專利名稱：一種枝孢菌株及其微生物菌劑以及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一株用富集培養的方法從活性污泥中自行分離得到并能高效降解廢水中纖維素的菌株(HRZ008)及其應用。
背景技術：
造紙工業是世界6大工業污染源之一，占我國工業廢水總量的10%左右。造紙廢水中含有大量的纖維懸浮物，其中粒徑較大的懸浮物會被格柵或篩網截留下來，用于末端回收；其他的細小纖維則會進入后續的生物處理過程。生物處理可以有效降低纖維素廢水的污染負荷，提高廢水的可生化性，是一種經濟、有效且環保的方法。但纖維素是一種難降解的高分子有機物，它的生物降解依賴于纖維素降解菌的生理過程；因此，如果能篩選到一株對纖維素有較強降解能力的穩定菌株，并將它制成菌劑，投加到廢水處理系統中，則可以調節菌群結構、提高微生物活性，從而提高廢水中纖維素的降解效率。在無酶、中性pH的環境中，纖維素的半衰期約為幾百萬年，因此微生物在自然界的纖維素降解過程中起著舉足輕重的作用。隨著資源與環境問題的日益突出，開發、尋找能夠有效降解、利用纖維素的微生物已成為眾多學者關注的熱點，從自然界中篩選得到高效降解菌的方法也備受采用。篩選纖維素降解菌常用的方法是從纖維素的富集地采集樣品，經富集培養、平板劃線等操作，分離得到單菌落，然后經馴化培養或紫外誘變等方法獲取高效降解菌株，或通過細胞工程、基因工程等技術手段構建工程菌株。目前，文獻報道的纖維素高效降解菌主要分離自垃圾堆肥、土壤、瘤胃、朽木等，而且大多集中在木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、熱單抱菌屬(Thermomonospora)、鏈霉屬(Ambofaciens)等少數幾個屬,極少見到從廢水處理系統中分離高效降解菌的研究,對于廢水中是否存在類似的降解菌、屬于哪一種菌、菌的降解能力如何等問題也知之甚少。因此，從纖維素富集的造紙廢水處理系統中采集活性污泥，通過富集培養、分離純化，獲得高效降解菌并應用于實踐，對于降低纖維素在環境中的污染具有現實意義。
發明內容
本發明目的之一在于提供一株從活性污泥中自行分離得到的枝孢菌株。本發明目的之二在于提供利用上述菌株制備微生物菌劑的方法。本發明目的之三在于提供上述方法制備的微生物菌劑。本發明目的之四在于提供上述枝孢菌株在高效降解廢水中纖維素的應用。本發明所提供的降解纖維素的菌株從A/0工藝反應器的活性污泥中分離得到，是一株具有較高活力、對纖維素有較強降解能力的菌株，其培養方法簡單，生長速度快，不易變異，制成菌劑后可以直接用于廢水生物處理。將其編號為HRZ008，保藏于4°C冰箱中。該菌株的形態特征為在查氏酵母膏瓊脂培養基(CYA)上生長7天后，菌落呈絨狀，有少量溝紋，表面灰綠色，反面黑綠色；分生孢子梗側生在菌絲上，不分枝，單生，分隔處不縊縮，直 立，淡褐色，具孢痕，枝孢0 I個隔膜，分生孢子頂生或側生，橢圓形，圓柱體，形似球狀，淡褐色，平滑，無隔膜，大小為(3. 5iim 8. 0iim)X(2. 5iim 4.1 u m)0該菌株的18S rDNA序列(1637bp)已經遞交到GenBank數據庫。在http://www. ncb1. nlm. nih. gov/網站上用BLAST程序與已登錄真菌菌株的18SrDNA序列進行比較,結果表明與Cladosporium (枝孢屬)相似性最高，同源性高達100%。所述HRZ008菌株的培養方法將該菌菌體接到菌種保藏培養基上，在30°C下生長3 5d，挑取菌體到活化培養基中，在30°C下培養5d，經離心可以獲得該菌株的純細胞。上述枝孢屬(Cladosporium sp. ) HRZ008,由中國典型培養物保藏中心保藏,其簡稱為CCTCC，保藏編號是CCTCC No:M2012363，保藏日期為2012年9月19日，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學內。一種微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟
(I)菌種活化挑取枝孢菌株HRZ008至菌種保藏培養基，30°C平板劃線、挑取單菌落培養兩次后，挑取少量接種于活化培養基中，于30°C、180r/min搖床震蕩培養24h ；(2)液態發酵向裝有滅菌后的種子培養基中，按照10%的接種量接種枝孢菌株HRZ008，于30°C下，通空氣培養48h，得到活菌體發酵液；(3)菌劑制備培養好的發酵液經0D_測定后，超濾濃縮，調節其吸光度至1.0，加入體積分數50%的甘油保藏即可。優選地,所述菌種保藏培養基為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，加水至1L，調節 pH=7. 0,在 121°C下滅菌 20min。優選地，所述菌種活化培養基為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、加水至1L，調節pH=7. 0,在 115°C下滅菌 15min。優選地，所述種子培養基為80目以下的微晶纖維素1. Og、CO(NH2)28. Omg, NH4Cl14. 3mg、KH2P046. 6mg>MgSO4 7H20 30. 0mg> CoCl2 6H2020. 0mg、NaHC0320. 5mg、CaCl212. 9mg、MnSO4 H2O 2. lmg、FeSO4 7H2010. 4mg、ZnCl25. 5mg，調節 pH=7. 0，在 115°C下滅菌 15min。所述菌株HRZ008在降解廢水中纖維素的應用。尤其是該菌株能使廢水中的羧甲基纖維素、微晶纖維素和濾紙有效降解。優選地，將上述方法制得的微生物菌劑先用水稀釋，然后用于降解廢水中纖維素。所述菌株的降解培養基優選以下3種(I)羧甲基纖維素(CMC) -剛果紅培養基(1L):CMC (加熱溶解)2. Og、剛果紅0. 2g、K2HPO4O. 5g、(NH4) 2S042. Og、MgSO4 7H20 0. 25g、瓊脂 20g，調節 pH=7. 0。(2)微晶纖維素(MCC)-剛果紅培養基(1L):MCC (200目以下)1. Og、剛果紅0. 2g、K2HPO4O. 5g、(NH4) 2S042. 0g、MgSO4 7H20 0. 25g、瓊脂 20g，調節 pH=7. 0。(3)液體降解培養基(IL) :MCC (200目以下)1. Og或質量為(50±0. 5) mg的濾紙條 10 條、K2HPO4O. 5g、(NH4) 2S042. 0g、MgSO4 7H20 0. 25g，調節 pH=7. 0。與現有技術相比，本發明具有如下優點DHRZ008菌株生長速度快，不易變異，能夠有效降解廢水中的纖維素，提高廢水處理效果，優化出水水質，制成菌劑后可以直接用于廢水生物處理。2)菌種活化及菌劑制備的方法簡單易行、經濟廉價，在實踐中有較好的應用前景。3)以長期處理造紙廢水的生物系統為研究對象，所得的高效降解菌是系統中的土著菌，制成菌劑投加后不易被排斥，效果會更好。
4)經鑒定，HRZ008菌株是新發現的菌種；同時，枝孢屬也是本次新發現的對纖維素有較強降解能力的菌屬，它在以羧甲基纖維素、微晶纖維素或濾紙為唯一碳源的培養基中生長良好，對羧甲基纖維素、微晶纖維素和濾紙均有良好的降解效果。
圖1是本發明菌株HRZ008的平板圖。圖2是本發明菌株HRZ008的顯微圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1微生物菌劑的制備方法具體如下1、培養基配制I)菌種保藏培養基(固體，1L):馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，加水至1L，調節 pH=7. 0,在 121°C下滅菌 20min ；2)菌種活化培養基(液體，1L):馬鈴薯200g、葡萄糖20g、加水至1L，調節pH=7. 0，在115°C下滅菌15min ；3)種子培養基(液體，1L):微晶纖維素(80目以下)1. Og、CO(NH2)28. Omg, NH4Cl14. 3mg、KH2P046 . 6mg、MgSO4 7H20 30. Omg, CoCl2 6H20 20. Omg, NaHCO3 20. 5mg、CaCl2
12.9mg、MnS04 H202. lmg, FeSO4 7H20 10. 4mg、ZnCl2 5. 5mg，調節 pH=7. 0，在 115°C下滅菌15min。2、菌種活化挑取菌株HRZ008至菌種保藏培養基，30°C平板劃線、挑取單菌落培養兩次后，挑取少量接種于活化培養基中，于30°C、180r/min搖床震蕩培養24h。3、液態發酵向裝有滅菌后的種子培養基中，按照10%的接種量接種菌株HRZ008，于30°C下，通空氣培養48h，得到活菌體發酵液。4、菌劑制備培養好的發酵液經OD6tltl測定后，超濾濃縮，調節其吸光度至1.0，加入甘油(體積分數50%)，灌裝保藏，使用時用水稀釋500倍。實施例2 HRZ008菌株對固體降解培養基中羧甲基纖維素(CMC)和微晶纖維素(MCC)的降解效果第I 步用水將菌劑稀釋500倍，配成待用菌液；第2 步用滅菌后的接種環沾取少量菌液，輕輕地在平板上接三點，即在等邊三角形的三個頂點上接種，再將平板倒置，于30°C恒溫培養箱中培養；第3 步選取長勢良好的單菌落作為觀察對象，做好標記。從144h開始，每隔24h量取該菌落的直徑Ctl及對應的透明圈直徑C1，共測8次，計算透明圈與菌落直徑比值為Ci/Q。
實驗結果如下表I透明圈與菌落直徑比值
權利要求
1.一種枝孢菌株，其特征在于，所述菌株為枝孢屬(Cladosporium sp. ) HRZ008,由中國典型培養物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號是CCTCC No :M2012363，保藏日期為 2012年9月19日。
2.一種微生物菌劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)菌種活化挑取枝孢菌株HRZ008至菌種保藏培養基，30°C平板劃線、挑取單菌落培養兩次后，挑取少量接種于活化培養基中，于30°C、180r/min搖床震蕩培養24h ；(2)液態發酵向裝有滅菌后的種子培養基中，按照10%的接種量接種枝孢菌株 HRZ008，于30°C下，通空氣培養48h，得到活菌體發酵液；(3)菌劑制備培養好的發酵液經0D_測定后，超濾濃縮，調節其吸光度至1.0，加入甘油保藏即可。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌種保藏培養基為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g,加水至1L,調節pH=7. O,在121°C下滅菌20min。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌種活化培養基為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、加水至1L,調節pH=7. O,在115°C下滅菌15min。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述種子培養基為80目以下的微晶纖維素1. 0g、CO (NH2) 28· Omg、NH4Cl 14. 3mg、ΚΗ2Ρ046· 6mg、MgSO4 · 7Η20 30. Omg、CoCl2 · 6Η20 20. Omg、NaHC0320. 5mg、CaCl212. 9mg、MnSO4 · H2O 2.1mg、FeSO4 · 7H20 10. 4mg、ZnCl25. 5mg, 調節ρΗ=7· 0,在115°C下滅菌15min。
6.權利要求2、任意一項方法制得的微生物菌劑。
7.權利要求1所述菌株HRZ008在降解廢水中纖維素的應用。
8.根據權利要求7所述應用，其特征在于，所述菌株能使廢水中的羧甲基纖維素、微晶纖維素和濾紙有效降解。
9.根據權利要求8所述應用，其特征在于，將權利要求2飛任意一項方法制得的微生物菌劑先用水稀釋，然后用于降解廢水中纖維素。
10.根據權利要求7或8或9所述的應用，其特征在于，所述菌株的降解的培養基為如下3種中的任意一種所述羧甲基纖維素-剛果紅固體培養基為1L:CMC 2.(^、剛果紅0.28、1(2即040.58、 (NH4) 2S042. 0g、MgSO4 · 7H20 O. 25g、瓊脂 20g，調節 pH=7. 0 ；所述微晶纖維素-剛果紅固體培養基為IL :200目以下的微晶纖維素1. 0g、剛果紅·0.2g、K2HPO4O. 5g、(NH4) 2S042. 0g、MgSO4 · 7H20 0. 25g、瓊脂 20g，調節 pH=7. 0 ；所述菌株降解的液體培養基為IL 200目以下的微晶纖維素1. Og或質量為50±0. 5mg 的濾紙條 10 條、K2HPO4O. 5g、(NH4) 2S042. 0g、MgSO4 · ·7Η200· 25g，調節 ρΗ=7· O。
全文摘要
本發明公開了一種枝孢菌株及其微生物菌劑以及制備方法和應用，屬于生物技術領域。所述菌株為枝孢屬(Cladosporium sp.)HRZ008，由中國典型培養物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號是CCTCC NoM2012363，保藏日期為2012年9月19日。該菌株對羧甲基纖維素、微晶纖維素和濾紙均有良好的降解效果，用于降解廢水中的纖維素，能提高廢水的處理效果，優化出水水質。
文檔編號C12R1/645GK103013836SQ20121051101
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者萬金泉, 黃蓉姿, 馬邕文, 王艷, 吳鳳環 申請人:華南理工大學