專利名稱：一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是指一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術。
技術背景
實體瘤是腫瘤疾病中的主要種類，是威脅人類健康的一種重要疾病。關于實體瘤的起源，目前存在著兩種不同的模型。一種模型認為腫瘤是一種多基因功能異常的疾病。 細胞/組織在病變過程中，隨著致癌基因以及表觀遺傳基因突變的增加，細胞/組織逐漸形成癌前病變，癌變細胞/組織以及惡性癌變細胞/組織。另一類模型認為腫瘤是由腫瘤干細胞增殖分化出來的。腫瘤干細胞在腫瘤細胞/組織中的含量非常少，但卻具有類似于胚胎干細胞的自我更新的能力。腫瘤干細胞是干細胞(胚胎干細胞以及成體干細胞)發生基因以及表觀遺傳基因突變后形成的具有惡性增殖特征的一類干細胞，是腫瘤細胞化、放療失敗的重要因素。腫瘤干細胞最初在白血病患者的腫瘤細胞中被分離出來，發現該腫瘤干細胞具有表面特征抗原CD96。隨后在實體瘤中也發現并鑒定了腫瘤干細胞的存在。如在乳腺癌中存在著一種ABCG2基因高表達的細胞亞群，具有腫瘤干細胞的特征。另外還發現 ALDHl,⑶24，⑶44，⑶90，⑶133也是用來鑒定腫瘤干細胞常用的一些生物標志物分子。腫瘤干細胞的分離主要是從新鮮的腫瘤組織中分離。分離方法主要是通過流式細胞分選技術以及免疫磁珠的方法進行。采用流式細胞分選方法獲得的腫瘤干細胞純度較高，可達95%以上，但分選過程會對細胞有較大的損傷，磁珠分選方法雖然條件比較溫和，但是分選的干細胞純度較低，達到80%就是一個比較好的分離結果了。上述兩種方法面臨的一個共同問題就是分離干細胞需要使用高質量的單克隆抗體，分離成本非常高。另外分離出的腫瘤干細胞如何擴增而不失去或改變其干細胞的特征仍然是一個當前沒有解決的一個技術瓶徑，是制約腫瘤干細胞研究和發展新的腫瘤治療技術的技術障礙。發明內容
本發明提出一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，解決了現有技術中分離干細胞需要使用高質量的單克隆抗體，分離成本非常高，分離出的腫瘤干細胞擴增卻失去或改變其干細胞的特征的問題。
本發明的技術方案是這樣實現的一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，在實體腫瘤細胞的培養中，以改性干細胞培養基進行腫瘤細胞的貼壁培養，腫瘤干細胞可以逐漸形成集落。
作為優選的技術方案，所述改性干細胞培養基按體積比包括70 100%的DMEM/ F12 和 O 30% 的 RPMI-1640ο
作為對上述技術方案的改進，所述改性干細胞培養基中還含有O lyg/ml的 EGF,O I μ g/ml 的 FGF_b、0 I μ g/ml 的 IGF、O I μ g/ml 的 PDGF、0 I μ g/ml 的 SCF、 O 1μ g/ml 的 TGF-β、 I μ g/ml 的 LIF、0 300ηΜ 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、 O ImM的PD0325901和O ImM的Υ27632，能有效篩選腫瘤干細胞，通過抑制GSK信號通路和酪氨酸激酶抑制劑達到有效抑制干細胞分化，提高血液腫瘤干細胞篩選的效率。
作為另一優選的技術方案，所述改性干細胞培養基按體積比包括O 30%的DMEM 基礎培養基和70 100%的胚胎干細胞培養基HEScGRO。
作為對上述技術方案的改進，所述改性干細胞培養基中還含有O 1μ g/ml的 TGF-β、 I μ g/ml 的 SCF、0 I μ g/ml 的 bFGF、0 I μ g/ml 的 EGF、0 500nM 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、0 ImM 的 PD184352、0 ImM的 PD0325901 和O ΙΟΟμΜ 的Υ27632，能有效篩選腫瘤干細胞，通過抑制GSK信號通路和酪氨酸激酶抑制劑達到有效抑制干細胞分化，提高血液腫瘤干細胞篩選的效率。
由于采用了上述技術方案，一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，在實體腫瘤細胞的培養中，以改性干細胞培養基進行腫瘤細胞的貼壁培養，腫瘤干細胞可以逐漸形成集落，該集落具有腫瘤干細胞的特征，，解決了現有技術中分離干細胞需要使用高質量的單克隆抗體，分離成本非常高，分離出的腫瘤干細胞擴增卻失去或改變其干細胞的特征的問題。
下面結合具體實例進一步說明本發明
實例I人乳腺癌MCF-7腫瘤干細胞的克隆培養與擴增
人乳腺癌MCF-7購自美國細胞庫ATCC，細胞培養使用含10%胎牛血清(ΡΑΑ， FCS500)的DMEM培養基(北京鈕因華信科技有限公司，DM10140021)，在Coring公司生產的T-25細胞培養瓶中培養，培養條件為37° C，5%C02。細胞每兩天傳代一次。在進行 MCF-7的干細胞克隆培養時，首先將在細胞培養皿中培養至90%的交匯度的細胞用胰酶消化，經生理鹽水洗滌后，更換干細胞培養基(配方見表1，其中胚胎干細胞培養基HEScGRO 購自美國Millipore公司，貨號SCM02Q-100;CHIR99021購自美國stemgent公司，貨號 04-0004;PD0325901 購自美國 stemgent 公司，貨號04-0006;Y27632,購自美國 stemgent 公司，貨號04-0012)重新懸浮MCF-7細胞，并以每孔5_10萬個接種到24孔板的一個培養孔中，細胞繼續培養，培養I天后發現有少量細胞增殖，其中的某些細胞呈不完整的球形結構生長，培養至第3天，細胞進一步增殖，呈球形的細胞圖進一步增大，至14天時能呈球形生長的細胞進一步增殖，而不能呈球形增殖的細胞逐漸死亡，見圖I。該細胞克隆經胰酶消化后，能夠在所用的干細胞培養基配方I中繼續生長，并形成球型的細胞克隆。該細胞克隆具有腫瘤干細胞的特征，是一種MCF-7干細胞。
表I、配方I :乳腺癌腫瘤干細胞的篩選、擴增用培養基配方
權利要求
1.一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，其特征在于在實體腫瘤細胞的培養中，以改性干細胞培養基進行腫瘤細胞的貼壁培養，腫瘤干細胞可以逐漸形成集落。
2.如權利要求I所述的一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，其特征在于所述改性干細胞培養基按體積比包括70 100%的DMEM/F12和O 30%的RPMI-1640。
3.如權利要求2所述的一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，其特征在于所述改性干細胞培養基中還含有O I μ g/ml的EGF、0 I μ g/ml的FGF_b、0 I μ g/ml的 IGF、0 I μ g/ml 的 PDGF、0 I μ g/ml 的 SCF、0 I μ g/ml 的 TGF-β、0 I μ g/ml 的 LIF、0 300nM 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、0 ImM 的 PD0325901 和 O ImM 的 Y27632。
4.如權利要求I所述的一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，其特征在于所述改性干細胞培養基按體積比包括O 30%的DMEM基礎培養基和70 100%的胚胎干細胞培養基HEScGRO。
5.如權利要求4所述的一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，其特征在于所述改性干細胞培養基中還含有O I μ g/ml的TGF-β、0 I μ g/ml的SCF、0 I μ g/ml 的 bFGF、0 I μ g/ml 的 EGF、0 500nM 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、0 ImM 的 PD184352、0 ImM 的 PD0325901 和 O 100 μ M 的 Υ27632。
全文摘要
本發明提出了一種富集和無分化擴增貼壁干細胞的技術，在實體腫瘤細胞的培養中，以改性干細胞培養基進行腫瘤細胞的貼壁培養，腫瘤干細胞可以逐漸形成集落，該集落具有腫瘤干細胞的特征，解決了現有技術中分離干細胞需要使用高質量的單克隆抗體，分離成本非常高，分離出的腫瘤干細胞擴增卻失去或改變其干細胞的特征的問題。
文檔編號C12N5/095GK102978163SQ20121046641
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月17日 優先權日2012年11月17日
發明者殷勤偉, 黃兵 申請人:黃兵