專利名稱：豬細小病毒、疫苗組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種豬細小病毒疫苗株及其應用。
背景技術：
豬細小病毒病是由豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)引起的繁殖障礙性疾病，以初產母豬產出死胎，畸形胎，木乃伊胎，弱仔，而母豬無明顯病狀為特征。母豬早期懷孕感染時，其胚胎，胎豬死亡率可高達80% 100%，同時還可引起仔豬的皮炎和 腹瀉。多數初產母豬受感染后可獲得堅強的免疫力，甚至可持續終生。但由于受感染豬長期帶毒排毒，使本病在豬群中長期扎根，難以清除。被感染的公豬精細胞，精索，附睪，副性腺中都可帶毒，在交配時很容易傳給易感母豬，而公豬的性欲和受精率沒有明顯影響。病毒血清學研究表明，目前PPV只有I個血清型。近年來，PPV感染呈擴大上升趨勢，并呈現出新的流行特點，給養豬業造成了巨大的經濟損失。從1986年至今，我國學者對全國很多省市進行了 PPV的流行病學調查和研究。結果表明，在全國各地均有PPV的流行。已有文獻報道的包括四川、山東、河南、河北、廣西、江西、云南和黑龍江等。本病具有很強的感染率，病毒一旦傳入，3個月內幾乎可導致豬群100%感染，并較長時間保持血清學反應陽性。豬細小病毒病的防制主要以免疫預防為主。雖然市場上有各種豬細小病毒滅活疫苗并具有一定的免疫效果，但是其安全性、免疫效力和免疫期仍不足。
發明內容
本發明的目的是提供一株豬細小疫苗株，該毒株對目前流行的豬細小病毒有很好的免疫原性。本發明的另一目的是提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物安全性好，免疫效力高，免疫期長，且該疫苗只需單次免疫，很大的降低了人力及疫苗對靶動物的副作用。本發明提供豬細小病毒PPV-JS株，其微生物保藏號是=CGMCC NO. 6605。所述豬細小病毒疫苗株的保藏信息如下
生物材料(株)=PPV-JS
分類命名豬細小病毒 拉丁文學名Porcine Parvovirus
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)
地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所 保藏日期2012年09月24日 保藏編號CGMCC NO. 6605
另外，本發明提供一種疫苗組合物，包括滅活的豬細小病毒PPV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。所述疫苗組合物的制備方法如下制備水相將吐溫-80與滅活豬細小病毒PPV-JS株病毒液按體積比4 :96混合均勻，獲得水相；
制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 :94混合均勻，獲得油相；
乳化將油相和水相按照體積比為3 1進行混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。本發明還提供豬細小病毒PPV-JS株在制備預防由豬細小病毒所致疾病藥物中的應用。本發明從南京某豬場分離的豬細小病毒毒株，篩選出豬細小病毒PPV-JS株，該PPV-JS株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種。采用本發明制備的疫苗組合物可用于預防豬細小病毒病毒引起的母豬繁殖障礙、公豬帶毒及其它豬細小病 毒病。本發明提供的疫苗組合物(豬細小病毒滅活疫苗)具有安全性好，免疫效力高，免疫期長，且該疫苗只需單次免疫，很大的降低了人力及疫苗對靶動物的副作用。
具體實施例方式實施例I豬細小病毒的分離、培養和特性測定 I.豬細小病毒的分尚
無菌采集南京某豬場初產母豬流產死胎的脾、肺等組織病料(PCR檢測豬細小病毒陽性)剪碎、研磨，用PBS緩沖液制成懸液，加入青霉素、鏈霉素各1000 IU/ml，凍融3次，經12000 r/分鐘離心5分鐘，取上清液，接種傳代的ST細胞(購自ATCC)，接種量為O. 5ml上清液/ 25cm3方瓶，37°C培養5日然后傳代，其間觀察細胞病變。第I代未出現病變，取培養物凍融3次后，傳第2代，培養，未出現病變。按照上述傳代方法，發現第3代細胞培養48小時后出現細胞病變，72小時后細胞病變達75%。將第3代細胞培養物凍融3次后，收獲病毒培養液，其病毒含量為106_5TCID5cZml為，血凝價(HA)為I :256。2.豬細小病毒鑒定
(1)引物的設計與合成
以豬細小病毒ZJ(JQ710892. I)株為模板，用Primer Premier 5. O生物軟件設計出兩條引物，用于擴增豬細小病毒NSl蛋白的全部基因，大小為1989bp。上游引物PPV-NSl-I (SEQ ID NO: I): CGCgfi^ r<XATGGCAGCGGGAAACACTTACT (斜體為BrniH I酶切位點)。下游引物PPV-NSI-2 (SEQ ID NO:2): CCG^g^TTTTATTCAAGGTTTGTTGTGGGTGC Γ斜體為Λ / /ΙΙΙ酶切位點)。
(2)病毒基因組的提取
取本實施例標題I中獲得的病毒培養液450 μ 1，與50 μ I質量濃度為10%的SDS混勻，加入12. 5μ I蛋白酶K(20 mg/ml)，置56 °C水浴30分鐘，間歇搖動；用飽和平衡酚(pH 8. O)抽提2次，12000rpm離心10分鐘，取水相加入酚/氯仿溶液(體積比為I : I)抽提I次；取水相再加入等體積的氯仿抽提I次，取上清加入其1/10體積濃度為3mol/L的乙酸鈉溶液(pH 5. 2)，加入上清2. 5倍體積的無水乙醇置_20°C沉淀2小時以上；12 OOOrpm離心15分鐘，棄上清；再用70%乙醇洗滌，靜置干燥后，用30 μ I超純水溶解，作為病毒基因組，貯存于-20°C備用。
(3)目的片段的擴增
以PPV-NS1-1、PPV-NS1-2為引物，病毒基因組為模板，進行PCR反應。PCR 反應體系10 X位Taq Buffer 緩沖液 5yl，dNTPs 4 μ I, Mg2+(25mM) 3μ I,位Taq 酶 0.25 μ I, PPV-NSl-I (20pmol/L) I μ I, PPV-NSI-2 (20pmol/L) I μ I，病毒基因組
5μ I,最后用雙蒸水補至50 μ I,瞬時離心混勻。反應程序預變性95°C 5分鐘；變性94°C I分鐘，退火56°C I分鐘，30個循環；延伸72°C 2分鐘，72°C 10分鐘。反應結束后，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，Marker DL 2000為對照。結果發現，膠條上出現了大小約為1989bp的目的片段，進行膠回收。(4)目的片段的純化
用寶生物工程(大連)有限公司的瓊脂糖回收試劑盒Agarose Gel DNA PurificationKit Ver 2. O對PCR產物進行純化步驟按試劑盒附帶說明書。將PCR產物克隆入pMD18-T載體，送金斯瑞測序公司進行序列測定。測序結果顯示序列為1989bp，具體序列如SEQ ID N0:3所示。將測序結果在NCBI進行BLAST分析，發現測序的目的片段與已發表的部分PPVNSl基因相似率達99%(如表I所示)，證明此毒株確定為豬細小病毒。表I與目的片段的比對結果
權利要求
1.豬細小病毒PPV-JS株，其微生物保藏號是=CGMCCNO. 6605。
2.一種疫苗組合物，其特征在于包括滅活的豬細小病毒PPV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。
3.權利要求2所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟 制備水相將吐溫-80與滅活豬細小病毒PPV-JS株病毒液按體積比4 :96混合均勻，獲得水相； 制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 :94混合均勻，獲得油相； 乳化按照體積比為3 1將油相和水相進行混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。
4.根據權利要求2所述疫苗組合物，其特征在于該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。
5.豬細小病毒PPV-JS株在制備預防由豬細小病毒所致疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供豬細小病毒、疫苗組合物及其應用，屬于生物技術領域。豬細小病毒PPV-JS株，其微生物保藏號是CGMCC No.6605。本發明還提供一種疫苗組合物，包括滅活的豬細小病毒PPV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。本發明還提供豬細小病毒PPV-JS株在制備預防由豬細小病毒所致疾病藥物中的應用。豬細小病毒PPV-JS株，具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種。本發明提供的疫苗組合物(豬細小病毒滅活疫苗)具有安全性好，免疫效力高，免疫期長，且該疫苗只需單次免疫，很大的降低了人力及疫苗對靶動物的副作用。
文檔編號C12R1/93GK102965345SQ20121046746
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者張雪花, 張道華, 唐波, 侯繼波 申請人:江蘇省農業科學院