專利名稱：一種α-熊果苷生產過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，涉及一種α -熊果苷生產過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法。
背景技術：
熊果苷是一種氫醌的葡萄糖苷衍生物，首次發現于熊果屬的植物葉子中。熊果苷具有鎮咳、祛痰、抗炎、抗菌等生理活性，因而被用作鎮咳藥物和尿道消毒劑等使用。更為重要的是，熊果苷能夠抑制酪氨酸酶的活性，從而遏制黑色素的生長，因此可以作為一種美白成分添加于化妝品中。熊果苷有兩種異構體α-熊果苷和β_熊果苷。其中，α-熊果苷的結構比β_熊果苷更穩定，美白效果是β_熊果苷10倍以上，并且對表皮細胞的正常生長沒有影響，具有穩定、有效、安全的特點，因此α-熊果苷是21世紀最有競爭力的美白添加劑之一。
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α -熊果苷與β -熊果苷的來源有所不同，β -熊果苷可以通過植物提取、植物細胞培養、有機合成以及糖基轉移酶或糖苷酶的轉糖基反應或逆水解反應獲得。，而α -熊果苷一般只能通過微生物直接轉化或或微生物的酶催化轉糖基反應獲得。但通過微生物直接轉化制備熊果苷的產率較低，而糖苷酶的價格昂貴，只適于實驗室制備，都不適用于工業化大規模生產α-熊果苷。因而較低成本的獲得高酶活的糖苷酶對于生產催化合成α-熊果苷十分必要。專利201110009399. 6公開了一株表達重組蔗糖磷酸化酶的大腸桿菌，利用該菌發酵可以生成高酶活的蔗糖磷酸化酶，并且利用該酶催化蔗糖和氫醌進行轉糖基反應可以大量生產α-熊果苷，生產成本相對于直接利用糖苷酶低。此外由于整個酶催化反應的條件溫和，反應時間短，所以反應結束后，反應液中蔗糖磷酸化酶的酶活仍然較高。因此回收并重復利用蔗糖磷酸化酶，可以進一步降低生產成本。固定化蔗糖磷酸化酶可以重復利用，這可以在一定程度上降低酶的使用成成本較高。但整個酶的固定化成本也比較高,包括酶的分離純化成本及固定化成本。因此直接利用非固定的即游離的蔗糖磷酸化酶作為催化劑，可有效地省去酶的分離、純化、固定化等過程，大大降低酶的制備成本。在利用游離的蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷的過程中，能否實現非固定化蔗糖磷酸化酶的多次回收利用是降低酶成本的關鍵，也是游離蔗糖磷酸化酶能否應用于工業化生產α-熊果苷的制約因素。
發明內容
本發明的目的在于提供一種α -熊果苷生產過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，有效地解決游離蔗糖磷酸化酶的回收利用，使得蔗糖磷酸化酶的使用成本顯著降低，對于游離蔗糖磷酸化酶應用于酶催化領域有著重大的意義。本發明以蔗糖和氫醌為底物，利用游離蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化生產α -熊果苷，反應結束后，利用膜分離方法進行游離蔗糖磷酸化酶的回收，再利用回收的蔗糖磷酸化酶進行下一批次的催化反應。本發明中，利用游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化合成α -熊果苷可以采用現有技術公開的任一種技術方案，作為本發明的最佳實施方式，優選合成過程為加入濃度為20-50% (w/v)的蔗糖，濃度為1-5% (w/v)的氫醌，酶活為100-300 U/mL的蔗糖磷酸化酶粗酶液，反應PH為6-7，反應溫度為20-40 0C，輕微攪拌，反應20-30h后，氫醌的轉化率可達到90%，更優選合成過程為將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為2% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節pH至6，反應溫度為35 V,輕微攪拌，反應24h。。上述合成反應結束后，首先加入濃度為1%_10% (w/v)的穩定添加劑，然后利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，再利用孔徑較小的超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收。該超濾回收過程中，α-熊果苷作為濾出液濾出，收集處理后可得合成產物α -熊果苷。本發明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，蔗糖磷酸化酶的回收率達到95%以上，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。最后利用回收的蔗糖磷酸化酶進行下一批·次的催化合成α -熊果苷，除了不需要另外添加酶液以外，其他反應條件與前一批次相同，這樣可以達到反復使用蔗糖磷酸化酶的目的。如此進行5個批次反應后，回收的蔗糖磷酸化酶的活性還可以保持在初始酶活的85%以上。本發明所述蔗糖磷酸化酶為游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液，理論上所述的蔗糖磷酸化酶可以來源于多種菌株，為實現更好的回收效果，本發明優先考慮大腸桿菌SP1515，該酶在催化反應結束之后仍然具有較高的酶活力。本發明所述的添加劑為海藻糖、葡聚糖和/或甘露醇，所述添加劑的用量為反應液的1%-10% (w/v)。優選地,所述的添加劑為相當于反應液5% (w/v)的海藻糖、葡聚糖或甘露醇。更優選所述的添加劑為相當于反應液5% (w/v)的海藻糖。本發明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，特別的使用了添加劑來增強蔗糖磷酸化酶的穩定性，使得回收過程中蔗糖磷酸化酶的酶活損失較少。本發明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，所述陶瓷膜的孔徑為O. 1-0. 15Mffl，優選為 O. 12Mm。本發明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，所述超濾膜為醋酸纖維膜、混合纖維膜或聚砜膜，優選醋酸纖維膜膜，所述超濾膜的截留分子量為2000-10000Da，優選為5000Dao采用上述技術方案，本發明的有益效果在于本發明首次提出利用膜回收游離蔗糖磷酸化酶，有效地解決游離蔗糖磷酸化酶的回收利用。并通過加入添加劑，增加回收過程中酶的穩定性，提高了酶活的回收率。此外先利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后再利用孔徑較小的超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收，對于降低膜污染，延長膜的使用壽命，降低生產成本等都具有重大意義，從而使得游離蔗糖磷酸化酶在酶催化領域有很好的應用前景。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例I :
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 6% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節PH至6，反應溫度為25 °C，輕微攪拌，反應24h。在此反應條件下，氫醌的轉化率可達到90%。反應結束后，向反應液中加入相當于反應液5% (w/v)的海藻糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為5000Da的醋酸纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到97%，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。實施例2
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 6% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節PH至6，反應溫度為25 °C，輕微攪拌，反應24h。在此反應條件下，氫醌的轉化率可達到90%。
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反應結束后，向反應液中加入相當于反應液5% (w/v)的海藻糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. IMffl的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為2000Da的醋酸纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到93%，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。實施例3
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 8% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節PH至6，反應溫度為30 °C，輕微攪拌，反應24h。在此反應條件下，氫醌的轉化率可達到85%。反應結束后，向反應液中加入相當于反應液5% (w/v)的葡聚糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為5000Da的混合纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到90%，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。實施例4
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為I. 8% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節PH至6，反應溫度為30 °C，輕微攪拌，反應24h。在此反應條件下，氫醌的轉化率可達到85%。反應結束后，向反應液中加入相當于反應液3% (w/v)的葡聚糖并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. IMffl的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為IOOOODa的混合纖維膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到86%，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。實施例5
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為2% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節PH至6，反應溫度為35 °C，輕微攪拌，反應24h。在此反應條件下，氫醌的轉化率可達到81%。反應結束后，向反應液中加入相當于反應液5% (w/v)的甘露醇并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為5000Da的聚砜膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到88%，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。實施例6
將濃度為20% (w/v)的蔗糖，濃度為2% (w/v)的氫醌，酶活為200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反應器中，調節PH至6，反應溫度為35 °C，輕微攪拌，反應24h。在此反應條件下，氫醌的轉化率可達到81%。反應結束后，向反應液中加入相當于反應液3% (w/v)的甘露醇并攪拌均勻，先利用膜孔徑為O. 的陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量為2000Da的聚砜膜進行超濾，回收游離的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率達到84%，回收的酶液中殘留的反應物以及產物均小于5%。雖然，上文中已經用一般性說明具體實施方式
及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種α-熊果苷生產過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，以蔗糖和氫醌為底物，利用游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化合成α-熊果苷，其特征在于合成反應結束后，首先向除去α-熊果苷的反應液中加入添加劑以增加蔗糖磷酸化酶的穩定性，然后利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及大分子蛋白，再利用超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收。
2.根據權利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶來源于大腸桿菌spl515。
3.根據權利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加劑為海 藻糖、葡聚糖或甘露醇，所述添加劑的用量為反應液質量體積比的1%-10%。
4.根據權利要求3所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加劑為相當于反應液質量體積比5%的海藻糖、葡聚糖或甘露醇，并攪拌均勻。
5.根據權利要求4所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加劑為相當于反應液質量體積比5%的海藻糖，并攪拌均勻。
6.根據權利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔徑為 O. 1-0. 2Mflio
7.根據權利要求6所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔徑為 O. 15Mm。
8.根據權利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超濾膜為醋酸纖維膜、混合纖維膜或聚砜膜。
9.根據權利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超濾膜為醋酸纖維膜。
10.根據權利要求1-9任一項所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超濾膜的截留分子量為2000-10000Da。
全文摘要
本發明提供了一種α-熊果苷生產過程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，所述α-熊果苷生產過程以蔗糖和氫醌為底物，利用游離的蔗糖磷酸化酶粗酶液作為催化劑催化合成α-熊果苷。反應結束后，首先向反應液中加入一定濃度的添加劑以提高其穩定性，然后利用陶瓷膜過濾除去不溶性的絮狀物質以及一些大分子蛋白，再利用孔徑較小的超濾膜進行游離蔗糖磷酸化酶的回收，最后利用回收的蔗糖磷酸化酶進行下一批次的催化反應。反復操作，達到重復利用蔗糖磷酸化酶的目的。本發明首次提出蔗糖磷酸化酶的回收利用，并且該方法對于降低膜污染，延長膜的使用壽命，降低生產成本等都具有重大意義，從而使得游離蔗糖磷酸化酶在酶催化領域有很好的應用前景。
文檔編號C12N9/10GK102925418SQ20121047470
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者姜岷, 萬月佳, 賀愛永, 馬江鋒, 張敏, 陳可泉, 韋萍, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學