專利名稱：一株人參病害生物防治菌株的獲得及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物生物防治技術領域，具體涉及防治植物，特別是一株人參病害生物防治菌株的甲基營養型芽孢桿菌iBaciIlusmethyIotrophicus')及應用。
背景技術：
人參是一種名貴的中藥材，在我國具有悠久的藥用歷史，近些年由于市場需求的增長，人工栽培人參規模也隨之增加。在人參種植過程中，病害的發生和發展將會對產量和品質造成嚴重的影響，有效控制病害是人參生產中的重要環節。目前，防治病害的主要方法
是利用化學農藥在病害發生期進行控制，但長期使用化學農藥或不合理使用會導致人參中農藥殘留超標、品質下降、污染環境和病原菌產生抗藥性等不良后果的出現。自2007年以來，我國人參產品出口數量呈下降趨勢，出口的人參常因農藥殘留超標不時有被退回的現象發生，國際市場信譽不良。因此開展人參病害生物防治研究，獲得生防菌株和有效產品，減少或替代化學農藥的使用，對于保障我國人參生產安全，加快人參產業可持續發展進程，提高我省人參產品的質量及國際市場競爭力具有重要意義。植物內生菌是一類定殖在植物體內與植物建立和諧關系的一類微生物，有些菌株具有拮抗、促生等生物學功能，可產生多種生物活性物質，特別是在新的抗植物病蟲害物質方面，為我們提供了一類新的微生物資源，目前已有多種植物的功能內生菌報道。因此，從人參植株體內獲得具有較好抗菌和生防作用的新型細菌菌株，進而生產出高效的生物菌齊U，將有利于人參病害的防治，減少化學農藥的污染。
發明內容
本發明的目的是植物，特別是人參病害防治生物農藥，克服農藥殘留超標問題，而提供一種人參內生拮抗細菌，甲基營養型芽孢桿菌菌株。甲基營養型芽孢桿菌iBac i 11 u sme thylotrophicu，它的保藏編號為CGMCCNo.6679 ；
甲基營養型芽孢桿菌NJ13的種子培養基，它包括胰蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl5g/L，pH 為 7.0;
甲基營養型芽孢桿菌NJ13的發酵培養基，它包括葡萄糖30 g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉 15 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 I g/L , pH 8. O ；
甲基營養型芽孢桿菌NJ13在防治植物病害方面的應用，所述的植物病害是由人參銹腐病菌、人參灰霉病菌、人參菌核病菌、人參疫病病菌、人參黑斑病菌、人參根腐病菌、人參立枯病菌、大豆根腐病鐮刀菌、玉米莖基腐病鐮刀菌、玉米大斑病菌、水稻紋枯病菌、煙草赤星病菌、煙草炭疽病菌、番茄葉霉病菌、甜瓜細菌性果斑病菌、煙草野火病菌、番茄細菌性斑點病菌、白菜軟腐病菌、黃瓜細菌性斑點病菌和\或水稻白葉枯病菌引起的；
植物病害防治的生物農藥，它是甲基營養型芽孢桿菌NJ13的發酵菌液 植物病害防治的生物農藥，它是發酵菌液濾出菌體后的濾液。
植物病害防治的生物農藥是由下述方法制得，它包括
1)種子培養液制備，甲基營養型芽孢桿菌NJ13在種子培基中，即胰蛋白胨10g/L、酵母膏 10 g/L、NaCl 5g/L、pH 7. 0，培養 IOh ;
2)種子培養液接種于發酵培養基中，即葡萄糖30g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉15 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 I g/L, pH 8.0，28°C恒溫搖床培養96 h，制得的發酵液;
將所述的發酵液稀釋5倍。本發明提供了人參內生拮抗細菌NJ13，是一種甲基營養型芽孢桿菌，是從人參莖部分離、篩選得到的；其發酵菌液及其濾液能拮抗人參常見7種病害及其它常見植物病害，特別是對人參灰霉病和人參黑斑病防治效果更佳；它來源于人參植株，對人參安全；發酵過程中所用原料成本較低；抗菌活性物質制備簡單，操作方便，防治效果好；能有效的解決人參農藥防治殘留嚴重的問題，是一種可產業化生產的、廣譜、高效的綠色生物農藥。
圖1為NJ13菌株菌體對3種人參病原菌的抑制作用圖，A :人參菌核病菌；B :人參立枯病菌；C :人參黑斑病菌；
圖2為NJ13菌株的抗菌譜的測定，A :人參灰霉病菌；B :人參立枯病菌；C :人參銹腐病菌；D :人參根腐病菌；
圖3為NJ13菌株菌落形態和染色觀察，A :菌落形態；B :革蘭氏染色形態；
圖4為NJ13菌株的細胞形態；
圖5為NJ13菌株的發酵稀釋液對人參灰霉病菌的田間防治作用圖，A :清水對照；B 發病后噴施NJ13菌株5倍稀釋液的防治效果；
圖6為NJ13菌株的發酵稀釋液對人參黑斑病菌的田間防治作用圖，A :清水對照；B 發病后噴施NJ13菌株5倍稀釋液的防治效果。
具體實施例方式實施例1人參內生拮抗細菌株NJ13的篩選
2010年6 9月，在吉林省5個地區分別采集新鮮人參(/ :爐'/ ·^/ ^)樣品，采集部位為整個植株，生長期為4年。在人參根、莖、葉不同器官中共分離獲得了 152株內生細菌。進行人參拮抗內生菌的篩選分為初篩和復篩。其中人參植物莖部分離的NJ13菌株；于2012年10月18日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 6679，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101 ;分類命名甲基營養型芽孢桿菌{Bad llusme thylo trophi cus )。實施例2人參內生拮抗細菌株NJ13的抗菌性測定
釆用對峙法對分離得到的人參內生拮抗細菌NJ13進行菌體抑菌活性的實驗。將7種人參病害IE標菌(人參銹腐病菌iCylindrocarpon人參灰霉病菌iBotrytis
cinerea)Λ 人參菌核病 HSclerotinia schinseng、、人參疫霉鬼 iPhytophthora 人參黑斑病菌(Alternaria人參根腐菌iFusarium solani)、人參立枯
病菌挪i))菌餅接入TOA培養皿中央，同時將內生細菌NJ13劃線接入靶標菌兩側，25 0C培養2 4d，人參內生拮抗細菌NJ13菌體對上述病害均有抑菌作用(圖1)。采用杯碟法對人參內生拮抗細菌株NJ13，進行無菌發酵液抗菌譜測定。①將菌株NJ13接種于裝有50mL NB液體培養基的250 mL三角瓶中，28°C振蕩培養IOh (150 r/min)制成種子液；②按3%的接種量，將種子液接入50ml細菌液體培養基中(葡萄糖20 g/L,胰蛋白胨 5 g/L，酵母粉 5 g/L，牛肉膏 3. 8 g/L, NaCl 5 g/L，CaCO3 I g/L, pH 7.0)，于 28°C振蕩培養(150 r/min)3d ;③收集培養液離心(12000 r/min, 4°C) 15 min后得清液，取上清液用O. 22 Mffl的無菌濾膜過濾除菌后備用，得無菌發酵液。④將Iml無菌水加入靶標菌的培養試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下制成菌懸液與PDA培養基10 mL混合后到入9 cm的培養皿中制成混菌平板。⑤將滅菌牛津杯放入混好靶標菌的PDA平板中央，杯中加入200·KL無菌發酵濾液，分別置25°C培養3 d 5 d (真菌)、28°C培養I d (細菌)后測定抑菌圈直徑。結果發現菌株NJ13的發酵液對7種常見人參病菌及其它病原真菌都有不同程度的抑制作用(圖2)，而發酵液對8種病原細菌的抑菌效果明顯小于表I中真菌的抑菌效果，其中對大豆細菌性斑點病菌沒有抑制效果(表I)。證明菌株NJ13所產生的活性物質的抑菌譜較廣，且對不同種類病原菌具有選擇性。表I菌株NJ13發酵濾液對22種植物病原菌的抑菌效果
權利要求
1.甲基營養型芽孢桿菌，它的保藏編號為CGMCCNo. 6679。
2.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌NJ13的種子培養基，它包括胰蛋白胨10g/L、酵母膏 10 g/L, NaCl 5 g/L，pHS7.0。
3.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌NJ13的發酵培養基，它包括葡萄糖30g/L、淀粉 15 g/L、酵母浸粉 15 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 I g/L，pH 為 8. O。
4.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌NJ13在防治植物病害方面的應用，所述的植物病害是由人參銹腐病菌、人參灰霉病菌、人參菌核病菌、人參疫病病菌、人參黑斑病菌、人參根腐病菌、人參立枯病菌、大豆根腐病鐮刀菌、玉米莖基腐病鐮刀菌、玉米大斑病菌、水稻紋枯病菌、煙草赤星病菌、煙草炭疽病菌、番茄葉霉病菌、甜瓜細菌性果斑病菌、煙草野火病菌、番茄細菌性斑點病菌、白菜軟腐病菌、黃瓜細菌性斑點病菌和/或水稻白葉枯病菌引起的。
5.植物病害防治的生物農藥，它是權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌NJl3發酵菌液。
6.植物病害防治的生物農藥，它是權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌NJl3發酵菌液濾出菌體后的濾液。
7.植物病害防治的生物農藥，是由下述方法制得，它包括 1)種子培養液制備，權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌NJ13在權利要求2所述的種子培基中，培養10 h ； 2)種子培養液接種于權利要求3所述的發酵培養基中，28°C恒溫搖床培養96h，制得發酵液。
8.根據權利要求7所述的植物病害防治的生物農藥，其特征在于，將所述的發酵液稀釋5倍。
全文摘要
本發明公開了一株人參病害生物防治菌株的獲得及應用，它是人參內生拮抗細菌NJ13，一種甲基營養型芽孢桿菌，是從人參莖部分離、篩選得到的；其發酵菌液及其濾液能拮抗人參常見7種病害及其它常見植物病害，特別是對人參灰霉病和人參黑斑病防治效果更佳；它來源于人參植株，對人參安全；發酵過程中所用原料成本較低；抗菌活性物質制備簡單，操作方便，防治效果好；能有效的解決人參農藥防治殘留嚴重的問題，是一種可產業化生產的、廣譜、高效的綠色生物農藥。
文檔編號C12N1/20GK103013860SQ201210498378
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者陳長卿, 姜云, 尹望 申請人:吉林農業大學