專利名稱：分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法和提取專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離提取人的皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法和提取專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞按照發(fā)育過程分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一種來源于中胚層和外胚層的多潛能干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于多種器官組織中，目前已從心臟、骨髓、脂肪、肌肉等組織中成功獲得了間充質(zhì)干細(xì)胞。2001年，祖克(Zuk)從抽脂手術(shù)中取得脂肪組織懸液中提取出一種具有自我更新和多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，這類干細(xì)胞被命名為脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived mesenchymal StemCelIs, ADSCs)。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞和其他干細(xì)胞一樣具有自我更新的能力，同時并具有向多個胚層分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下能在體內(nèi)和體外分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肝細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞同時還具有以下特點(1)增殖能力強(qiáng)脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有較高的細(xì)胞增殖能力，在體外培養(yǎng)時，細(xì)胞活力較強(qiáng)。(2)免疫原性低脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于動物體內(nèi)含量較高的脂肪組織，用于移植時，自體來源的干細(xì)胞免疫原性較低。(3)致腫瘤風(fēng)險低脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有穩(wěn)定的端粒酶活性，在維持其增殖性的同時具有較低的致腫瘤性。近年來研究表明，ADSC細(xì)胞由于脂肪組織具有取材方便和組織內(nèi)干細(xì)胞含量較高等優(yōu)勢，同時在分化性能上，和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞基本相同，因此在進(jìn)行受損組織或器官的修復(fù)上具有廣闊的應(yīng)用前景。脂肪來源干細(xì)胞在提取時，由于機(jī)械設(shè)備的使用，使得干細(xì)胞在提取過程中容易受到損傷，同時脂肪組織的消化液也會損傷提取出的干細(xì)胞。原代培養(yǎng)方法是將干細(xì)胞從體內(nèi)環(huán)境移植到體外環(huán)境培養(yǎng)，其過程中由于外部環(huán)境和體內(nèi)環(huán)境不同，因此需要添加生長因子以及化學(xué)成份來模擬體內(nèi)生長環(huán)境，給予干細(xì)胞緩沖時間，提取的干細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞。因此細(xì)胞的提取方法以及使用的提取培養(yǎng)基成分對原代細(xì)胞的純度以及活力有很大影響，對隨后的傳代培養(yǎng)也有很大的影響，如干細(xì)胞的特性，如更新能力，分化能力等。因此需要一種專用的提取方法以及提取專用培養(yǎng)基。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題鑒于國內(nèi)脂肪來源主要是醫(yī)院外科手術(shù)后取得的皮下脂肪組織。這種皮下脂肪組織取得的量較多，且手術(shù)傷害較小。因此本發(fā)明提出了一種從人的皮下脂肪組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，同時發(fā)明了一種在提取和原代細(xì)胞培養(yǎng)時使用提取專用培養(yǎng)基。本發(fā)明涉及的提取方法能在較小損傷的情況下提取大量的脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。同時在提取過程中使用專用提取培養(yǎng)基。使用本發(fā)明提取和培養(yǎng)的人的皮下脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在原代培養(yǎng)時，細(xì)胞損傷和損失較少，提取的干細(xì)胞活力較高，同時干細(xì)胞的純度較高。經(jīng)過本提取方法和提取專用培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代干細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，使用普通培養(yǎng)基都可以長時間的保持干細(xì)胞的活性，以及干細(xì)胞增殖能力和多個胚層方向分化潛能。技術(shù)方案為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種分離提取人的皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟步驟I :無菌條件下通過外科手術(shù)取人皮下脂肪，剪碎成1-3_3后用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)混合后離心；步驟2 :用I型和II膠原酶混合物消化、離心；
步驟3 :用提取專用培養(yǎng)基重懸單個細(xì)胞后水浴，提取專用培養(yǎng)基中含有特定化學(xué)成分和生長因子；步驟4 :再次用提取專用培養(yǎng)基重懸、過濾后移入培養(yǎng)瓶中；步驟5 :連續(xù)培養(yǎng)5-7天后，干細(xì)胞成克隆生長后，用普通培養(yǎng)基可傳代持續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)選的，步驟I中，用4°C的冰磷酸鹽緩沖液混合切碎的脂肪組織后低速離心。優(yōu)選的，步驟2中，使用混合的I型和II型膠原酶消化，I型和II型膠原酶質(zhì)量比為I :1，混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分?jǐn)?shù)比為I :1000，每克脂肪組織使用Iml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，振蕩水浴消化時間為O. 5-2小時，消化時水浴溫度為37°C。本發(fā)明還提供了一種用于分離提取人的皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取專用培養(yǎng)基，提取專用培養(yǎng)基包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清、重組成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素、乙酰半胱氨酸、甲狀腺原氨酸。優(yōu)選的，提取專用培養(yǎng)基包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基體積百分比位89%、添加胎牛血清的體積百分比為10%、抗生素體積百分比為1%、重組成纖維生長因子濃度為5ng/ml、表皮生長因子濃度為5ng/ml、胰島素濃度為10ug/ml、乙酰半胱氨酸濃度為2mM、甲狀腺原氨酸濃度為10ng/ml。優(yōu)選的，抗生素包括青霉素和鏈霉素。有益效果本發(fā)明提出的提取方法和提取專用培養(yǎng)基能在較小損傷干細(xì)胞的情況下，快速獲得大量人的皮下脂肪來源帶間充質(zhì)干細(xì)胞。所提取的原代脂肪干細(xì)胞在傳代前的活力較強(qiáng)，干細(xì)胞純度高。經(jīng)過傳代以及普通培養(yǎng)基培養(yǎng)后，干細(xì)胞依然具有較高的增殖和分化能力。
圖Ia為原代細(xì)胞接種后12h的光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)圖；圖Ib為原代細(xì)胞接種后7天后的光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)；圖2a為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶29流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果；圖2b為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶44流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果；圖2c為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶73流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明本發(fā)明提供的一種分離提取人的皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟步驟I :無菌條件下通過外科手術(shù)取人皮下脂肪，剪碎成1-3_3后用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)混合后離心；步驟2 :用I型和II膠原酶混合物消化、離心；步驟3 :用提取專用培養(yǎng)基重懸單個細(xì)胞后水浴，提取專用培養(yǎng)基中含有特定化學(xué)成分和生長因子；步驟4 :再次用提取專用培養(yǎng)基重懸、過濾后移入培養(yǎng)瓶中；步驟5 :連續(xù)培養(yǎng)5-7天后，干細(xì)胞成克隆生長后，用普通培養(yǎng)基可傳代持續(xù)培養(yǎng);
步驟I中，用4°C的冰磷酸鹽緩沖液混合切碎的脂肪組織后低速離心；步驟2中，使用混合的I型和II型膠原酶消化,I型和II型膠原酶質(zhì)量比為I :1，混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分?jǐn)?shù)比為I : 1000，每克脂肪組織使用Iml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，振蕩水浴消化時間為O. 5-2小時，消化時水浴溫度為37°C ；步驟3中，消化后的單細(xì)胞用提取專用培養(yǎng)基重懸，放入37°C水浴中靜置15分鐘；本發(fā)明提供的一種用于分離提取人的皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，提取專用培養(yǎng)基包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清、重組成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素、乙酰半胱氨酸、甲狀腺原氨酸。具體成分配比為低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基體積百分比位89%、添加胎牛血清的體積百分比為10%、抗生素(青霉素和鏈霉素)體積百分比為1%、重組成纖維生長因子濃度為5ng/ml、表皮生長因子濃度為5ng/ml、胰島素濃度為10ug/ml、乙酰半胱氨酸濃度為2mM、甲狀腺原氨酸濃度為10ng/ml。實施例I :人的皮下脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取培養(yǎng)步驟人的皮下脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取專用培養(yǎng)基配制在445ml低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基中加入50ml胎牛血清、抗生素(青霉素和鏈霉素)5ml、重組成纖維生長因子2. 5ug、表皮生長因子2. 5ug、胰島素5mg、乙酰半胱氨酸(400nM的儲存液)2. 5ml、甲狀腺原氨酸5ug，O. 22 μ m濾器過濾除菌，4°C儲存?zhèn)溆?。人的皮下脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞提取與培養(yǎng)步驟I、取人外科手術(shù)取出的皮下脂肪組織，質(zhì)量大概為25g，放入預(yù)冷的PBS中，24h內(nèi)使用。然后用PBS清洗組織數(shù)次洗除殘留血液，剪碎至l_3mm3的小塊；2、將切碎的脂肪組織轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中，加入40ml的PBS重懸后，800rmp離心5分鐘去除部分大塊脂肪組織；3、加入25ml的I型和II膠原酶以及PBS混合物，密封后放入37°C振蕩水浴箱內(nèi)消化lh，消化過程中不斷振蕩組織塊以促進(jìn)消化；4、消化后SOOrmp離心5分鐘去除上部未被消化的脂肪組織(如果組織塊較大，可以收集后繼續(xù)消化提取)，加入40ml的PBS重懸后，800rmp離心5分鐘；5、用40ml的提取專用培養(yǎng)基重懸，37°C水浴靜置15分鐘，6>800rmp離心5分鐘去上清,再用提取專用培養(yǎng)基重懸,經(jīng)孔徑為IOOum的無菌尼龍網(wǎng)過濾，過濾后單細(xì)胞細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，按照濃度為IO5個/ml將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱溫度為37°C、5%C02、濕度為95%條件下培養(yǎng)；7、12h后，更換一半體積的提取專用培養(yǎng)基，I天后全部更換培養(yǎng)基，第4天全部更換培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞生長情況，一般7天后細(xì)胞成克隆生長；
8、用O. 25%的胰酶消化后，按照I :3的比例正常傳代培養(yǎng)，正常培養(yǎng)用常用培養(yǎng)基(DMEM F12=1 1基礎(chǔ)培養(yǎng)基加10%胎牛血清)。圖I :人皮下脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞12小時(圖Ia)后，細(xì)胞有貼壁，培養(yǎng)7天后干細(xì)胞成克隆生長(圖lb)。實施例2 :人原代皮下脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞純度鑒定。I、取原代細(xì)胞用O. 25%的胰酶消化2 分鐘后移入2ml離心管，800rmp離心5分鐘
去除上清；2、每管加入2ml PBS重懸，800rmp離心5分鐘去除上清；3、加入Iml的PBS重懸細(xì)胞，計數(shù)，再加入PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為I X IO6個/ml ；4、將細(xì)胞懸液分成多管，每管500 μ 1，選其中一管作為流式對照組；5、按組分別加入帶有FITC標(biāo)記的⑶29、⑶44、⑶73流式抗體，4°C避光孵育30分鐘，800rmp離心5分鐘去除上清；6、加入Iml PBS重懸，800rmp離心5分鐘去除上清；7、加入500 μ I PBS重懸細(xì)胞；8、流式細(xì)胞儀檢測樣品。圖2 :經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，使用本發(fā)明方法和專用提取培養(yǎng)基所提取的原代脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的幾個標(biāo)志物⑶29、⑶44、⑶73陽性表達(dá)率很高。表明提取方法和提取培養(yǎng)基可以從皮下脂肪中分離出純度較高的干細(xì)胞。以上實例說明本專利提供的人皮下脂肪來源干細(xì)胞的提取方法以及提取專用培養(yǎng)基可以從脂肪組織中快速提取間充質(zhì)干細(xì)胞，且提取的干細(xì)胞的純度，活力較高。這一發(fā)明能有效的豐富脂肪來源干細(xì)胞的種類，提高干細(xì)胞原代提取的效率，為干細(xì)胞的近一步的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。使用本發(fā)明所述提取方法以及提取專業(yè)培養(yǎng)基可以從人皮下脂肪中提取大量脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞純度較高，且干細(xì)胞活性較強(qiáng)。該干細(xì)胞再經(jīng)過普通培養(yǎng)基多次傳代培養(yǎng)后干細(xì)胞活力和分化能力依然較強(qiáng)。本發(fā)明在人的皮下脂肪中經(jīng)過特定提取步驟和提取專用培養(yǎng)基提取了皮下脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，在提取的方法可以減少干細(xì)胞損傷，同時使用提取專用培養(yǎng)基(添加特定的化學(xué)成分和生長因子)可以解決干細(xì)胞在體外培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)純度低、傳代后干細(xì)胞容易衰老分化、不能長時間連續(xù)培養(yǎng)等問題。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以上述實施方式為限，但凡本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所揭示內(nèi)容所作的等效修飾或變化，皆應(yīng)納入權(quán)利要求書中記載的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 步驟I :無菌條件下通過外科手術(shù)取人皮下脂肪，剪碎成l_3mm3后用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)混合后離心； 步驟2 :用I型和II膠原酶混合物消化、離心； 步驟3 :用提取專用培養(yǎng)基重懸單個細(xì)胞后水浴，提取專用培養(yǎng)基中含有特定化學(xué)成分和生長因子； 步驟4 :再次用提取專用培養(yǎng)基重懸、過濾后移入培養(yǎng)瓶中； 步驟5 :連續(xù)培養(yǎng)5-7天后，干細(xì)胞成克隆生長后，用普通培養(yǎng)基可傳代持續(xù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法，其特征在于步驟I 中，用4°C的冰磷酸鹽緩沖液混合切碎的脂肪組織后低速離心。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法，其特征在于步驟2中，使用混合的I型和II型膠原酶消化，I型和II型膠原酶質(zhì)量比為I :1，混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分?jǐn)?shù)比為I :1000，每克脂肪組織使用Iml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，振蕩水浴消化時間為0. 5-2小時，消化時水浴溫度為37°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法，其特征在于步驟3中，消化后的單細(xì)胞用提取專用培養(yǎng)基重懸，放入37°C水浴下靜置15分鐘。
5.一種用于分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取專用培養(yǎng)基，其特征在于提取專用培養(yǎng)基包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清、重組成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素、乙酰半胱氨酸、甲狀腺原氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取專用培養(yǎng)基，其特征在于提取專用培養(yǎng)基包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基體積百分比位89%、添加胎牛血清的體積百分比為10%、抗生素體積百分比為1%、重組成纖維生長因子濃度為5ng/ml、表皮生長因子濃度為5ng/ml、胰島素濃度為10ug/ml、乙酰半胱氨酸濃度為2mM、甲狀腺原氨酸濃度為10ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離提取人皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法和提取專用培養(yǎng)基。人的皮下脂肪組織切碎后4℃下離心去除大塊脂肪組織，加入混合的I型和II型膠原酶水浴消化。用提取專用培養(yǎng)基重懸后，37℃水浴。過濾收集細(xì)胞后加入提取專用培養(yǎng)基進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)5-7天。原代培養(yǎng)后的細(xì)胞可以使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，且可以進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。提取專用培養(yǎng)基包含低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)基，添加一定濃度的胎牛血清、重組成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素、乙酰半胱氨酸、甲狀腺原氨酸。本發(fā)明可以從人皮下脂肪中提取大量脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞純度較高，且干細(xì)胞活性較強(qiáng)。
文檔編號C12N5/0775GK102965337SQ201210510328
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者孫博, 胡飛虎, 肖忠黨 申請人:東南大學(xué)