專利名稱：幾丁質酶chi-x及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種幾丁質酶CH1-X及其編碼基因與應用。
背景技術：
幾丁質酶(EC. 3. 2.1. 14)是一類能催化水解至少含有一個N-乙酰葡萄糖胺基團糖苷鍵的酶，幾丁質酶能水解幾丁質生成幾丁寡糖、幾丁二糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖等。根據其作用位點和酶解產物，可把幾丁質酶分為外切幾丁質酶(exochitinase)和內切幾丁質酶(endochitinase)。內切幾丁質酶從幾丁質鏈的任一部位切割，產生幾丁質寡聚糖，如Glc(NAG)2, Glc(NAG)3等；外切幾丁質酶一般又分為幾丁二糖酶(EC. 3. 2.1. 29)和N-乙酰基葡萄糖苷酶(EC. 3. 2.1. 30)，幾丁二糖酶作用于幾丁質長鏈的非還原端端部，水解幾丁質生成N-乙酰葡萄糖胺二聚體G1c(NAG)2。幾丁質酶根據其氨基酸序列特征可分成6類，1、
I1、IV型歸于糖基化水解酶的第19家族，主要存在于植物中；II1、V型歸于第18家族，廣泛存在于病毒、細菌、真菌、昆蟲、節肢動物、植物和哺乳動物中，其氨基酸序列與19家族缺乏同源性，而N-乙酰葡萄糖胺酶被歸于第20家族。目前發現，自然界中的很多微生物能夠合成幾丁質酶，從而降解幾丁質，產生N-乙酰胺基葡萄糖及幾丁寡糖等利用價值較高的衍生物，具有巨大的發展前景。科技的進步為研究利用幾丁質提供了越來越多的方法，對幾丁質的研究不斷加深，范圍不斷拓廣。作為效率高、控制性強且對環境友好的生物酶法處理幾丁質將是現代幾丁質產業的發展方向。幾丁質資源很豐富，其水解產物應用也十分廣泛，但因沒有有效的幾丁質處理手段而受到極大的限制，作為幾丁質工業發展方向的酶法，目前因為幾丁質酶活力較低還不能滿足工業化生產的需要。因此，發現具有高活力、符合現代生物工程要求的幾丁質酶是一項非常有意義的工作。
發明內容
本發明的目的是提供一種幾丁質酶CH1-X及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白CH1-X,來自朽1檬酸桿菌(Citrobacter sp.),具有幾丁質酶功能，為如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白質。為了使(a)或(b)中的蛋白CH1-X便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述的編碼基因。
3.根據權利要求2所述基因，其特征在于所述基因為如下I)或2)或3)的DNA分子 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有幾丁質酶活性的蛋白的DNA分子; 3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有幾丁質酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將所述基因插入載體pET_28a(+)的多克隆位點得到的。
6.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.權利要求1所述蛋白在降解幾丁質或制備幾丁質酶中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述幾丁質為膠體幾丁質。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述降解的pH值為2.O— 11.0，或3.0—10. O,或 3. 0—9. O,或 3. 0—8. O,或 3. 0—4. O,或 4. 0—8. O,或 4. 0—7. O,或 4. O—6.0，或 4. O—5. O ο
10.根據權利要求7—9中任一所述的應用，其特征在于所述降解的溫度為O — 80°C，或 20— 70°C，或 30— 70°C，或 40— 70°C，或 50— 70°C，或 50— 60°C，或 60— 70V。
全文摘要
本發明公開了一種幾丁質酶CHI-X及其編碼基因與應用。所述蛋白CHI-X是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白質。本發明所提供的蛋白CHI-X在作為幾丁質酶時具有如下優點可以采用較高的反應溫度；具有良好的熱穩定性；可以在酸性條件下作用；具有良好的pH穩定性。本發明對現代幾丁質產業發展具有重要意義。
文檔編號C12N15/56GK103013957SQ201210510998
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者周志剛, 許潔, 楊雅麟, 梁涼, 徐俐, 何夙旭, 于會民, 艾春香 申請人:中國農業科學院飼料研究所, 北京正坤博達生物飼料有限公司