專利名稱：豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus)屬于抱疫病毒科中抱疫病毒亞科豬抱疫病毒I型，能引起急性傳染的豬偽狂犬病(Aujeszky' s disease)。豬偽狂犬病在世界范圍內(nèi)大流行，對(duì)全球的養(yǎng)豬業(yè)危害極大，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬發(fā)生偽狂犬病以后，其臨床癥狀取決于感染豬的年齡、病毒株的毒力、感染的劑量和途徑。成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊和種豬不育等綜合癥候群。15日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病死亡率可達(dá)100%，斷奶仔豬發(fā)病率40%，死亡率20%左右；對(duì)成年肥豬可引起生長停滯，增重緩慢等。目前本病被認(rèn)為是威脅養(yǎng)豬生產(chǎn)和引起死亡的主要疾病之一?！?br>
疫苗接種是有效防制豬偽狂犬病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。我國目前預(yù)防豬偽狂犬病的疫苗主要Bartha -K61株和BUK株等基因缺失弱毒活疫苗，弱毒疫苗免疫效果好沿用多年，至今在偽狂犬病的防制中仍起著重要作用。但是在實(shí)際生產(chǎn)中該病并沒有得到很好的控制，其中存在的問題引起疫苗研究者的重視。首先，弱毒疫苗可引起潛伏感染，并有散毒的危險(xiǎn)，部分接種豬盡管血清中存在中和抗體，但排毒期仍可持續(xù)數(shù)年。其次，弱毒疫苗株在動(dòng)物體內(nèi)可能會(huì)與野毒或不同的基因缺失疫苗株之間發(fā)生基因重組從而變成強(qiáng)毒株成為新的傳染源。再次，未經(jīng)充分致弱或過度致弱的疫苗株不僅不能誘導(dǎo)足夠的免疫保護(hù)反應(yīng)，反而可能引起疾病及免疫抑制。對(duì)仔豬來說，其體內(nèi)的母源抗體一定程度上影響了弱毒活疫苗的免疫效果。所以，豬偽狂犬滅活疫苗比弱毒疫苗能更有效地預(yù)防和控制偽狂犬病。但是，現(xiàn)有技術(shù)中存在的豬偽狂犬滅活疫苗的免疫效果、抗體持續(xù)期都不理想。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株對(duì)目前流行的豬偽狂犬病毒有很好的免疫原性。本發(fā)明的另一目的是提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物免疫豬抗體水平較高，持續(xù)期長。本發(fā)明還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預(yù)防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號(hào)是=CGMCC NO. 6604。豬偽狂犬病毒PRV-JS株的保藏信息如下
生物材料(株)=PRV-JS
分類命名豬皰疹病毒I型
拉丁文學(xué)名Pseudorabies virus
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所 保藏日期2012年9月24日 保藏編號(hào)CGMCC NO. 6604.
一種疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學(xué)上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟
制備水相將吐溫-80與滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液按體積比4 96混合均勻，得到水相；
制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 94混勻，得到油相；
乳化將油相和水相按照體積比為3 1混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。 本發(fā)明還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預(yù)防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應(yīng)用。所述疾病為豬偽狂犬病毒引起的仔豬神經(jīng)癥狀、母豬繁殖障礙及種豬不育癥。該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。本發(fā)明從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產(chǎn)毒株及檢驗(yàn)用毒種。本發(fā)明提供的疫苗組合物免疫后，豬產(chǎn)生的抗體水平較高，持續(xù)期長。采用本發(fā)明制備的疫苗組合物可用于預(yù)防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。
圖I接種了含毒材料的BHK21細(xì)胞的照片。圖2正常BHK21細(xì)胞的照片。圖3斷奶仔豬攻毒后的體溫變化。圖4是發(fā)病豬各組織PCR鑒定的電泳圖，其中泳道I-陰性對(duì)照，泳道2-腦，泳道3-淋巴，泳道4-肺，泳道5-腎，泳道6-脾，泳道7-2000 DNA Maker。圖5仔豬免疫豬偽狂犬病滅活疫苗后的ELISA抗體水平。圖6顯示攻毒后仔豬的體溫變化。圖7豬偽狂犬病滅活疫苗免疫后備母豬ELISA抗體消長規(guī)律。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I豬偽狂犬病毒的獲得和特性測定 I.病毒分離
采集我國江蘇南京地區(qū)某一養(yǎng)豬場發(fā)病仔豬的脾、肺、腎、淋巴組織作為含毒材料。先將含毒材料無菌操作置于乳缽中，然后加入滅菌生理鹽水5ml，反復(fù)磨細(xì)；在每毫升處理過的含毒材料中加入青霉素200U和鏈霉素200U，混勻，將其放入-20 1冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3次，每次快凍快融以使病毒能從破碎的細(xì)胞中釋放出來；12000 r/min離心lOmin，取上清接種至BHK21細(xì)胞(購買自ATCC，即美國模式培養(yǎng)物集存庫)培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，與正常BHK21細(xì)胞(圖2)相比，含毒材料接種的BHK21細(xì)胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)樣病變(圖I)。將培養(yǎng)物凍融2次后，獲得病毒液。
2.病毒鑒定
提取本實(shí)施例標(biāo)題I中所獲病毒液中的DNA，具體步驟如下取病毒液400 μ L，加入12. 5 μ L蛋白酶K和50 μ L、濃度為10%的SDS溶液，混勻，56°C作用30min ;依次加入200 μ L氯仿和200 μ L苯酚，劇烈振蕩15s，室溫放置5min ；4°C，12000轉(zhuǎn)離心IOmin ;取上清，加入等體積的氯仿混勻，室溫放置5min ；4°C, 12000轉(zhuǎn)離心IOmin ;取上清加入2倍體積的無水乙醇和I / 10體積、濃度為3M的乙酸鈉溶液，_20°C放置30min ；4°C, 12000轉(zhuǎn)離心IOmin ；棄上清，加入75%的乙醇1000 μ L洗滌；4°C，7500轉(zhuǎn)離心5min ;棄上清，干燥IOmin ;加入15 μ L雙蒸水溶解沉淀并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)一對(duì)gE蛋白基因區(qū)域引物進(jìn)行PCR鑒定，上游引物PRV-F (SEQ ID NO: I):CCCTGGACGCGAACGGCACGATG ;下游引物 PRV-R (SEQ ID NO:2): GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系(50ul):模板 5 μ L, GC Buffer 25 μ L, Mg2+ 3 μ L, dNTP2 μ L, PRV-F I μ L, PRV-R I μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，H2O 12. 5 μ L。 PCR 反應(yīng)程序94°C 預(yù)變性 5min ;進(jìn)入循環(huán)94°C 60s，68°C 60s, 72°C 60s, 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將PCR擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行測序，結(jié)果顯示片段為850bp，具體序列如SEQ ID NO: 3所示。在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)測序的片段與豬偽狂犬病毒基因相似率達(dá)到98%以上(結(jié)果見表1)，證明此毒株為豬偽狂犬病毒。表I目的片段序列分析比對(duì)
序列號(hào) [SII相似
__￥_
AY683136.I SuidherpesvirusIstrainSHglycoproteingl(US7)andglycoproteingE(US8)genes, partialcds99%
AF171937.I Suidherpesvirusl(strainEa)glycoproteingE(gE)gene, completecds99%
AY249861.I PseudorabiesvirusgIycoproteingE(gE)andIIkDaprote ingenes, completecds;and28kDaproteingene, partialcds98%
AY170318.I PseudorabiesvirusstrainMin-AglycoproteinE(gE)gene, completecds98%
AF306511.I PseudorabiesvirusEaglycoproteinI(gl)gene, completecds99%
AY173124.I PseudorabiesvirusstrainLAglycoproteinE(gE)gene, completecds99%
GQ926932.I SuidherpesvirusIstrainLXB6glycoproteinEgene, completecds99%
EF552427.I SuidherpesviruslstrainGDSHglycoproteingE(gE)gene, completecds99%
所有酶和試劑盒均購自TaKaRa公司。將本實(shí)施例步驟I所得病毒液中含有的病毒命名為豬偽狂犬病毒PRV-JS株，并送中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，其微生物保藏號(hào)是CGMCC NO. 6604。3、病毒培養(yǎng)
將BHK21細(xì)胞接種至含10% FCS (胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)培養(yǎng)，當(dāng)BHK21細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)80%，去培養(yǎng)液。按感染復(fù)數(shù)為O. 005接種本實(shí)施例標(biāo)題I所得病毒液，加入維持液于37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)36-48h，顯微鏡下觀察，細(xì)胞達(dá)80%CPE (細(xì)胞病變)時(shí)，凍融收獲。連續(xù)傳代2代，收獲豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液(縮寫為PRV-JS株病毒液)。所述維持液為含有2%FBS的DMEM液(Gibco公司)。4、病毒檢測
取本實(shí)施例標(biāo)題3所得PRV-JS株病毒液進(jìn)行下述檢測
(O無菌檢驗(yàn)取PRV-JS株病毒液接種T. G小管及G. A斜面各2支，每支接種量為
O.2ml，接種后的T.G小管和G. A斜面分別取I支置37°C培養(yǎng)，其它則置于25°C培養(yǎng)，觀察3-5日。無菌生長為合格。培養(yǎng)5日后觀察均無細(xì)菌、霉菌生長，證明分離到的PRV-JS株中不含有細(xì)菌和霉菌。(2)病毒含量將PRV-JS株病毒液用DMEM液作10倍系列稀釋，取10_5、10'10_7三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種至生長良好的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，每孔接種量為
O.Iml，然后向各孔分別加入O. Iml含2% (體積濃度)小牛血清的DMEM液，同時(shí)設(shè)立DMEM液陰性對(duì)照孔，37°C下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變(CPE)，計(jì)算TCID5tlt5結(jié)果顯示該病毒的滴度為每
O.I 毫升彡 IO6-5TCID500(3)家兔致病力試驗(yàn)將PRV-JS株病毒液頸部肌肉接種家兔。接種PRV-JS株病毒的家兔36-42小時(shí)內(nèi)死亡，接種部位暴露出紅色肌肉組織，四肢呈角弓反張狀態(tài)。對(duì)照組兩只家兔健康無異常。
(4)仔豬致病力試驗(yàn)將PRV-JS株病毒液頸部肌肉注射接種2頭斷奶仔豬，接種劑量為2. O mL /頭。被攻毒斷奶仔豬分別編號(hào)為攻毒-I和攻毒_2。同時(shí)設(shè)對(duì)照組，包括兩頭斷奶仔豬，分別編號(hào)為對(duì)照-I和對(duì)照-2，均不接種。如圖3所示，攻毒后I天，被攻毒豬體溫升高，對(duì)照豬正常。觀察5日，攻毒豬精神沉郁，發(fā)抖，嘔吐、腹瀉，其中I頭豬有神經(jīng)癥狀，攻毒后第4天死亡。剖檢，腎臟有針尖大的出血點(diǎn)，腦膜充血、出血病變。分別將發(fā)病豬腦、肺、脾、腎和淋巴組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果各組織均擴(kuò)增約850bp的目的基因片段(見圖4)。實(shí)施例I結(jié)果表明分離到的毒株為豬偽狂犬病毒，接種BHK21細(xì)胞具有很高的病毒滴度，對(duì)家兔及斷奶仔豬具有很強(qiáng)的致病力。實(shí)施例2制備含滅活豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物 UBHK21細(xì)胞種子繁殖及擴(kuò)大培養(yǎng)
從液氮罐中取出凍存的BHK21細(xì)胞管，迅速置37°C水浴融化，將細(xì)胞移入裝有IOmlDMEM培養(yǎng)基的離心管中，IOOOrpm離心5分鐘。棄上清液，用生長液懸浮細(xì)胞，之后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)100%時(shí)，用O. 1%胰酶-EDTA液消化細(xì)胞。按體積比I :3傳代培養(yǎng)。所述生長液為含10%FBS (新生牛血清)的DMEM液。2、病毒培養(yǎng)
將細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)80%的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)物，去生長液。按感染復(fù)數(shù)為O. 5%接種PRV-JS株病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，37°C培養(yǎng)。當(dāng)顯微鏡下觀察到細(xì)胞達(dá)80% CPE時(shí)，收獲病毒液，連續(xù)傳代3代。當(dāng)病毒含量達(dá)到107_°TCID5(i/0. Iml為合格。3、病毒液的滅活
在病毒含量合格的病毒液中加入甲醛，使甲醛的終濃度達(dá)到O. 1% (體積濃度)，于37°C作用24小時(shí),其間每隔I小時(shí)攪拌或振搖一次,獲得滅活后的病毒液。滅活結(jié)束后置2-8°C,可保存I個(gè)月。4、滅活檢驗(yàn)
將滅活后的病毒液用DMEM液I :10稀釋后，接種生長致密的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔)，接種量為每孔O. Imlo另外每孔加入含2%小牛血清的DMEM液2ml，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔，37 °C下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變(CPE )。盲傳3代，如果無細(xì)胞病變(CPE )則表明滅活完全。5、制備含滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物
制備水相將吐溫-80與滅活病毒液按體積比4 96混合均勻，即得到水相。
油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 94混勻均勻，即得到油相。乳化將油相和水相按照體積比為3 1進(jìn)行混合并乳化，得到含滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物。乳化質(zhì)量需要達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。含滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物(簡稱為豬偽狂犬病滅活疫苗)用于預(yù)防偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。本疫苗的接種途徑是頸部肌肉注射。實(shí)施例3豬偽狂犬病滅活疫苗的安全檢驗(yàn)
檢驗(yàn)按照實(shí)施例2方法制備的豬偽狂犬病滅活疫苗的安全性。每批疫苗用偽狂犬抗體陰性的30-35日齡健康仔豬和健康懷孕母豬各5頭，每頭肌肉注射2頭份(4ml)豬偽狂犬病滅活疫苗，另設(shè)置不接種疫苗的同類型豬作對(duì)照組。
接種后觀察14天，所有試驗(yàn)豬觀察指標(biāo)包括體溫、精神、食欲等局部和全身反應(yīng)，結(jié)果見表2。通過表2可以看出所有試驗(yàn)豬精神、體溫、食欲等均未見異常。疫苗接種仔豬未見疫苗接種引起的異常反應(yīng)；疫苗接種懷孕母豬正常妊娠，無流產(chǎn)發(fā)生(每批中對(duì)照組的結(jié)果一致，所以未在表中列出)。因此該豬偽狂犬病滅活疫苗是安全的。表2滅活疫苗安全檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號(hào)是=CGMCCNO. 6604。
2.一種疫苗組合物，其特征在于包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學(xué)上可接受的佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述疫苗組合物，其特征在于該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。
4.權(quán)利要求2所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟 制備水相將吐溫-80與滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液按體積比4 96混合均勻，得到水相； 制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 :94混合均勻，得到油相； 乳化將油相和水相按照體積比為3 1混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。
5.豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預(yù)防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預(yù)防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述疾病為豬偽狂犬病毒引起的仔豬神經(jīng)癥狀、母豬繁殖障礙及種豬不育癥。
全文摘要
本發(fā)明提供豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNO.6604。本發(fā)明還提供疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學(xué)上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。本發(fā)明從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產(chǎn)毒株及檢驗(yàn)用毒種。本發(fā)明提供的疫苗組合物免疫后，豬產(chǎn)生的抗體水平較高，持續(xù)期長。采用本發(fā)明制備的疫苗組合物可用于預(yù)防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102952785SQ20121046748
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者唐波, 張道華, 張雪花, 侯繼波 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院