一種生產降解木質素酶的方法

專利名稱：一種生產降解木質素酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及構建微生物工程菌生產重組蛋白的方法。具體是應用微生物工程菌生產重組混合木質素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶。
背景技術：
木質素過氧化物酶(Lignin Peroxidase, LiP),猛過氧化物酶(ManganesePeroxidase, MnP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木質素的作用。植物資源不斷再生，十分豐富。植物的基本成分是纖維素、半纖維素和木質素。其中在制造沼氣和乙醇業中有用的成分是纖維素，次之是半纖維素。前者基本成分是葡萄糖，而后者的基本成分是戊糖。這些糖都是轉化為乙醇和沼氣的物質。木質素是一種廣泛存在于植物體中的無定形的、分子結構中含有氧代苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性高聚物。它形成纖維支架，具有強化木質纖維的作用。纖維素分子之間被木質素鑲嵌，被鑲嵌著的纖維素不能被水解。要利用纖維素，必須先將木質素水解。木質素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶具有共同水解木質素的功能。木質素降解酶不僅應用于植物原料的生產乙醇和生產沼氣行業，還廣泛應用于造紙行業和環境保護等行業。有些天然的微生物具有表達木質素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶的能力，目前工業生產上是以天然的產菌株進行發酵生產這三種酶。但是，由于天然的產酶菌株的生長緩慢或(和)營養要求高，使生產成本較高。當前有研究用工程菌分別生產這三種酶，由于是分別用一個菌株生產其中的一種酶，那么生產三種酶則需要三道工序,使其生產成本過高。畢赤酵母(Pichiapastoris)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)都是常用于生產重組蛋白的宿主菌，但各 具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達產物的純化的特點，釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于在厭氧或需氧環境。

發明內容
本發明構建含木質素過氧化物酶基因表達框架、猛過氧化物酶和漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌；分別用含木質素過氧化物酶基因表達框架、猛過氧化物酶和漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合木質素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶。本發明所采用的技術方案是:1.克隆基因:從天然的產木質素過氧化物酶、產猛過氧化物酶、產漆酶的天然菌株中克隆過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶基因。2.獲得構建表達載體的啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止子序列和抗性基因序列。3.分別構建含這三種基因表達框架(基因表達框架:啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子)的畢赤酵母表達載體和釀酒酵母表達載體。載體上的啟動子是磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列。載體上其它元件還有G418抗性基因和氨芐青霉素抗性基因序列；弓丨導載體重組于畢赤酵母基因組或釀酒酵母基因組的同源序列；大腸桿菌復制起點。4.通過電轉化方法將以上構建的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母，將以上構建的釀酒酵母表達載體轉化釀酒酵母。分別篩選高表達木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶的重組子作為工程菌。5.分別發酵以上構建的畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶。本發明構建含木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶木霉的基因表達框架的畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶的優點體現于:(I)用工程菌取代天然菌株生產木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶木霉，通過增加基因拷貝數而提高酶的產量。(2)用含木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶基因表達框架的工程菌取代含單一酶基因的工程菌生產酶，用一個發酵工序同時生產木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶木霉取代了用三個工序分別生產重組木質素過氧化物酶或猛過氧化物酶或漆酶。節省了原材料、能耗和人力資源。(3)釀酒酵母和畢赤酵母在生產重組蛋白方面各具特征，本發明分別構建含木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶基因表達框架、聚糖外切酶基因表達框架的釀酒酵母工程菌和畢赤酵母工程菌，為其重組酶生產提供兩種菌株選擇。
具體實施例方式
下面采用非限定性實施例對本發明作進一步說明。實施例一1.1構建克隆載體由專業的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復制起點的兩條堿基互補的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過T4DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為PM。1.2獲取目標基因和構建表達載體相關兀件的DNA序列1.2.1用反轉錄PCR擴增白腐真菌的木質素過氧化物酶基因和猛過氧化物酶基因合成如下PCR引物:引物I.5 ’ TCGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTCGGC3 ’ [說明:引物 5 ’ 端的 8 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物2.5 ’ CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG 3 ’ [說明:5 ’ 端的 10 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個堿基)]引物3.5 ’ TTGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCAGCC3 ’ [說明:引物 5 ’ 端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物4.5 ’ CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG 3 ’ [說明:5 ’ 端的 IO 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個堿基)]應用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌屬的總RNA，以總RNA為模板，應用cDNA合成試劑盒反轉錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質素過氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板，應用引物3和引物4進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的猛過氧化物酶基因序列1.2.2用PCR擴增枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列合成如下PCR引物:引物1.5’ CGCCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGCTCTCCC 3’ [說明:5’ 端的 8 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物2.5’ CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA TCCATCGG 3’ [說明:5’ 端的 10個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個堿基)]
提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，用引物I和2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列 分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌漆酶基因序列。1.2.3用PCR擴增畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列。引物1:5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGG 3’引物2:5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTC 3’[說明:引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(其中有下劃線的6個堿基)]提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列。[說明:畢赤酵母基因組DNA提取方法:將畢赤酵母細胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]1.2.4合成a因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是a因子信號肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC1.2.5合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC1.2.6合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTG GAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG1.2.7合成如下氨芐青霉素抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點出個堿基)，沒有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]5，CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCG TTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3’1.2.8從畢赤酵母基因組中PCR擴增rDNA序列引物1:5， CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，引物2:5，CCTTCGMtgtctcaaagattaagccatgc 3，[說明:引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。1.3構建表達載體
1.3.1表達框架(啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子序列)的構建過程1.3.1.1通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列、a因子信號肽DNA序列、白腐真菌的木質素過氧化物酶基因序列和轉錄終止子序列依次重組于PM載體的多克隆位點。此載體稱為PMl。1.3.1.2通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列、a因子信號肽DNA序列、白腐真菌的猛過氧化物酶基因序列和轉錄終止子序列依次重組于PM載體的多克隆位點。此載體稱為PM2。1.3.1.3通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列、a因子信號肽DNA序列、枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列和轉錄終止子序列依次重組于PM載體的多克隆位點。此載體稱為PM3。1.3.1.4通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，切取PM2和PM3載體的表達框架,并將切下的表達框架依次插入于PMl的多克隆位點。此載體稱為PM123。1.3.1.5通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用依次將氨芐青霉素抗性基因、G418基因和畢赤酵母的rDNA序列重組于PM123載體的多克隆位點，從而完成表達載體的構建。1.4構建畢赤酵母工程菌

用常規的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態，將以上構建的載體DNA轉化于大腸桿菌，提取質粒(載體)DNA。按照常規方法制備畢赤酵母感受態，用電轉化方法將以上構建的質粒轉化畢赤酵母，將經過轉化作用的畢赤酵母細胞涂布于含G418濃度為700 u g/ml的YH)瓊脂平板(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)，30°C培養3天。從G418抗性平板上挑取菌落進行增菌。將畢赤酵母轉化子進行搖瓶發酵表達，根據SDS-PAGE電泳初步分析目標蛋白的表達。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標蛋白，然后將分離純化的目標蛋白用蛋白印跡法進行驗證(說明.蛋白印跡:委托專業的多肽合成服務公司人工合成以上三種蛋白序列C端的35個氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因在畢赤酵母中表達和分泌到胞外。從中篩選表達酶產量高的克隆作為畢赤酵母工程菌。1.5生產重組混合木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶將以上構建的畢赤酵母工程菌接種于YH)液體培養基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養至OD6tltl = 1.5作為種子液。在容量為I噸的發酵罐中裝入YPD培養基700升，按接入種子液7升，于30°C通過攪拌和加入壓縮空氣連續發酵32小時。離心取發酵液上清，測定發酵液上清的木質素過氧化物酶活性為> 2000單位/L，錳過氧化物酶活性為> 1300單位/L和漆酶活性為> 1400單位/L。說明:木質素過氧化物酶活性測定應用常規的天青B測定方法，錳過氧化物酶活性和漆酶活性測定均采用常規的愈創木酚測定方法。實施例二2.1構建克隆載體由專業的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復制起點的兩條堿基互補的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過T4DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為W。
2.2犾取目標基因和構建表達載體相關兀件的DNA序列2.2.1用反轉錄PCR擴增白腐真菌的木質素過氧化物酶基因和猛過氧化物酶基因合成如下PCR引物:引物I.5 ’ TCGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTCGGC3 ’ [說明:引物 5 ’ 端的 8 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物2.5 ’ CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG 3 ’ [說明:5 ’ 端的 10 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個堿基)]引物3.5 ’ TTGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCAGCC3 ’ [說明:引物 5 ’ 端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物4.5 ’ CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG 3 ’ [說明:5 ’ 端的 IO 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個堿基)]應用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌屬的總RNA，以總RNA為模板，應用cDNA合成試劑盒反轉錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質素過氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板，應用引物3和引物4進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的猛過氧化物酶基因序列2.2.2用PCR擴增枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列合成如下PCR引物:
引物1.5’ CGCCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGCTCTCCC 3’ [說明:5’ 端的 8 個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物2.5’ CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA TCCATCGG 3’ [說明:5’ 端的 10個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個堿基)]提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，用引物I和2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌漆酶基因序列。2.2.3用PCR擴增釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列。引物1:5’ CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3’[說明:引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]引物2: 5’ GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3’[說明:引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]提取釀酒酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列。
[說明:釀酒酵母基因組DNA提取方法:將釀酒酵母細胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]2.2.4合成a因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是a因子信號肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC2.2.5合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTC ATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAG ATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC2.2.6合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACC TGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG2.2.7合成如下氨芐青霉素抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點出個堿基)，沒有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]5，CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGC
CATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGT
TGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACG
TTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACT
GATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGA
ATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3>2.2.8從釀酒酵母基因組中PCR擴增rDNA序列引物1:5’ CCGGTACCTGAACTAACACCTTTTGTGG3，引物2:5’ CCTTCGAAGCTAATACATGCTTAAAATC3，[說明:引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個 堿基)]提取釀酒酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是釀酒酵母基因組中的rDNA序列。2.3構建表達載體2.3.1表達框架(啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子序列)的構建過程2.3.1.1通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，將釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列、α因子信號肽DNA序列、白腐真菌的木質素過氧化物酶基因序列和轉錄終止子序列依次重組于匪載體的多克隆位點。此載體稱為匪1。2.3.1.2通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，將釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列、α因子信號肽DNA序列、白腐真菌的猛過氧化物酶基因序列和轉錄終止子序列依次重組于匪載體的多克隆位點。此載體稱為匪2。2.3.1.3通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，將釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列、α因子信號肽DNA序列、枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列和轉錄終止子序列依次重組于匪載體的多克隆位點。此載體稱為匪3。2.3.1.4通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用，切取匪2和匪3載體的表達框架,并將切下的表達框架依次插入于匪I的多克隆位點。此載體稱為匪123。2.3.1.5通過DNA限制性內切酶和T4DNA連接酶的作用依次將氨芐青霉素抗性基因、G418基因和釀酒酵母的rDNA序列重組于匪123載體的多克隆位點，從而完成表達載體的構建。2.4構建釀酒酵母工程菌用常規的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態，將以上構建的載體DNA轉化于大腸桿菌，提取質粒(載體)DNA。按照常規方法制備釀酒酵母感受態，用電轉化方法將以上構建的質粒轉化釀酒酵母，將經過轉化作用的釀酒酵母細胞涂布于含G418濃度為700 μ g/ml的YB)瓊脂平板(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)，30°C培養3天。從G418抗性平板上挑取菌落進行增菌。將釀酒酵母轉化子進行搖瓶發酵表達，根據SDS-PAGE電泳初步分析目標蛋白的表達。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標蛋白，然后將分離純化的目標蛋白用蛋白印跡法進行驗證(說明.蛋白印跡:委托專業的多肽合成服務公司人工合成以上三種蛋白序列C端的35個氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因在釀酒酵母中表達和分泌到胞外。從中篩選表達酶產量高的克隆作為釀酒工程菌。2.5生產重組混合木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶將以上構建的釀酒酵母工程菌接種于YH)液體培養基(2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖)中培養至0D600 = 1.5作為種子液。在容量為I噸的發酵罐中裝入YH)培養基700升，按接入種子液7升，于30°C通過攪拌和加入壓縮空氣連續發酵32小時。離心取發酵液上清，測定發酵液上清的木質素過氧化物酶活性為> 17000單位/L，錳過氧化物酶活性為> 1200單位/L和漆酶活性為> 1300單位/L。說明:木質素過氧化物酶活性測定應用常規的天青B測定方法，錳過氧化物酶活性和漆酶活性測定均采用 常規的愈創木酚測定方法。
權利要求
1.一種生產降解木質素酶的方法，其特征在于，其具體步驟如下: 1)、應用分子生物學技術從微生物中克隆木質素過氧化物酶基因、錳過氧化物酶基因和漆酶基因； 2)、分別構建含上述基因的表達框架的畢赤酵母表達載體和釀酒酵母表達載體； 3)、將上述構建的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母獲得畢赤酵母重組子，將上述構建的釀酒酵母表達載體轉化釀酒酵母獲得釀酒酵母重組子； 4)、篩選高表達以上所述的木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的畢赤酵母重組子作為畢赤酵母工程菌；篩選高表達以上所述的木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的釀酒酵母重組子作為釀酒酵母工程菌； 5)、分別發酵以上所述的畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶。
2.根據權利要求1所述一種制備分解植物的木質素的菌劑的方法，其特征在于:利用權利要求1所述的生 產方法制備木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶產品。
全文摘要
本發明公開了一種生產降解木質素酶的方法。屬生物技術領域。首先分別從微生物中克隆木質素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶基因；構建含上述三種基因表達框架的畢赤酵母表達載體和釀酒酵母表達載體，并將載體轉化相應的宿主菌而獲得工程菌。分別發酵畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組木質素過氧化物酶，猛過氧化物酶和漆酶。本發明的優點體現于用工程菌取代天然菌株生產木質素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶，通過增加基因拷貝數而提高酶的產量；用含三種酶基因表達框架的工程菌取代含單一酶基因表達框架的工程菌生產其中的單一種酶，節省了原材料、能耗和人力資源。
文檔編號C12R1/865GK103205403SQ20121049899
公開日2013年7月17日 申請日期2012年11月18日 優先權日2012年11月18日
發明者張愛聯, 符仙, 楊穗珊, 尹慧祥, 張添元, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所