一種與肝癌易感性相關的單核苷酸多態性位點rs9275319及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術的基因領域，涉及與肝癌易感性相關的單核苷酸多態性位點（SNP）及其應用。本發明提供了遺傳區域6p21.3的基因部分序列（序列如SEQ.ID.NO.1所示）及其中一個SNP位點rs9275319（序列如SEQ.ID.NO.2所示）。本發明還提供了檢測該SNP位點的方法，序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示的特異性核酸引物，及序列如SEQ.ID.NO.5所示的UEP引物。本發明還涉及SNP位點rs9275319的檢測試劑盒及其應用。本發明能夠對rs9275319位點進行基因分型，方法簡便、快速，結果準確、明了，為肝癌易感性鑒定以及預防和治療提供了一個新的途徑。
【專利說明】—種與肝癌易感性相關的單核苷酸多態性位點rs9275319
及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術的基因領域，具體涉及一個與肝癌易感性相關的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點及其應用。
【背景技術】
[0002]肝癌是世界上第七大常見惡性腫瘤，在癌癥相關死因中位于第三位(YangJD, Roberts LR.Hepatocel lular carcinoma:A global view.Nat Rev GastroenterolHepatol.2010;7:448-58.)，全球每年預計新發病例74.83萬人，病死例數約69.59萬人，其中半數以上的肝癌病例都集中在中國(Jemal A, Bray F，Center MM, Ferlay J, WardE, Forman D.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin.2011;61:69-90.X
[0003]在世界范圍內，慢性乙肝和慢性丙肝是肝癌的主要風險因子，幾乎80%的肝癌病人均有乙肝或丙肝病史，54%的肝癌病人其患癌的原因是乙肝病毒的感染；但是在中國，超過80%的肝癌病人均有乙肝病史(Tanaka M, Katayama F，Kato H, Tanaka
H,Wang J, Qiao YL, InoueM.Hepatitis B and C virus infection and hepatocellularcarcinoma in China: a reviewof epidemiology and control measures.JEpidemiol.2011;21:401-16.)。
[0004]中國是世界上的乙肝大國，普通人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的陽性率為高達9%，有1.2億人曾經感染過乙肝病毒，其中有3000萬人轉化成為了慢性乙肝，占全世界所有乙肝病人的三分之一。患慢性乙肝五年后，有10-20%的人將發展成為肝硬化；有約6-15%的慢性乙肝和肝硬化病人會發展成為肝癌(Liu J, Fan D.Hepatitis B in China.Lancet.2007;369(9573):1582-3.)。
[0005]乙肝發展成為肝癌的風險因素有很多，其中遺傳因素是乙肝發展成為肝癌的重要風險因素。研究表明，相比于沒有肝癌家族史的乙肝病人而言，有肝癌家族史的乙肝病人發展成為肝癌的相對風險(relative risk, RR)是2.41,有兩個以上親屬是肝癌患者的乙肝病人發展成為肝癌的RR高達5.55 (Yu MW，Chang HC, Liaw YF, Lin SM, LeeSD,Liu CJ,ChenPJ, Hsiao TJ,Lee PH,Chen CJ.Familial risk of hepatocellularcarcinoma among chronichepatitis B carriers and their relatives.J Natl CancerInst.2000;92:1159-64.)。
[0006]造成個體之間差異的遺傳物質基礎之一就是SNP。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，它是人類可遺傳的基因組變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個堿基對中就有I個，估計其總數可達300萬個甚至更多(Collins FS, Brooks LD, ChakravartiA.A DNApolymorphism discovery resource for research on human genetic variation.Genome Res.1998; 8 (12): 1229-31.)。目前，SNP是研究人類常見疾病遺傳變異的重要依據。但是，至今未見有本發明涉及的STAT4基因與肝癌相關聯的報道，也沒有關于STAT4基因上多態性位點與肝癌的相關性以及針對具體SNP的檢測方法和檢測試劑盒的報道。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種與肝癌易感性相關的6p21.3區域內的基因序列，通過SNP位點rs9275319的序列研究，提出一種易感性相關的肝癌高危人群的篩查的方法，以利于預防和治療。
[0008]本發明首先提供與肝癌易感性相關的6p21.3區域上的部分基因序列，該基因序列的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，其第501位為G或者A。
[0009]本發明研究表明6ρ21.3區域與肝癌的6ρ21.3區域上的一個SNP位點rs9275319。rs9275319 位于基因 HLA-DQB1 與 HLA-DQA2 之間；rs9275319 堿基為 G 或者 A ；rs9275319 的核苷酸序列通過http://genome, uses, edu/數據庫獲得，其序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0010]本發明還提供檢測一個SNP位點的特異性核酸引物:SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4、SEQ.1D.N0.5，且特異性地擴增出該SNP位點的擴增產物。
[0011]本發明還提供所述的與肝癌易感性相關的6p21.3遺傳區域的應用，通過提取受試者基因組DNA進行SNP性位點rs9275319的基因分型，其中rs9275319堿基為A的個體為肝癌易感人群，rs9275319堿基為G的個體為肝癌非易感人群。
[0012]本發明還提供檢測一個SNP位點的特異性核酸引物:SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4，以及UEP引物(單堿基延伸引物)SEQ.1D.N0.5，以便特異性地擴增出該SNP位點的擴增產物。
[0013]本發明還提供一種檢測SNP位點rs9275319的方法，獲得rs9275319序列的步驟依次為:
[0014](I)利用特異性核酸引物(SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4)擴增樣本的DNA ；
[0015](2)取步驟(1)的產物為模板，利用UEP引物(SEQ.1D.N0.5)進行單堿基延伸；
[0016](3)質譜檢測步驟(2)的產物。
[0017]其中，步驟(1)的擴增條件可以為:95°C 2min ；95 V 0.5min, 56 V 0.5min,72°C lmin, 45 個循環；72°C 5min，25°C ⑴(無限)min。
[0018]其中，步驟(1)的產物通常經過純化后再進行單堿基延伸。
[0019]其中，步驟(2)所述的單堿基延伸的條件可以為:94 V 30s ；94 V 5s,52°C 5s-80°C 5s，內部循環 5 次，外部循環 40 次；72°C 180s ;25°C^(無限)s。
[0020]其中，獲得rs9275319序列的具體步驟可以如下:
[0021]選擇SNP性位點rs9275319并設計引物；
[0022]依據相應的堿基序列合成特異性核酸引物:ACGTTGGATGCCTCAAMGTAGGGAAGCTG(SEQ.1D.N0.3), ACGTTGGATGCCACCCTTCATTTTTCTCCC (SEQ.1D.N0.4)以及 UEP 引物:TCTGTGGTTGAAGGTC (SEQ.1D.N0.5) ；PCR 反應體系 5ul:0.625ul 10XTaqBuffer, 0.125mMdNTP, 0.12ull0nM PCR 引物 Mix，0.32525nM MgCl2, 0.lul5U/ML Hotstar 酶，用 ddH20 補足5ul ;PCR 反應條件:95°C 2min ；95°C 0.5min，56°C 0.5min，72°C lmin，45 個循環；72°C 5min,25 °C min ；SAP 純化反應體系 2ul:0.17ullOXSAPBuffer, 0.31U/ul SAP 酶，用 ddH20補足2ul ；SAP純化反應條件:37 °C 40min, 85 °C 5min, 25 °C 00 min ;單堿基延伸反應體系2ul:0.210 X iPlexBuffer, 0.2iPlex Termination, 0.33100uM 終止引物 Μ?χ,Ο.041iPlexEnzyme,用 ddH20 補足 2ul ;單堿基延伸反應條件:94 °C 30s ；94°C 5s, 52 °C 5s_8(TC 5s，內部循環5次，外部循環40次；72°C 180s ；25°C°o s ;將反應產物經樹脂純化后，取15nL，SpectroCHIP 芯片上樣；通過MassARRAY? MALD1-TOF Mass Spectrometry 進行質譜檢測，并獲取SNP rs9275319分型數據。
[0023]本發明還提供了一種檢測SNP位點rs9275319的試劑盒，所述的試劑盒包括序列如SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4所示的特異性核酸引物。
[0024]所述的試劑盒還包括UEP引物，其序列如SEQ.1D.N0.5所示。[0025]所述的試劑盒還可以包括PCR的緩沖液。
[0026]所述的試劑盒還可以包括標準試劑和說明書，等等。
[0027]本發明提供了上述試劑盒的應用，利用該試劑盒確定SNP位點rs9275319的序列:擴增樣本的DNA ;然后進行單堿基延伸；最后質譜檢測并分型。
[0028]其中，可以利用上述特異性核酸引物和UEP引物擴增樣本的DNA。
[0029]實驗表明，本發明可以特異、高效檢測出rs9275319多態性位點。利用Taqman方法和直接測序，檢測相同樣本，基因分型結果相同。
[0030]本發明還提供所述的與肝癌易感性相關的6p21.3遺傳區域的應用，通過提取受試者基因組DNA進行SNP性位點rs9275319的基因分型，其中rs9275319堿基為A的個體為肝癌易感人群，rs9275319堿基為G的個體為肝癌非易感人群。
[0031]本發明的優點:
[0032]I)根據本發明提供的引物序列可以特異、高效檢測出rs9275319多態性位點。
[0033]2)根據本發明檢測SNP位點rs9275319的基因分型結果判定肝癌易感人群的方法，可對未表現出腫瘤臨床癥狀的乙肝病人進行篩查，來應用于對肝癌輔助診斷和對乙肝病人是否具有肝癌易感性進行評判，從而有利于疾病的預防、早期診斷和治療。
[0034]3)位于rs9275319多態性位點附近的DNA序列還有不少SNP位點，這些信息將對判斷肝癌的發生發展起到一定作用。
【具體實施方式】
[0035]以下結合具體實施例，以進一步說明本發明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0036]實施例1.[0037]通過提取受試者基因組DNA進行SNP位點rs9275319的基因分型，其中rs9275319堿基為A的個體為肝癌的易感人群。具體做法是:
[0038]1.基因組DNA的提取
[0039]受試者均由外周靜脈血抽取2-3ml，采用QIAamp Blood MiniKit250 (QIAGEN，德國)試劑盒提取基因組DNA，-20°C保存。
[0040]2.SNP基因分型
[0041]根據SNP的序列信息，設計PCR反應和單堿基擴展引物(即UEP引物)，并在生物工程(上海)有限公司合成。合成后的引物與樣品DNA進行PCR反應，混合后的反應產物在SequenomiPLEX儀器(Sequenom公司)上進行SNP基因分型。具體實驗流程如下:
[0042](I)引物設計:為多重反應自動設計PCR引物(SEQ.1D.N0.3 ;SEQ.1D.N0.4)和iPLRX* Gold 單堿基延伸引物(SEQ.1D.N0.5)；
[0043](2) PCR 反應:
[0044](A) PCR反應液(Mix):按照下表中的順序從上到下依次加入,單位:ul
【權利要求】
1.一種與肝癌易感性相關的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包括SNP位點rs9275319，其序列如 SEQ.1D.N0.2 所示。
2.如權利要求1所述的核酸分子，其特征在于，該核酸分子的第27位堿基是G或者A。
3.一種與肝癌易感性相關的6p21.3區域上的基因部分序列，其特征在于，該6p21.3區域上的基因部分序列包括權利要求1所述的序列，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
4.一組檢測SNP位點rs9275319的引物，其特征在于，所述的引物由特異性核酸引物和UEP引物組成，特異性核酸引物的序列如SEQ.1D.N0.3和SEQ.1D.N0.4所示，UEP引物的序列如SEQ.1D.N0.5所示。
5.一種檢測SNP位點rs9275319的方法，其特征在于，獲得rs9275319序列的步驟依次為: (1)利用權利要求4所述的特異性核酸引物擴增樣本的DNA;所述的特異性核酸引物的序列如 SEQ.1D.N0.3 和 SEQ.1D.N0.4 所示； (2)以步驟(1)的產物為模板，利用UEP引物進行單堿基延伸，所述的UEP引物的序列如 SEQ.1D.N0.5 所示； (3)質譜檢測步驟(2)的產物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)的擴增條件為:95°C2min ；95°C 0.5min, 56°C 0.5min, 72°C lmin, 45 個循環；72°C 5min, 25°C ① min。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)的產物經過純化后再進行單堿基延伸。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的單堿基延伸的條件為:940C 30s ；94°C 5s, 52°C 5s_80°C 5s,內部循環 5 次，外部循環 40 次；72°C 180s ；25°C^ s。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，獲得rs9275319序列的具體步驟如下: 選擇SNP位點rs9275319并設計引物； 依據相應的堿基序列合成特異性核酸引物SEQ.1D.N0.3，SEQ.1D.N0.4以及UEP引物SEQ.1D.N0.5 ；PCR 反應體系 5ul:0.625ul 10 X TaqBuffer, 0.125mM dNTP, 0.12ull0nM PCR引物 Mix，0.32525nM MgCl2, 0.lul5U/ML Hotstar 酶，用 ddH20 補足 5ul ;PCR 反應條件:95°C 2min ；95°C 0.5min, 56°C 0.5min, 72°C lmin, 45 個循環；72°C 5min, 25°C ⑴ min ；SAP 純化反應體系 2ul:0.17ullOXSAPBuffer, 0.31U/ul SAP 酶，用 ddH20 補足 2ul ；SAP 純化反應條件:37°C 40min，85°C 5min, 25°C ^ min ；
單喊基延伸反應體系 2ul: 0.210 X iPlexBuffer, 0.2iPlex Termination, 0.33IOOuM終止引物Mix,0.041iPlex Enzyme,用ddH20補足2ul ;單堿基延伸反應條件:94°C 30s ；94°C 5s, 52°C 5s-80°C 5s,內部循環 5 次，外部循環 40 次；72°C 180s ；25°C^ s ； 將反應產物經樹脂純化后，取IOnL進行SpectroCHIP芯片上樣；通過MassARRAY?MALD1-TOF Mass Spectrometry進行質譜檢測，并獲取SNP位點rs9275319的分型數據。
10.一種檢測SNP位點rs9275319的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括權利要求4所述的特異性核酸引物。
11.如權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括UEP引物，其序列如 SEQ.1D.N0.5 所示。
12.如權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括的PCR中使用的緩沖液。
13.權利要求1所述的核酸分子的應用，其特征在于，通過提取受試者基因組DNA進行SNP位點rs9275319的基因分型，rs9275319堿基為A的個體為肝癌易感人群，rs9275319堿基為G的個體為肝癌非易感人群。
14.權利要求10所述的試劑盒的應用，其特征在于，確定SNP位點rs9275319的序列:擴增樣本的DNA ;然后進行單堿基延伸；最后質譜檢測并分型。
15.如權利要求14所述的應用，其特征在于，利用權利要求4所述的特異性核酸引物擴增離體樣本的基因組DNA，利用UEP引物進行單堿基延伸。
【文檔編號】C12N15/11GK103834639SQ201210493219
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優先權日:2012年11月27日
【發明者】余龍, 蔣德科, 徐劍鋒, 馬曉顰, 唐麗莎 申請人:復旦大學