專利名稱：一種提高抗肝片吸蟲病dna疫苗免疫保護率的疫苗組合及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用提高Th2免疫反應(yīng)從而提高編碼肝片吸蟲Cat LlCFhCat LI)DNA疫苗保護率的方法。具體涉及在構(gòu)建編碼肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI) DNA質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，利用宿主機體Th2免疫反應(yīng)對蠕蟲感染具有很好的殺滅或抑制作用，選用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟、增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為DNA疫苗的分子佐劑，提高FhCat LI DNA疫苗在免疫BALB/c小鼠后的免疫原性和免疫保護率，為抗肝片吸蟲DNA疫苗的研發(fā)提供一種新思路。
背景技術(shù)：
肝片吸蟲是一種寄生性蠕蟲，能引起牛、羊等反芻動物及人的嚴(yán)重吸蟲病[I]。在世界范圍內(nèi)，肝片吸蟲病直接影響著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康，據(jù)估計每年可造成約20億美元的經(jīng)濟損失[2]，是一種不可忽視的重要人畜共患寄生蟲病。對此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化學(xué)藥物，但這些藥物只對早期的未成熟蟲體或成蟲具有良好效果，對感染后期的治療不佳。最近發(fā)現(xiàn)，家畜已對三氯苯咪唑等化學(xué)藥物產(chǎn)生耐藥性[3-5]。同時，人們對畜產(chǎn)品中化學(xué)藥物殘留量的要求也越來越嚴(yán)格，這給利用化學(xué)藥物控制吸蟲病帶來極大困難。因此，防治吸蟲病急切需要一種能替代化學(xué)藥物的治療方法，這就給疫苗發(fā)展帶來了良好契機[6]。疫苗研究的關(guān)鍵是對病原引起的機體免疫規(guī)律的了解。肝片吸蟲可引起Thl/Th2混合免疫反應(yīng)，但根據(jù)此原理研究的疫苗效果卻不是很理想[7，8]。作為蠕蟲的一種，肝片吸蟲應(yīng)該具有其他蠕蟲如絲蟲或其他線蟲的免疫特性，即可引起宿主以Th2為主的免疫反應(yīng)[9-12]。因此，可假設(shè)能刺激機體產(chǎn)生Th2免疫反應(yīng)的疫苗可提高抵抗肝片吸蟲感染的能力。以此假設(shè)為前提，可通過將機體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)趨向Th2反應(yīng)，從而提高抗感染能力。因此，可考慮選用能調(diào)節(jié)機 體免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子或趨化因子。研究表明，IL4就具有此種功能，這與其介導(dǎo)幼稚T細(xì)胞向⑶4+T細(xì)胞分化產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子如IL5，IL13，IL9和IL4密切相關(guān)[13，14]。另外，理想的疫苗應(yīng)能夠刺激機體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，并能誘導(dǎo)長期持久的免疫記憶，以保護機體免受疾病侵襲。樹突狀細(xì)胞(DC)，是已知體內(nèi)最強的專職抗原提呈細(xì)胞，其最大的特點是能夠刺激初始T細(xì)胞增殖和啟動機體免疫反應(yīng)。因此，選用能能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟，增加DC數(shù)量和頻率的細(xì)胞因子或趨化因子作為疫苗佐劑，可大大提高DC呈遞抗原的能力，從而提高疫苗的免疫保護率。Flt3L即是這樣的趨化因子，它能與DC表面分子作用，提高抗原呈遞能力[15，16]。除此之外，優(yōu)秀的疫苗候選因子也是疫苗研究的關(guān)鍵。事實上，到目前為止，有很多肝片吸蟲的疫苗候選分子如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，亮氨酸氨肽酶(LAP)，脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)及組織蛋白酶L (Cat L)都被用于開發(fā)諸如重組蛋白疫苗及DNA疫苗，雖然這些疫苗能在實驗動物和大動物上產(chǎn)生一定的免疫保護[17，18]，但至今仍沒有一種商品化疫苗能投入到臨床生產(chǎn)，這在很大程度上受制于疫苗的保護率低下的現(xiàn)狀，而這種現(xiàn)狀與如何提高抗原的呈遞有著密切的關(guān)系[19-22]。組織蛋白酶L是一種半胱氨酸蛋白酶，通常情況下這種酶以非活性狀態(tài)存在于分泌囊泡的腸上皮細(xì)胞中[23，24]，當(dāng)前體酶活化并被釋放后，寄生蟲即可利用活化的組織蛋白酶行使多種重要的功能，如能在肝臟中將蛋白分解為多肽從而利于營養(yǎng)的吸收和降解基質(zhì)蛋白從而有利于寄生蟲從腸道遷移到肝臟[25，26]。研究還表明，組織蛋白酶L還在免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白從而破壞宿主的免疫攻擊，并能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性、抑制Thl免疫反應(yīng)[27，29]。目前，對肝片吸蟲組織蛋白酶L的疫苗開發(fā)主要集中在重組蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重組肝片吸蟲組織蛋白酶L具有與天然蛋白相似的功能[30]，在荷斯坦牛身上免疫后獲得了 48.2%的減蟲率和顯著升高的總IgG [31]。DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。在DNA疫苗的研究中，大鼠罐胃免疫肝片吸蟲組織蛋白酶L DNA疫苗并用囊蝴感染后，雖能獲得70%的免疫保護[32]，但免疫途徑操作。因此，如何提高肌肉注射DNA疫苗的保護率就成了目前DNA疫苗開發(fā)的熱點。
發(fā)明內(nèi)容
針對目前抗肝片吸 蟲疫苗保護率低下的現(xiàn)狀，本發(fā)明正是著眼于提高肝片吸蟲組織蛋白酶LI DNA疫苗的保護率，從提高其抗原在樹突狀細(xì)胞中的呈遞作用入手，利用利用宿主機體Th2免疫反應(yīng)對蠕蟲感染具有很好的殺滅或抑制作用的普遍現(xiàn)象，選用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟、增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為DNA疫苗的分子佐劑，提高FhCat LI DNA疫苗在免疫BALB/c小鼠后的免疫原性和免疫保護率。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:本發(fā)明設(shè)計了一種提高編碼肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗保護率的疫苗組合，所述疫苗組合為PVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L，其是采用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟、增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為Cat LI(FhCat LI) DNA疫苗的分子佐劑，提高抗肝片吸蟲病DNA疫苗的保護率。本發(fā)明進一步提出該疫苗組合的制備方法，包括以下步驟:I)編碼IL4、Flt3L的真核質(zhì)粒的構(gòu)建:小鼠IL4序列采用特異性克隆引物(P3，P4)，P3-5’ CACCATG GGT CTC AAC CCC CA 3’，P4- 5’ CTA CGA GTA ATC CAT TTG CA3’；小鼠 Flt3L 序列采用特異性克隆引物(P5，P6), P5-5’ CACCATG ACA GTG CTG GCGCCA GC 3’，P6-5’ CTA GGG ATG GGA GGG GAG GG 3’ ；在克隆引物 P3，P5 分別引入接頭序列pcDNA3.1的CACC ;獲得的小鼠IL4/FU3L基因回收后連接入pVAXl質(zhì)粒，構(gòu)建得到PVAX1-1L4 和 pVAXl-Flt3L ；2)編碼候選基因Cat LI的真核質(zhì)粒的構(gòu)建:其中，特異性克隆引物(P1，P2)，P1-5’ CACCGGATCCGTA CTG ACT ATT GGA TTG TG 3’，P2-5’ CC GAATTCTCA CGG AAA TCG TGCCAC CA 3’，在克隆引物Pl，P2的上下游分別引入BamH I和EcoR I酶切位點；擴增得到的Cat LI基因回收后連接入pMD18-T載體，得到pMD-Cat LI，再將Cat LI基因從pMD-CatLI亞克隆入pVAXl質(zhì)粒獲取pVAXl-Cat LI質(zhì)粒；
3)利用大腸桿菌工程菌(Escherichia coli)和真核細(xì)胞Cos7表達(dá)Cat LI蛋白；4)Cat LI多克隆抗體的制備；5)純化和鑒定Cat LI蛋白；6)獲得疫苗組合 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L。本發(fā)明的特點在于:1、采用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟、增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為DNA疫苗的分子佐劑來提高抗肝片吸蟲病DNA疫苗的保護率。2、采用的骨架質(zhì)粒pVAXl為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1的升級構(gòu)件，具有更多的技術(shù)優(yōu)勢。
3、篩選出pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L質(zhì)粒組合肌肉免疫小鼠后獲得的免疫保護率(平均74.23% )顯著高于對照組，且獲得了較pcDNA-Cat LI疫苗(29.1%)高的免疫保護率。4、篩選出30ii g/只劑量pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L質(zhì)粒組合肌肉免疫小鼠后獲得的免疫保護率與40 u g/只，50 u g/只，100 u g/只和150 u g/只試驗組無顯著差異，減少
了疫苗有效使用量，經(jīng)濟實用。本發(fā)明技術(shù)具有思路新穎、針對性強、效率高、易于操作、經(jīng)濟實用等特點。該技術(shù)為肝片吸蟲DNA疫苗的開發(fā)提供了一種新的方法，適宜在其他肝片吸蟲候選疫苗分子上引申應(yīng)用。
圖1 PCR檢測所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。A為Cat LlPCR電泳圖，目標(biāo)長度為720bp。B為IL4 PCR電泳圖，目標(biāo)長度為423bp。C為Flt3L PCR電泳圖，目標(biāo)長度為699bp。圖2 A, pET32a-Cat LI在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果。M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。1，pET32a- Cat LI陽性質(zhì)粒在BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)，所用條件是37°C 1.0mM IPTG誘導(dǎo)4h。2，pET32a空載體。B，Cat LI蛋白純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果。M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。1-4為純化后蛋白條帶。圖3 A, pVAXl-Cat LI 轉(zhuǎn)染 Cos7 細(xì)胞后 Western blotting 結(jié)果，1-3 為目標(biāo)蛋白，大小為26.lkD，4為空白對照pVAXl質(zhì)粒。B，pVAXl_IL4轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞后Westernblotting結(jié)果，1-2為目標(biāo)蛋白，大小為22kD，3為空白對照pVAXl質(zhì)粒。C，pVAXl_Flt3L轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞后Western blotting結(jié)果，1-3為目標(biāo)蛋白，大小為26kD，4為空白對照pVAXl質(zhì)粒。圖4小鼠免疫后血清中抗體水平。與pVAXl-Cat LI及pVAXl相比，pVAXl-CatLl+pIL4+pFlt3L能刺激小鼠產(chǎn)生顯著高水平的IgGlJS IgG2a在組間無差異。*代表與pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 相比有顯著差異(p〈0.05)圖5:外周血細(xì)胞因子IL4、IL5和IFNy的含量。與pVAXl-Cat LI及pVAXl相比，pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能刺激小鼠產(chǎn)生顯著高水平的IL4和IL5，但IFNy在組間無差異。*，**分別代表與pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L組相比差異顯著和極顯著(p〈0.05，p〈0.01)
圖6:疫苗免疫后受囊蝴感染攻擊后成活的蟲體數(shù)量。與pVAXl-Cat LLpVAXl-CatLI+p IL4 及 p VAX 1-Cat Ll+pFlt3L 相比，pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 使小鼠中蟲體成活數(shù)量較pVAXl組顯著降低。**代表與pVAXl組相比差異極顯著(p〈0.01)。因此，根據(jù)以上數(shù)據(jù)可判定pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能刺激機體產(chǎn)生較好體液和細(xì)胞免疫，并能獲得顯著降低的蟲荷。所以，可選擇此組合進行第二步篩選計劃。圖7:小鼠在不同劑量質(zhì)粒免疫后血清中抗體水平。30 ii g/只pVAXl-CatLl+pIL4+pFlt3L肌肉注射能刺激小鼠產(chǎn)生顯著高水平的IgGl，與40 y g/只，50y g/只，IOOiig/只和150 yg/只的劑量相比無顯著差異。IgG2a在組間無差異。**代表與pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 相比有顯著差異(p〈0.01)。圖8:不同劑量質(zhì)粒免疫小鼠后外周血細(xì)胞因子IL4、IL5和IFN Y的含量。30yg/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能刺激小鼠產(chǎn)生顯著高水平的IL4和IL5，與40 y g/只，50 u g/只，100 u g/只和150 u g/只的劑量相比無顯著差異。IFN y在組間無差異。*代表與 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 組相比差異顯著(p〈0.05)。圖9:不同劑量疫苗免疫后受囊蝴感染攻擊后成活的蟲體數(shù)量。30i!g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能使小鼠中蟲體成活數(shù)量較pVAXl組顯著降低，與40 u g/只，50 u g/只，100 u g/只和150 ug/只的劑量相比無顯著差異。*，**分別代表與pVAXl組相比差異顯著和極顯著(P〈0.05, p〈0.01)。因此，依據(jù)優(yōu)化原則，雖然40 U g/只的免疫劑量也能獲得較好免疫保護率，但30 yg/只的疫苗劑量也能獲得很好免疫保護率，同時更能節(jié)省資金。接下來是要比較30 ii g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L的疫苗劑量與pcDNA- Cat LI的免疫保護率高低。圖10:小鼠在相同劑量 pcDNA- Cat LI 和 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 質(zhì)粒免疫后血清中抗體水平。30ii g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L肌肉注射能刺激小鼠產(chǎn)生比pcDNA- Cat LI顯著高水平的IgGl。IgG2a在組間無差異。*代表與pVAXl-CatLl+pIL4+pFlt3L 相比有 顯著差異(p〈0.05)。圖11:小鼠在相同劑量 pcDNA- Cat LI 和 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 質(zhì)粒免疫后外周血細(xì)胞因子IL4、IL5和IFNy的含量。30 y g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能刺激小鼠產(chǎn)生比pcDNA- Cat LI顯著高水平的IL4和IL5。IFNy在組間無差異。*，#分別代表與pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L組相比差異顯著和極顯著(p〈0.05，p〈0.01)。圖12:小鼠在相同劑量 pcDNA- Cat LI 和 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 質(zhì)粒免疫并受囊蝴感染攻擊后成活的蟲體數(shù)量。30 u g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能使小鼠中蟲體成活數(shù)量較PVAXl組顯著降低，但pcDNA- Cat LI較pVAXl組無顯著差異。**代表與PVAXI組相比差異極顯著(p〈0.01)。至此，實驗從疫苗不同組合，免疫劑量及與通常的疫苗組合進行比較篩選后得出30 u g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能刺激機體產(chǎn)生良好的體液和細(xì)胞免疫，并能獲得較對照組顯著高的免疫保護率。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明提出的疫苗組合pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L的具體制備及檢測方法如下
1.運用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增目的基因并構(gòu)建真核質(zhì)粒根據(jù)GenBank收錄的肝片吸蟲Cathepsin LI (登錄號AY573569.1)序列(序列ORF總長720bp，蛋白大小26.1KDa)，應(yīng)用Oligo 5.0設(shè)計特異性克隆引物(Pl，P2)。Pl-5’ CACCGGATCCGTA CTG ACT ATT GGA TTG TG 3’，P2-5’ CC GAATTCTCA CGG AAA TCG TGCCAC CA 3’，在克隆引物Pl，P2的上下游分別引入BamH I和EcoR I酶切位點(劃線部分)。根據(jù)小鼠IL4序列(登錄號M25892.1，ORF總長423bp，蛋白大小22kD)，應(yīng)用Oligo5.0 設(shè)計特異性克隆引物(P3, P4), P3-5’ CACCATG GGT CTC AAC CCC CA 3，，P4- 5’ CTACGA GTA ATC CAT TTG CA 3’ ;根據(jù)小鼠 Flt3L 序列(登錄號 EU274583.1，ORF 總長 699bp，蛋白大小26kD)，應(yīng)用Oligo 5.0設(shè)計特異性克隆引物(P5，P6), P5-5’ CACCATG ACA GTGCTG GCG CCA GC 3’，P6-5’ CTA GGG ATG GGA GGG GAG GG 3’。在克隆引物 P3，P5 分別引入接頭序列PCDNA3.1的CACC(劃線部分)。肝片吸蟲Cat LI及小鼠IL4/FU3L的總RNA提取采用Trizol試劑盒進行，反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增。反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，95°C40s，54°C- 56°C 4 5_60s，72°C 60s，30 個循環(huán)。最后 72°C延伸 lOmin。將擴增得到的 CatLI基因回收后連接入pMD18-T載體，得到pMD-Cat LI (SEQ ID N0.1)，再將Cat LI基因從pMD-Cat LI亞克隆入pVAXl質(zhì)粒以獲取pVAXl-Cat LI質(zhì)粒。獲得的小鼠IL4/FU3L基因回收后連接入pVAXl質(zhì)粒，進行pVAXl-1L4和pVAXl-Flt3L的構(gòu)建。將獲得pVAXl-Cat LI，pcDNA-1L4和pcDNA-Flt3L分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中，培養(yǎng)后分別提取質(zhì)粒進行初步1.0%瓊脂糖凝膠電泳，PCR鑒定后測序確定序列的正確性。2.利用大腸桿菌工程菌(Escherichia coli)表達(dá)和純化目的蛋白應(yīng)用Oligo 5.0 設(shè)計特異性表達(dá)引物Pel, Pe2，Pel_5’ GGGAATTCCATATG GTA CTGACT ATT GGA TTG TG 3’，Pe2~5'-CGGCTCGAG TCA CGG AAA TCG TGC CAC CA 3’，并在其上下游分別引入Nde I和Xho I酶切位點(劃線部分)。以陽性質(zhì)粒pMD-Cat LI為模板，用表達(dá)引物Pel, Pe2進行擴增，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，95°C 45s, 56 °C 40s, 72 °C60s，30個循環(huán)。最后72°C延伸lOmin。將擴增得到的帶酶切位點的Cat LI基因回收后進行Nde I和Xho I酶切，所得片斷與同樣經(jīng)Nde I和Xho I酶切的pET32a載體連接過夜(4°C),構(gòu)建pET32a- Cat LI表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化陽性質(zhì)粒入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行測序鑒定。選取經(jīng)PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進行體外IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌在37°C生長至0D600nm的濃度為0.6時加入ImM IPTG誘導(dǎo)4小時，將所得細(xì)菌6000g離心30min后獲取沉淀并稱重。然后按lg/5ml His-Tag結(jié)合緩沖液的比例加入緩沖液后作用20min，然后用超聲波反復(fù)作用30次(條件為24KHz，30sec開，30sec關(guān))。將處理后產(chǎn)物于6000g離心30min，取上清，并利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒進行純化，然后用PBS緩沖液透析24小時后備用。蛋白濃度測定采用Coomasie proteinassay測定。3.Cat LI多克隆抗體的制備將5只6-7周齡雌性BALB/c小鼠分別后腿肌肉注射40 U g/只的純化后的Cat LI蛋白，總共進行3次免疫，每次間隔I周，最后I次免疫后I周采血分離血清備用?？贵w的濃度測定米用Coomasie protein assay測定。4.Western blotting 鑒定目的蛋白將方法2中利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒純化后的蛋白進行SDS_PAGE(30V，Ih)電泳后轉(zhuǎn)至尼龍膜上進行Western blotting鑒定。將膜用15ml I XTBS清洗2次后加入5%脫脂奶粉TBS液封閉未結(jié)合蛋白位點。經(jīng)過2次IXTTBS再清洗后，將尼龍膜撫育在多克隆抗體中l(wèi)h，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，再經(jīng)2次IXTTBS清洗后加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，經(jīng)2次IXTTBS清洗后加入發(fā)光底物Chemi Glow，然后進行成像處理以鑒定蛋白的表達(dá)情況。5.質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染及鑒定經(jīng)過PCR 鑒定為陽性的重組子 pVAXl- Cat Ll，pVAXl-1L4，pVAXl_Flt3L 及 pVAXl空質(zhì)粒，分別用質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至70-85%單層Cos7細(xì)胞，即準(zhǔn)備兩個Eppendorf管,在第一管中加入1.25 μ g質(zhì)粒和500 μ I Opt1-MEM I (invitrogrn)。在第二管中加入2μ IIipofectamine和500 μ I Opt1-MEM I。5min后將兩管混合并再作用20min后，將此1000 μ I混合液與3ml70-85%單層Cos7細(xì)胞(含有10%FCS的RMPI1640)混合并孵育5min。將細(xì)胞清洗2次后于IIOOg離心lmin，然后再與3mllO%FCS的RMPI1640 37°C孵育48h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，12，OOOg離心5min后分別收集上清和細(xì)胞沉淀。上清液經(jīng)離心沉淀后，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，IL4抗體(1:500)或Flt3L抗體(1:500)，羊抗鼠IgG (1:5000)和發(fā)光底物Chemi Glow進行Western Blotting鑒定質(zhì)粒的表達(dá)情況。6.DNA質(zhì)粒的大量制備將各陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌后接種500ml含有50 μ g/ml氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)物于4°C 6000g離心30min后收集沉淀，并按照QIAGEN-tip 500試劑盒說明進行質(zhì)粒的大量提取。獲得的質(zhì)粒用UV260nm測定其濃度后儲存于4°C備用。7.肝片吸蟲囊蝴的獲取從自然感染肝片吸蟲的牛糞便中收集蟲卵并置于平皿中于室溫孵育18天，然后將蟲卵暴露在光線下刺激2h以獲取 毛蝴。將2只毛蝴感染I只截口土蝸，然后正常飼喂截口土蝸68天。此后即可收集囊蝴。將收集到的囊蝴置于透明玻璃紙，于4°C儲存?zhèn)溆谩?.設(shè)計和篩選疫苗免疫組合試驗設(shè)計總體上以pVAXl-Cat LI為主要組分，將pVAXl_IL4和pVAXl_Flt3L單獨加入或混合于pVAXl-Cat LI進行試驗，同時篩選各成分的最佳組合和免疫劑量。第一步:篩選最佳成分組合，即將PVAXl-Cat LI，pVAXl-Cat LI+ pVAXl_IL4 (縮寫為pIL4)，pVAXl-Cat Ll+pVAXl-Flt3L(縮寫為 pFlt3L, pVAXl-Cat LI+ pIL4+pFlt3L。第二步在篩選出最佳組分基礎(chǔ)上篩選最佳免疫劑量，可參照文獻做梯度試驗，本試驗以30 μ g/只，40 μ g/只，50 μ g/只，100 μ g/只和150 μ g/只進行篩選。第三步是將篩選到的最佳組合和劑量與pcDNA- Cat LI質(zhì)粒(本實驗室保存)進行同等條件比較優(yōu)劣。因此，第一步中，將60只6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成6組，每組10只，分別在腿部肌肉注PBS (50 μ I/只)空白對照，各40 μ g/只pVAXl空質(zhì)粒，pVAXl-Cat LI，pVAXl-Cat Ll+pIL4，pVAXl-Cat Ll+pFlt3L和 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L，總共進行 2 次免疫，每次間隔7天。第2次免疫后14天將其中30只小鼠采血I次進行抗體水平測定，同時將其中的30只(每組5只)用作囊蝴感染，每只小鼠經(jīng)口感染30個囊蝴，在感染后35天即可處死小鼠，根據(jù)最后獲得的肝片吸蟲數(shù)量來評估疫苗保護率。第二步在篩選出最佳組分基礎(chǔ)上篩選最佳免疫劑量，可參照文獻做梯度試驗，本試驗以30 μ g/只，40 μ g/只，50 μ g/只，IOOyg/只和150 μ g/只注射小鼠，然后用囊蝴感染，每只小鼠經(jīng)口感染30個囊蝴，在感染后35天即可處死小鼠，根據(jù)最后獲得的肝片吸蟲數(shù)量來評估疫苗保護率。第三步是將篩選到的最佳組合和劑量與pcDNA- Cat LI質(zhì)粒(本實驗室保存)進行同等條件比較優(yōu)劣。即同時用相同劑量免疫后用用囊蝴感染，每只小鼠經(jīng)口感染30個囊蝴，在感染后35天即可處死小鼠，根據(jù)最后獲得的肝片吸蟲數(shù)量來評估疫苗保護率。9.動物體液免疫評估采用間接ELISA對肝片吸蟲特異性IgGl和IgG2a進行測定，即應(yīng)用本試驗pET32a表達(dá)載體表達(dá)的CatLl蛋白(5mg/ml，50ia/孔)包被96孔ELISA平板，于4°C過夜。然后用200 u I 4%BSA PBS/孔孵育，在進行2次TBST洗滌后加入50 U I/孔的倍比系列稀釋的血清(起始濃度1:100)，于4°C孵育過夜。將平板洗滌后加入1:6000稀釋的IgGl或1:4000稀釋的IgG2a，并于室溫孵育2h，然后加入50 U I/孔的50% TMB-50%H202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時加入50 u I/孔IMmH2SO4終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值?？贵w效價的判定標(biāo)準(zhǔn)為:取大于標(biāo)準(zhǔn)差3倍的0.D值所對應(yīng)的最大稀釋度為抗體效價。10.動物細(xì)胞 免疫評估采用夾心ELISA對肝片吸蟲感染引起的外周血中細(xì)胞因子水平進行測定，所用試劑均為商品試劑盒。分別于96孔板加入50 iil/孔的捕獲抗體(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFN y , 1:250)進行抗體包被，并于4°C過夜。在用200 u I 4%BSA PBS/孔孵育2h后分別加A 50 u I/孔倍比倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體(起始濃度IL4，8ng/ml ；IL5,10 ng/ml ；IFNy ,50 ng/ml)及50iil/孔的血清樣品，并于4°C過夜。洗滌3次后加入生物素標(biāo)記的抗體(終濃度IL4, IL5，IFN y I u g/ml),于室溫孵育Ih后加入AMDEX鏈霉親和素孵育30min。洗滌3次后加入50 u I/孔50% TMB-50%H202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時加入50 U I/孔lMmH2S04終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。注:所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 4.0軟件進行處理,使用ANOVA方法并結(jié)合Mann Whitney U test進行分析處理，P < 0.05判為差異顯著，P^0.001判為差異極顯著。
具體實施例本發(fā)明主要分為兩大板塊。一是設(shè)計并構(gòu)建所需質(zhì)粒，一是對疫苗組合進行篩選和評價。以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)進行詳細(xì)闡述:一、設(shè)計并構(gòu)建所需質(zhì)粒首先，為獲取候選疫苗基因FhCat LI，將從牛體肝臟中獲取的新鮮蟲體用于提取mRNA(具體的的提取方法見QIAGEN mRNA試劑盒)。然后將用RT-PCR方法獲取FhCat LI基因的cDNA及所需要的ORF片斷，并將其連接到pMD-18克隆載體中，形成pMD-Cat LI質(zhì)粒，然后進行PCR測序鑒定(見圖1)，與預(yù)期結(jié)果完全吻合。而IL4和Flt3L則直接從小鼠外周血中克隆，所用方法按照全血mRNA試劑盒進行。然后利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲取該兩基因，并將此兩基因直接連接入載體pVAXl分別獲得pVAXl-1L4(pIL4)，pVAXl_Flt3L (pFlt3L)。接下來就進行FhCat LI ORF片斷的表達(dá)，此時可用設(shè)計好的引物(Pel，Pe2)以pMD-Cat LI為模板，擴增目標(biāo)基因片斷，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a- Cat LI，經(jīng)測序等鑒定為陽性質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，在37°C和適當(dāng)濃度IPTG的刺激下獲得高度表達(dá)的Cat LI蛋白，然后將此蛋白經(jīng)HiS-Tag柱純化后透析，最后收獲蛋白，蛋白濃度為1.54mg/ml。整個蛋白的表達(dá)見圖2，其中A為蛋白在ImM IPTG刺激下獲得的SDS-PAGE蛋白條帶，B為過柱純化后獲得的片斷SDS-PAGE蛋白條帶，所有條帶大小均符合蛋白預(yù)期分子量。在運用western blotting方法鑒定此蛋白前,需要獲得Cat LI的多克隆抗體,為此，將5只6-7周齡雌性SD小鼠分別后腿肌肉注射30 μ g/只的純化后的Cat LI蛋白，總共進行3次免疫，每次間隔I周，最后I次免疫后I周采血分離血清用于Western blotting。在獲得Cat LI的多克隆抗體后，將構(gòu)建的pVAXl-Cat LI，pIL4和pFlt3L質(zhì)粒按照方法5進行Cos7中的真核表達(dá),并獲取培養(yǎng)液上清進行Western blotting鑒定。即先將上清中蛋白進行SDS-PAGE (30V，Ih)電泳后轉(zhuǎn)至尼龍膜上進行Western blotting鑒定。將膜用15ml IXTBS清洗2次后加入5%脫脂奶粉TBS液封閉未結(jié)合蛋白位點。經(jīng)過2次IXTTBS再清洗后，將尼龍膜撫育在多克隆抗體中l(wèi)h，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，再經(jīng)2次I X TTBS清洗后加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，經(jīng)2次I X TTBS清洗后加入發(fā)光底物Chemi Glow,然后進行成像處理以鑒定蛋白的表達(dá)情況(圖3)。從結(jié)果看可以確定所獲得的目的蛋白為正確的FhCat LI，IL4和Flt3L蛋白。至此，所有需要構(gòu)建的質(zhì)粒都已經(jīng)構(gòu)建和鑒定完畢。接下來要進行動物試驗，其前提是要獲得足夠的質(zhì)粒，所以進行了 DNA質(zhì)粒的大量制備方法是將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌后接種500ml含有50 μ g/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)物于4°C6000g離心30min后收集沉淀，并按照QIAGEN-tip 500試劑盒說明進行質(zhì)粒的大量提取。獲得的質(zhì)粒用UV260nm測定其濃度后儲存于4°C備用。二、對疫苗組合進行篩選和評價在獲得大量質(zhì)粒后，需要對小鼠進行免疫，并對免疫效果進行評價。在這同時，需要對疫苗組合，疫苗所使用劑量及與通常疫苗組合的比較進行評估。在獲得大量肝片吸蟲囊蝴后(見方法7)，本試驗首先進行疫苗組合的篩選。將60只6-8周齡雌性小鼠隨機分成6組，每組10只，分別在腿 部肌肉注PBS空白對照，40μ g/只PBS，PVAXI空質(zhì)粒，pVAXl-CatLI, pVAXl- Cat Ll+pIL4, pVAXl- Cat Ll+Flt3L, pVAXl- Cat Ll+Flt3L+ pIL4 質(zhì)粒，總共進行2次免疫,每次間隔7天。第2次免疫后14天將其中30只小鼠采血I次進行抗體水平測定，同時將其中的30只(每組5只)用作囊蝴感染，每只小鼠經(jīng)口感染30個囊蝴，在感染后35天即可處死小鼠，采集血液和脾臟以備實驗。在接下來的動物體液免疫評估中，采用間接ELISA對肝片吸蟲特異性IgGl和IgG2a進行測定，即應(yīng)用本試驗pET32a表達(dá)載體表達(dá)的CatLl蛋白(5mg/ml，50 μ I/孔)包被96孔ELISA平板，于4°C過夜。然后用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在進行2次TBST洗滌后加入50μ I/孔的倍比系列稀釋的血清(起始濃度1:100)，于4°C孵育過夜。將平板洗滌后加入1:6000稀釋的IgGl或1:4000稀釋的IgG2a，并于室溫孵育2h，然后加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。抗體效價的判定標(biāo)準(zhǔn)為:取大于標(biāo)準(zhǔn)差3倍的0.D值所對應(yīng)的最大稀釋度為抗體效價。所得的抗體效價見圖4，結(jié)果顯示pVAXl- Cat Ll+Flt3L+ pIL4免疫可刺激機體產(chǎn)生高滴度的IgGl，且IgGl的水平較IgG2a高。pVAXl空質(zhì)粒，pVAXl-Cat LI免疫小鼠后產(chǎn)生的IgGl均顯著低于pVAXl- Cat Ll+Flt3L+ pIL4，但在IgG2a上，組間無統(tǒng)計學(xué)差異。動物細(xì)胞免疫評估采用夾心ELISA對肝片吸蟲感染引起的外周血中細(xì)胞因子水平進行測定，所用試劑均為商品試劑盒。分別于96孔板加入50 Ul/孔的捕獲抗體(IL4，1:500 ；IL5,1:500 ；IFNy , 1:250)進行抗體包被，并于 4°C過夜。在用 200 u I 4%BSA PBS/ 孔孵育2h后分別加入50 u I/孔倍比倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體(起始濃度IL4，8ng/ml ；IL5,10 ng/ml ；IFNy ,50 ng/ml)及50 y I/孔的血清樣品，并于4°C過夜。洗滌3次后加入生物素標(biāo)記的抗體(終濃度IL4，IL5，IFNyIu g/ml)，于室溫孵育Ih后加入AMDEX鏈霉親和素孵育30min。洗滌3次后加入50 U I/孔50% TMB-50%H202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時加入50 U I/孔IMm H2SO4終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。結(jié)果見圖5，顯示pVAXl-Cat Ll+Flt3L+pIL4能刺激小鼠產(chǎn)生IL4和IL5，且較pVAXl空質(zhì)粒，pVAXl-Cat LI顯著增加，而IFNy的規(guī)律卻與IL4和IL5不同，各組間無明顯差異。最后，研究對該疫苗組合的保護效率進行了直觀評價，于第2次免疫后14天將將其中的30只(每組5只)用作囊蝴感染，每只小鼠經(jīng)口感染30個囊蝴，在感染后35天即可處死小鼠，根據(jù)最后獲得的肝片吸蟲數(shù)量來評估疫苗保護率。保護率的計算按照(PVAX1空質(zhì)粒免疫組的蟲體數(shù)量減去pVAXl-Cat Ll+Flt3L+pIL4免疫組蟲體的數(shù)量)除以pVAXl空質(zhì)粒免疫組的蟲體數(shù)量的百分?jǐn)?shù)來記錄。試驗結(jié)果(見圖6)，pVAXl-Cat Ll+Flt3L+pIL4獲得76.36%保護率。接下來要對所確定的免疫組合的劑量進行優(yōu)化。選取了 30^/只，40^/只，50 u g/只，100 u g/只和150 u g/只的劑量進行篩選。所設(shè)立的試驗和對照組有PBS，pVAXl空質(zhì)粒和pVAXl-Cat Ll+Flt3L+pIL4。在進行體液、細(xì)胞免疫效果及保護率評價時所采用的方法同上。結(jié)果體液免疫效果見圖7，30ii g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L肌肉注射能刺激小鼠產(chǎn)生比pcDNA- Cat LI顯著高水平的IgGl。IgG2a在組間無差異。而細(xì)胞因子檢測結(jié)果見圖8，30 u g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能刺激小鼠產(chǎn)生顯著高水平的IL4和IL5，與40 ii g/只,50 u g/只，100 u g/只和150 u g/只的劑量相比無顯著差異。IFN y在組間無差異。疫苗保護率結(jié)果見圖9，30ii g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L能使小鼠中蟲體成活數(shù)量較PVAXl組顯著降低(保護率為75.44%)，與40 ii g/只，50 u g/只，100 u g/只和150 Ug/只的劑量相比無顯著差異。顯然，雖然在 免疫保護率上與40 U g/只，50 u g/只，100 U g/只和150 U g/只的劑量相比無顯著差異，但從經(jīng)濟效率上顯然30 y g/只的免疫劑量具有更大的競爭優(yōu)勢，因此本研究確定使用30 u g/只的免疫劑量作為疫苗的最終使用濃度。最后要進行與通常使用的疫苗組合(即pcDNA- Cat LI,無任何佐劑添加)的比較研究。所設(shè)立的免疫組別有PBS，pVAXl空質(zhì)粒，pcDNA- Cat LI，pVAXl-Cat LI和pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L。在進行體液、細(xì)胞免疫效果及保護率評價時所采用的方法同上。結(jié)果體液免疫效果見圖10，30 u g/只pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L肌肉注射能刺激小鼠產(chǎn)生比pcDNA- Cat LI顯著高水平的IgGl。IgG2a在組間無差異。而細(xì)胞因子檢測結(jié)果見圖 ll，30ii g/只 pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L 能刺激小鼠產(chǎn)生比 pcDNA- Cat LI 顯著高水平的IL4和IL5。IFNy在組間無差異。疫苗保護率結(jié)果見圖12，30y g/只pVAXl-CatLl+pIL4+pFlt3L能使小鼠中蟲體成活數(shù)量較pVAXl組顯著降低(免疫保護率為70.9%)，但pcDNA- Cat LI較pVAXI組無顯著差異。綜上所述，所采用的IL4和pFlt3能很好的發(fā)揮免疫佐劑的增強作用，并且能將宿主免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)偏向Th2，從而使得機體更能抵抗肝片吸蟲囊蝴的攻擊。以30 y g/只的劑量的pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L免疫小鼠能獲得較相同劑量pcDNA- Cat LI高的保護率。具有用量少，經(jīng)濟實用的特點。本發(fā)明利用宿主機體Th2免疫反應(yīng)對蠕蟲感染具有很好的殺滅或抑制作用的普遍現(xiàn)象，選用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟，增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為DNA疫苗的分子佐劑，提高FhCat LI DNA疫苗在免疫BALB/c小鼠后的免疫原性和免疫保護率，為抗肝片吸蟲DNA疫苗的研發(fā)提供一種新思路，可用于我國抗肝片吸蟲病DNA疫苗的開發(fā)。參考文獻:
權(quán)利要求
1.一種提高編碼肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗保護率的疫苗組合，所述疫苗組合為pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L，其是采用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟、增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為Cat LI (FhCat LI)DNA疫苗的分子佐劑，提高抗肝片吸蟲病DNA疫苗的保護率。
2.一種制備提高編碼肝片吸蟲Cat LlCFhCat LI )DNA疫苗保護率的疫苗組合的方法，其特征在于所述包括以下步驟: 1)編碼IL4、Flt3L的真核質(zhì)粒的構(gòu)建:小鼠IL4序列采用特異性克隆引物(P3，P4)，P3-5’ CACCATG GGT CTC AAC CCC CA 3’，P4_ 5’ CTA CGA GTA ATC CAT TTG CA 3’ ;小鼠Flt3L 序列采用特異性克隆引物(P5, P6), P5-5’ CACCATG ACA GTG CTG GCG CCA GC 3’，P6-5’ CTA GGG ATG GGA GGG GAG GG 3’ ；在克隆引物 P3，P5 分別引入接頭序列 pcDNA3.1的CACC ;獲得的小鼠IL4/FU3L基因回收后連接入pVAXl質(zhì)粒，構(gòu)建得到pVAXl_IL4和pVAXl-Flt3L ； 2)編碼候選基因CatLI的真核質(zhì)粒的構(gòu)建:其中，特異性克隆引物(Pl，P2)，Pl- 5’`CACCGGATCCGTA CTG ACT ATT GGA TTG TG 3’，P2-5’ CC GMTTCTCA CGG AM TCG TGC CACCA 3’，在克隆引物P1，P2的上下游分別引入BamH I和EcoR I酶切位點；擴增得到的CatLI基因回收后連接入PMD18-T載體，得到pMD-Cat LI，再將Cat LI基因從pMD-Cat LI亞克隆入pVAXl質(zhì)粒獲取pVAXl-Cat LI質(zhì)粒； 3)利用大腸桿菌工程菌(Escherichiacoli)和真核細(xì)胞Cos7表達(dá)Cat LI蛋白； 4)CatLI多克隆抗體的制備； 5)純化和鑒定CatLI蛋白； 6)獲得疫苗組合pVAXl-Cat Ll+pIL4+pFlt3L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高編碼肝片吸蟲Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗保護率的疫苗組合，所述疫苗組合為pVAX1-Cat L1+pIL4+pFlt3L，具體涉及在構(gòu)建編碼肝片吸蟲Cat L1(FhCat L1)DNA質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，利用宿主機體Th2免疫反應(yīng)對蠕蟲感染具有很好的殺滅或抑制作用的普遍現(xiàn)象，選用能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟，增加DC數(shù)量和頻率的Flt3L及能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)趨向Th2的細(xì)胞因子IL4作為DNA疫苗的分子佐劑，提高FhCat L1 DNA疫苗在免疫BALB/c小鼠后的免疫原性和免疫保護率，為抗肝片吸蟲DNA 疫苗的研發(fā)提供一種新思路。
文檔編號C12N15/79GK103203028SQ20121051013
公開日2013年7月17日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者羅洪林 申請人:西南大學(xué)