一種赤霉菌及發酵生產赤霉素GA₄₊₇的方法

專利名稱：一種赤霉菌及發酵生產赤霉素GA₄₊₇的方法
技術領域：
本發明屬于發酵工程領域，主要涉及的是對本實驗室篩選到的一株產赤霉素ga4+7的赤霉菌發酵培養基進行優化同時對發酵過程進行控制以提高ga4+7效價的方法。
背景技術：
我國是擁有幾千年歷史的農耕大國，在傳統的種植業中糧食的產量在很大程度上取決于當地的日照、溫度、濕度等氣候條件。利用現代科學技術，突破環境地域的限制，是解決糧食危機的主要手段。研究發現，植物細胞在接受溫度光照等環境信號時，會產生低濃度
可調節植物生理反應的活性物質，影響細胞的分裂、伸長、分化，這些活性物質被稱為植物激素。赤霉素是六大植物激素之一，目前已發現上百種赤霉素同系物，GA4+7和6^最具使用價值和商業價值。GA3因為活性過高，副作用很大，GA4+7以其獨特的優勢成為了目前農業領域研究的熱點。它在植物體內的含量非常低，工業中主要是通過赤霉菌發酵生產，作為一種新型高效的植物生長激素，主要具有如下特點①破壞休眠。植物在開花前都需要經過低溫和長日照，以促進GA4+7的合成，打破植物的休眠，外源性的添加GA4+7可以使植物種子提前發芽。②增加座果，植物的開花期用GA4+7噴灑后可以防止空洞果，增加座果率，能防止在使用其它的生長激素過程中所帶來的營養的浪費。③刺激細胞分裂擴大，GA4+7可以抑制細胞壁過氧化物酶的活性，增加壁的柔韌性，而具有更好伸展性，生長加快，能使細胞周期縮短30%左右。④誘導單性結實，如在諸如葡萄、草莓、杏、梨、番茄等果實的生長前期，用一定濃度的GA4+7噴灑，可生長得到無籽果實。GA4+7是不能人工合成的植物激素，其工業化生產主要是利用赤霉菌發酵生產。赤霉菌發酵會產生不同種類的赤霉素，其中以GA3為主，對以產GA4+7為主的菌種報道極少。GA4+7作為赤霉菌的次級代謝產物，培養條件與營養組分對其產量影響很大。不同的碳源、氮源、PH及溫度均會對其產生影響，再加上赤霉菌是強好氧菌，對氧氣的需求量非常高，不同的發酵條件會產生不同種類赤霉素，對后期分離提取提出了很高的要求。這嚴重制約著GA4+7的產量，針對這些問題，若能利用GA4+7產生菌建立一套優化的發酵方法，增加GA4+7效價，將具有巨大的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種赤霉菌；本發明的另一目的提供一種利用上述赤霉菌發酵生產赤霉素ga4+7的方法，在于通過發酵培養基的優化及發酵條件的控制提高GA4+7產量。本發明的技術方案為一種赤霉菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號是CGMCCNo. 5588，分類命名赤霉菌，菌種的拉丁學名 Gibberella fujikuroi，參據的微生物株 NJYHWG32261，保藏日期是 2011. 12. 14。本發明還提供了一種利用上述赤霉菌發酵生產GA4+7的方法，其具體步驟為為(I)平板培養將赤霉菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養基上，在pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，培養2 4天，得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培養基的組成為(g/L) : 土豆汁150 250、葡萄糖10 30、瓊脂15 20 ;(2)種子培養從PDA培養基上挑1-2個活化的赤霉菌菌落到裝種子培養基的搖瓶中，在pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉速為160 200rpm，培養2 4天，得到種子液；其中種子培養基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;種子培養基為(g/L):葡萄糖30 50、NH4NO3I 2、MgSO4 7H20 0. 8 I. 2、KH2PO4 3H20 0. 5 I. 0 ;(3)發酵培養將種子液按發酵培養基體積的5% 10%比例接種于裝發酵培養基的搖瓶中，控制pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉速為160 200rpm，在發酵過程的前期增大發酵液的通氣量，發酵中后期補加植物油和特征前體，培養6 8天，得到發酵液；其中發酵培養基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;發酵培養基為(g/L) :30 50的速
效碳源與10 30的遲緩碳源、0. 5 I. 0的氮源、MgSO4 *7H200. 8 I. 2,KH2PO4 *3H200. 5 I. O、NaCl 3 5;優選步驟(3)所述的速效碳源為葡萄糖、蔗糖、飴糖或乳糖；遲緩碳源為糊精或淀粉水解液；氮源為(NH4)2S04、NH4N03、NaNO3、花生餅粉、黃豆餅粉或玉米漿。優選步驟(3)中發酵24 28h把搖床轉速提高到220 230rpm以提高發酵液的通氣量；在發酵72 120h補加植物油，植物油的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0. I 0. 3g/L ;特征前體的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0. 2 0. 4g/L ;所述的植物油為豆油或芝麻油；所述的特征前體為氨基乙酸或甲羥戊酸。CGMCC No. 5588菌株具有下述性質I、形態與培養特征在PDA培養基上培養，菌落圓形，菌絲為白色，稠密的細絨毛狀，生長旺盛，后期中央菌絲由白色轉為黑灰色。有性世代產生子囊孢子，子囊殼呈橢球狀，黑色，大小為lols.sxio^Heym。無性世代產生分生孢子，白色，孢子鐮刀型，有隔膜。赤霉菌菌絲生長和子囊孢子萌發都要合適條件最適溫度28°C，相對濕度70%，喜偏酸性近中性，PH6.(T7.0,最適 PH6. 8。2、生理生化特性赤霉菌CGMCC No. 5588菌株的主要生理生化特征見表I :表I菌株的生理生化特征
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權利要求
1.一種赤霉菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號是CGMCC No. 5588，分類命名赤霉菌，菌種的拉丁學名Gibberellafujikuroi，參據的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011. 12. 14。
2.一種利用如權利要求I所述赤霉菌發酵生產赤霉素GA4+7的方法，其具體步驟為 (1)平板培養將赤霉菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養基上，在pH6.0 7. 0，溫度為26 32°C，培養2 4天，得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培養基的組成為(g/L):土豆汁150 250、葡萄糖10 30、瓊脂15 20 ; (2)種子培養從PDA培養基上挑1-2個活化的赤霉菌菌落到裝種子培養基的搖瓶中，在pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉速為160 200rpm，培養2 4天，得到種子液；其中種子培養基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;種子培養基為(g/L):葡萄糖30 50、NH4NO3I 2、MgSO4 7H20 0. 8 I. 2、KH2PO4 3H20 0. 5 I. 0 ; (3)發酵培養將種子液按發酵培養基體積的5% 10%比例接種于裝發酵培養基的搖瓶中，控制pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉速為160 200rpm，在發酵過程的前期增大發酵液的通氣量，發酵中后期補加植物油和特征前體，培養6 8天，得到發酵液；其中發酵培養基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;發酵培養基為(g/L) :30 50的速效碳源與 10 30 的遲緩碳源、0. 5 I. 0 的氮源、MgSO4 7H200. 8 I. 2、KH2PO4 3H200. 5 I.O、NaCl 3 5。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的速效碳源為葡萄糖、蔗糖、飴糖或乳糖；遲緩碳源為糊精或淀粉水解液；氮源為(NH4)2S04、NH4N03、NaN03、花生餅粉、黃豆餅粉或玉米漿。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中發酵24 28h把搖床轉速提高到220 230rpm以提高發酵液的通氣量；在發酵72 120h補加植物油，植物油的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0. I 0. 3g/L ;特征前體的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0. 2 0. 4g/L ;其中所述的植物油為豆油或芝麻油；所述的特征前體為氨基乙酸或甲羥戊酸。
全文摘要
本發明公開了一種赤霉菌及利用該菌株發酵生產赤霉素GA4+7的方法，屬于發酵工程領域。該方法包括平板培養，種子培養，發酵培養以及在發酵培養過程中的條件控制，在發酵培養基中添加混合碳源，在特定的發酵時間補加植物油、添加特征性前體及增加氧通量，而達到提高GA4+7效價的目的。本菌株發酵獲得的GA4+7效價高，成本低，操作簡便，有利于工業化生產。
文檔編號C12N1/14GK102978122SQ201210470269
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者胡永紅, 李佼佼, 楊文革, 錢永根, 唐容容 申請人:南京工業大學