專利名稱：一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法
技術領域：
本發明屬于菌種培養技術領域，涉及一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法。
背景技術：
金花菌是茯磚茶發花 過程中自然形成的一種具有益生性能的優勢菌，學名為冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。獲磚茶是一種主銷邊疆地區的古老茶品，具有生津止渴、消滯減肥等益生功效，研究表明這與金花菌的存在是密不可分的。自然發酵的茯磚茶中易生長曲霉、青霉等多種雜菌，影響了金花菌的正常生長，從而降低了茯磚茶的品質，且發酵周期較長。若能人工培養獲得金花菌的孢子粉，用以接種發酵茯磚茶，不僅可以縮短發酵周期，而且降低雜菌的污染，從而提高茯磚茶的品質。
發明內容
本發明解決的問題在于提供一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，以獲得人工培養金花菌的孢子粉，用以接種發酵茯磚茶，不僅可以縮短發酵周期，而且降低雜菌的污染。本發明是通過以下技術方案來實現一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，包括以下步驟I)將金花菌接種至種子培養基斜面，26 30°C培養5d，得到種子培養物；2)向種子培養物加入無菌水，洗下金花菌孢子，充分振蕩后，得到均勻分散的孢子懸液；3)將麩皮與水以IOOg:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養基，在培養容器中鋪平，厚度為O. 8 I. 5cm,濕熱滅菌；滅菌后，以5 15%的體積比接種孢子懸液，充分搖勻，在26 30°C恒溫培養，接種后培養容器的出口用紗布封蓋，待白色菌絲開始萌發時在紗布上加蓋無菌透氣封口膜，在白色菌絲萌發結束黃色菌絲開始萌發時去掉無菌透氣封口膜，培養6 8d后得到曲種；4)將麩皮與水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養基，在培養容器中鋪平，厚度為2. O 3. Ocm,濕熱滅菌；滅菌后，以5 10%的質量比接種曲種,在26 30°C恒溫培養，接種后O 36h內培養容器的出口用紗布封蓋，并在白色菌絲萌發結束黃色菌絲剛剛萌發時去掉無菌透氣封口膜，繼續培養3 4d后停止培養，得到麩曲；5)將麩曲粉碎后過篩，得到金花菌孢子粉。所述的金花菌是自茯磚茶中分離純化得到，其分離純化方法為取茯磚茶茶葉10g，加入90mL無菌水，IlOr mirT1震蕩IOmin得到菌懸液，并進行梯度稀釋，將梯度濃度的菌懸液分別涂布到CZG(5%NaCl)培養基上，28°C恒溫培養；取適宜稀釋濃度的菌落，進行劃線分離，28°C培養5d后挑取單菌落，再次劃線分離，直至挑取單菌落后鏡檢無雜菌，得到金花菌的純菌種，轉接至斜面于4°C保存。所述的步驟I)中所用的種子培養基為CZG培養基(5%NaCl)。
所述的步驟2)中，向種子培養物加入無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以100 120r · mirT1振蕩5 15min,得到均勻分散的孢子懸液。所述的步驟3)中，所述的濕熱滅菌時，將麩皮與水充分混勻后分裝錐形瓶中，110 121°C滅菌20 30min ;滅菌結束后，立即振蕩搖散培養基。置于無菌操作臺中冷卻
至室溫。所述還繼續培養3 5d后金花菌的閉囊殼數量豐富，呈均勻金黃色。
所述步驟4)中當白色菌絲萌發前加蓋無菌透氣封口膜，菌絲變黃前去掉，培養至金黃色停止培養。所述步驟5)中麩曲經粉碎后過100目篩；或者麩曲粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫儲藏。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，以粗代精選用了麩皮培養基，不僅成本低、方法穩定、易于操作，且獲得的孢子肥大而稠密；而且在白色菌絲萌發期間，通過加蓋無菌透氣封口膜，一方面控制通氣量，另一方面控制培養基的水分，保證了培養基表面的濕度適宜，避免了金花菌在白色菌絲萌發期間以無性孢子萌發，減少了雜菌污染，從而提高所需的有性孢子的質量。所獲得的金花菌孢子粉中，其孢子含量為8 X IO8個/g。本發明提供的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，短時間即可獲得大量的金花菌孢子粉，所獲得的金花菌孢子粉可以用以微生物有效成分的提取，也可以直接用作人工發酵茯磚茶的菌種，大大縮短茯磚茶制作周期，減少雜菌的污染，從而提高茯磚茶品質。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。本發明所述的金花菌可以采用現有各菌種保藏中心的保藏菌種，也可以自行分離純化。比如采用劃線法進行分離純化取獲磚茶茶葉IOg,加入90ml無菌水，IlOr .mirT1震蕩IOmin得到菌懸液,并進行梯度稀釋(至IO6倍)，將梯度濃度的菌懸液分別涂布到CZG(5%NaCl)培養基上，28°C恒溫培養；取適宜稀釋濃度的菌落，進行劃線分離，28°C培養5d后挑取單菌落，再次劃線分離，直至挑取單菌落后鏡檢無雜菌，得到金花菌的純菌種，轉接至斜面于4°C保存。實施例I—種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，包括以下步驟步驟I)菌種活化取自茯磚茶中分離純化得到的金花菌接種至CZG(5%NaCl)斜面培養基(試管18X 180mm)，28°C培養(需氧)，培養至5d時菌落呈現金黃色，即得到種子培養物，備用。步驟2)制備孢子懸液將上述培養好的種子培養物加入30mL無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以lOOi^mirT1振蕩lOmin，得到均勻分散的孢子懸液，備用。步驟3)孢子培養取麩皮，以每IOOg加水80mL配制固體培養基，充分混勻后分裝250mL錐形瓶中，鋪平厚度為1.0 1.3(^，以八層紗布包好，1211滅菌301^11。滅菌結束后，立即振蕩搖散培養基。置于無菌操作臺中冷卻至室溫，接種步驟2)的孢子懸液lmL，并充分搖勻后于28°C恒溫培養箱培養。待培養至第2d白色菌絲萌發，在錐形瓶的出口加蓋無菌透氣封口膜，白色菌絲逐漸長滿培養基并在培養第3d時去掉。繼續于28°C恒溫培養箱中培養至7d，培養基呈現干燥緊致的餅狀，且金花菌的閉囊殼數量豐富，均勻金黃色，即得到曲種，備用。步驟4)擴大培養按上述加水量潤料均勻后，取曲盤，攤平厚度為2. O 3. 0cm，八層紗布覆蓋，滅菌后冷卻至室溫，以10%的接種量接種至曲盤，培養4 5d。其中培養12h后加蓋無菌透氣封口膜，至培養36h后菌絲變黃前去掉,繼續于28°C恒溫培養箱中培養至4 5d，停止培養。步驟5):孢子收集將上述麩曲經粉碎后過100目篩，即得到 金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫長期儲藏。實施例2步驟I):菌種活化取自茯磚茶中分離純化得到的金花菌接種至CZG(5%NaCl)斜面培養基(試管15 X 150mm)，30°C培養，培養至5d時菌落呈現金黃色，即得到種子培養物，備用。步驟2):制備孢子懸液將上述培養好的種子培養物加入20mL無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以IlOr min—1振蕩lOmin，得到均勻分散的孢子懸液，備用。步驟3):孢子培養取麩皮，以每IOOg加水IOOmL配制固體培養基，充分混勻后分裝500mL錐形瓶中，鋪平厚度為O. 8 I. Ocm,以八層紗布包好，121°C滅菌30min。滅菌結束后，立即振蕩搖散培養基。置于無菌操作臺中冷卻至室溫，接種步驟2)的孢子懸液2mL，并充分振蕩搖勻后放置29°C恒溫培養箱，培養第2d加蓋無菌透氣封口膜，并于培養第3d去掉。繼續在培養至7d，培養基呈現干燥緊致的餅狀，且金花菌的閉囊殼數量豐富，均勻金黃色，即得到曲種，備用。步驟4):擴大培養按上述加水量潤料均勻后，取曲盤，攤平厚度為2. O 2. 5cm,八層紗布覆蓋，滅菌后冷卻至室溫，以5%的接種量接種至曲盤，培養4d。其中第14h加蓋無菌透氣封口膜，并繼續培養15 20h后菌絲變黃前去掉，培養至金黃色停止培養。步驟5):孢子收集將上述麩曲經粉碎后過100目篩，即得到金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫長期儲藏。實施例3步驟I):菌種活化取自茯磚茶中分離純化得到的金花菌接種至CZG(5%NaCl)斜面培養基(試管20X200mm)，28°C培養，培養至5d時菌落呈現金黃色，即得到種子培養物，備用。步驟2):制備孢子懸液將上述培養好的種子培養物加入30mL無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以IlOr · min—1振蕩5min，得到均勻分散的孢子懸液，備用。步驟3):孢子培養取麩皮，以每IOOg加水80mL配制固體培養基，充分混勻后分裝500mL錐形瓶中，鋪平厚度為O. 8 I. Ocm,以八層紗布包好，121°C滅菌30min。滅菌結束后，立即振蕩搖散培養基。置于無菌操作臺中冷卻至室溫，接種步驟2)的孢子懸液2mL，并充分搖勻于28°C恒溫培養箱培養，并培養第2d加蓋無菌透氣封口膜，菌絲逐漸變黃于第3d時去掉。繼續在28°C恒溫培養箱中培養至6d，培養基呈現干燥緊致的餅狀，且金花菌的閉囊殼數量豐富，均勻金黃色，即得到曲種，備用。步驟4):擴大培養按上述加水量潤料均勻后，取曲盤，攤平厚度為2. O 3. Ocm,八層紗布覆蓋，滅菌后冷卻至室溫，以10%的接種量接種至曲盤，培養4d。其中第12h加蓋無菌透氣封口膜，并繼續培養20 24h后菌絲變黃前去掉，培養至金黃色停止培養。步驟5):孢子收集將上述麩曲經粉碎后過100目篩，即 得到金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫長期儲藏。
權利要求
1.一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將金花菌接種至種子培養基斜面，26 30°C培養5d，得到種子培養物； 2)向種子培養物加入無菌水，洗下金花菌孢子，充分振蕩后，得到均勻分散的孢子懸液； 3)將麩皮與水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養基，在培養容器中鋪平，厚度為O. 8 I. 5cm,濕熱滅菌； 滅菌后，以5 15%的體積比接種孢子懸液，充分搖勻，在26 30°C恒溫培養，接種后培養容器的出口用紗布封蓋，待白色菌絲開始萌發時在紗布上加蓋無菌透氣封口膜，在白色菌絲萌發結束黃色菌絲開始萌發時去掉無菌透氣封口膜，培養6 8d后得到曲種； 4)將麩皮與水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養基，在培養容器中鋪平，厚度為2. O 3. 0cm，濕熱滅菌； 滅菌后，以5 10%的質量比接種曲種，在26 30°C恒溫培養，接種后O 36h內培養容器的出口用紗布封蓋，并在紗布上加蓋無菌透氣封口膜，并在白色菌絲萌發結束黃色菌絲剛剛萌發時去掉無菌透氣封口膜，繼續培養3 4d后停止培養，得到麩曲； 5)將麩曲粉碎后過篩，得到金花菌孢子粉。
2.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的金花菌是自茯磚茶中分離純化得到，其分離純化方法為取茯磚茶茶葉10g，加入90mL無菌水，IlOr · HiirT1震蕩IOmin得到菌懸液，并進行梯度稀釋，將梯度濃度的菌懸液分別涂布到CZG(5%NaCl)培養基上，28°C恒溫培養；取適宜稀釋濃度的菌落，進行劃線分離，28°C培養5d后挑取單菌落，再次劃線分離，直至挑取單菌落后鏡檢無雜菌，得到金花菌的純菌種，轉接至斜面于4°C保存。
3.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟I)中所用的種子培養基為CZG培養基(5%NaCl)。
4.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)中，向種子培養物加入無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以100 120r · mirT1振蕩5 15min,得到均勻分散的孢子懸液。
5.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)中，所述的濕熱滅菌時，將麩皮與水充分混勻后分裝錐形瓶中，110 121°C滅菌20 30min;滅菌結束后，立即振蕩搖散培養基，置于無菌操作臺中冷卻至室溫。
6.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)中，去掉無菌透氣封口膜后，繼續培養3 5d金花菌的閉囊殼數量豐富，呈均勻金黃色。
7.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中當白色菌絲萌發前加蓋無菌透氣封口膜，菌絲變黃前去掉，培養至金黃色停止培養。
8.如權利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中麩曲經粉碎后過100目篩；或者麩曲粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫儲藏。
全文摘要
本發明公開了一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，包括將金花菌接種至CZG斜面培養基，26～30℃培養5d，得到種子培養物；向種子培養物加入無菌水，洗下金花菌孢子，充分振蕩后，得到均勻分散的孢子懸液；在培養基上接種孢子懸液，在26～30℃恒溫培養，在白色菌絲萌發前加蓋無菌透氣封口膜，并在黃色菌絲萌發時去掉，繼續培養3～5d后得到曲種；然后再進行擴大培養得到麩曲；將麩曲粉碎后過篩，得到金花菌孢子粉。本發明以獲得人工培養金花菌的孢子粉，既可以用于金花菌有效成分的提取，也可以用以接種發酵茯磚茶，不僅可以縮短發酵周期，而且降低雜菌的污染。
文檔編號C12N3/00GK102965328SQ20121047047
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者呂嘉櫪, 李玉婷 申請人:陜西科技大學