例方式實驗材料和試劑
I、菌株及載體嗜堿性類芽孢桿菌(作洲/如ci77m sp.與保藏編號為CGMCC No. 2096的芽孢桿菌屬菌株LZ-10性質相似);大腸桿菌coli BL21 (DE3)和表達載體pET_28a ( + )可購于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑限制性內切酶、DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；T4連接酶購自Promega公司；普魯蘭糖和玉米支鏈淀粉購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團。3、培養基
LB培養基蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，氯化鈉1%，pH自然(約為7. O)。固體培養基在此基礎上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例I :普魯蘭酶基因XWPu2的克隆
提取嗜堿性類芽孢桿菌如ci77心sp.)基因組DNA =CTAB裂解法，具體步驟為將液體培養12 h的新鮮菌液離心取菌體，加入800 UL溶液I ( 20 mM Tris, pH8. 0, 2 mMNa2-EDTA,終濃度20 mg/mL溶菌酶)，37 °C保溫30 min，加100 u L 10% SDS上下顛倒混勻，再加 10 UL 10 mg/mL 的蛋白酶 K，37 °C保溫 30 min，加 150 u L 5 M NaCl 和 150 u L10% CTAB溶液上下顛倒混勻，65 °C保溫20 min，分裝成600 U L每管，再加入600 yL — /氯仿/異丙醇(體積比25 :24 :1)進行抽提,在4 "€下12000 rpm離心10 min,取上清300iiL于300 U L氯仿/異丙醇(體積比24 :1)中再次抽提除去雜蛋白，4 1下12000 rpm離心10 min，再取上清200 U L并加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的pH5. 2 3 M NaAc,-70°C沉淀lh，4 1下13500 rpm離心20 min，棄上清，再用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，力口入適量TE溶解，置于-20 °C備用。根據嗜堿性類芽孢桿菌(Ami如sp.)全基因組測序及基因注釋分析普魯蘭酶基因XWPu2并設計表達引物CarF和CarR
上游引物 CarF: 5 ’ CCGGAATTCATGGCGGTGCAGAAGGATAGGA 3 ’(劃線部分為 EcoR I 酶切位點)
下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGTTACCTGTCACAGCCGAGAATGACC 3’(劃線部分為ZAo I 酶切位點)
上游引物 17: 5 ’ TAATACGACTCACTATAGGG 3，
下游引物Hter: 5’TGCTAGTTAITGCTCAGCGG 3’為PCR檢測陽性克隆子引物。以嗜堿性類芽孢桿菌如ci77心sp.)基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為94 °C預變性5 min;然后94 °C變性30 sec ；60 °C退火30 sec ；72 °C延伸Imin30 sec ;30個循環后72 °C保溫5 min。PCR純化產物經I和沿o I雙酶切，回收目的片段，再與經過同樣酶切處理過的表達載體pET-28a (+)連接構建質粒pET-JT/如 ，4°C 過夜。取 10 ii I 連接產物 pET-Zr/^/J 轉化到 100 u I Escherichia coli BL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含Kan的LB固體平板上，37 1溫箱培養13 h，從轉化板上挑取幾株單菌落，使用引物(T7，Hter)進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌IBL21 (DE3) /XWPu2。實施例2 :重組普魯蘭酶XWPu2的制備
取含有重組質粒pET-Zr/^/J的Escherichia coli BL21 (DE3)菌株和只含有 pET-28a (+)的空質粒coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB (含50 l^g/mL Kan)培養液中，37 1快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含50吒/mL Kan)培養液中，快速振蕩培養約2-3 h (OD600達到0.6-1. 0)后，加入終濃度0. 7 mM的IPTG進行誘導，于20 1繼續振蕩培養約20 h或26 °C振蕩培養約8 h。12000 rpm離心5 min，收集菌體。用適量的pH7. 0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內濃縮的粗酶液經13，000 rpm離心10 min后,吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結果(圖I)表明，重組普魯蘭酶在大腸桿菌中得到了表達，經Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶,蛋白質分子量大小約74 kDao純化的重組普魯蘭酶XWPu2的性質測定
I、重組普魯蘭酶XWPu2的活性分析
實施例2純化的重組普魯蘭酶XWPu2的活性測定方法采用DNS法取三支10 ml試管，分別編號1、2、3,1號和2號試管為實驗組,3號為對照組。分別向I號、2號和3號試管中加入0.9 ml 1%普魯蘭糖底物(底物為50 mmol/L pH6. 6的磷酸鉀緩沖液配制)，40 °C預熱5 min,向I號和2號試管中加入100 U I適當稀釋的酶液，40 °C水浴鍋中反應30 min，然后向I號、2號和3號試管中加入I. 5 ml DNS終止反應,并將在3號試管中補加100 y I酶液，取出三支試管沸水浴7 min,震蕩混勻，流動冷水冷卻后，在分光光度計540 nm下測定其吸光度值。I個酶活單位(U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物普魯蘭糖生成I ymoL葡萄糖所需要的酶量。2、重組普魯蘭酶XWPu2的最適溫度和熱穩定性的測定
酶的最適溫度的測定將普魯蘭酶XWPu2在含I mM Ca2+的50 mmol/L pH6. 6的磷酸鉀緩沖液下，分別在 23 0C >30 0C >37 0C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 1和 65 °C下進行酶促反應。溫度穩定性的測定將普魯蘭酶XWPu2在含I mM Ca2+的50 mmol/L pH6. 6的磷酸鉀緩沖液下，分別在37。。和50 °C下分別保溫20 min、40 min、60 min、80 min > 100min、120 min、和 140 min 后在溫度 50 °C ,含 I mM Ca2+ 的 50 mmol/L pH6. 6 的憐酸鉀緩沖液進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以1%普魯蘭糖為底物，反應30 min，測定純化普魯蘭酶XWPu2的酶學性質。結果表明XWPu2的最適溫度50°C (圖2) ； 37°C和50 °〇保溫140 min殘余酶活依次在84%和52%以上(圖3)。3、重組普魯蘭酶XWPu2的最適pH和pH穩定性的測定
酶的最適pH的測定將普魯蘭酶XWPu2在最適溫度50 °C，分別在含I mM Ca2+的50 mM醋酸緩沖液(PH3. 6，4. 6，5. 0)、磷酸鉀緩沖液(5. 8，6. 0，6. 2，6. 4，6. 6，6. 8，7. 0，7. 4，7. 6，7. 8,8. 0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(8. 6,9. 0)條件下酶促反應。pH穩定性的測定將普魯蘭酶XWPu2在最適溫度50°C，在含ImM Ca2+的pH5. 0、pH5. 8和pH8. 6緩沖液下分別耐受15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min后進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以1%普魯蘭糖為底物，反應30min，測定純化普魯蘭酶XWPu2的酶學性質。結果表明XWPu2的最適pH6. 6 (圖4);在含ImM Ca2+的50 mM pH5. O、pH5. 8和pH8. 6緩沖液下處理90 min殘余酶活依次在74%、74. 5%和57%以上(圖5)。普魯蘭酶XWPu2的比活力為383. 5U/mg
4、不同金屬離子及化學試劑對重組普魯蘭酶XWP u2活性的影響
在酶促反應體系中加入終濃度I mM的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。以1%普魯蘭糖為底物，在50 °C、pH6. 6條件下，反應30 min，測定純化普魯蘭酶XWPu2的酶活力。結果(圖6)表明，終濃度I mM的￠-巰基乙醇和I mM金屬離子Mn2+、Fe2+、K+和Ca2+對酶有較強的激活作用，Cu2+、Hg2+、Co2+、Zn2+、Pb2+、SDS和EDTA有較強的抑制作用。5、薄層層析定性分析重組普魯蘭酶XWPu2的水解產物
分別以1%普魯蘭糖、1%玉米支鏈淀粉、1% a -環糊精、1% ^ -環糊精和1%糊精為底物，在重組普魯蘭酶XWPu2最適反應條件(pH6. 6，50°C )下進行水解反應30 min,產物經離心并稀釋適當倍數取0. 5 Ul進行薄層層析分析，結果(如圖7)表明，普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環糊精生成葡萄糖。
權利要求
1.一種普魯蘭酶XWPu2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種編碼權利要求I所述的普魯蘭酶XWPu2的普魯蘭酶基因JT/如 ，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權利要求2所述普魯蘭酶基因JT/如 的重組載體。
4.一種包含權利要求2所述普魯蘭酶基因JT/如 的重組菌株。
全文摘要
本發明是一種普魯蘭酶XWPu2及其基因。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，提供普魯蘭酶基因XWPu2的重組載體和重組菌株。本發明以普魯蘭糖為底物的普魯蘭酶XWPu2具有以下性質最適溫度50℃；最適pH5.8-6.8；終濃度1mM的β-巰基乙醇和1mM金屬離子Ca2+、Mn2+、Fe2+和K+對酶有較強的激活作用；37℃和50℃保溫140min殘余酶活依次在84%和52%以上；pH5.0和pH8.6的緩沖液下處理90min殘余酶活在74%和57%以上；比活力383.5U/mg。此外，薄層層析定性分析普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普魯蘭酶XWPu2在食品、化工、制藥、能源等行業中有潛在的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102965361SQ20121051145
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者黃遵錫 申請人:昆明愛科特生物科技有限公司