專利名稱：一種金針菇、靈芝混菌發酵的方法
技術領域：
本發明涉及一種混菌發酵的方法，具體涉及一種金針菇、靈芝混菌發酵的方法。
背景技術：
金M鬼QFIammuIina被稱為“增智燕”,含有18種氨基酸,包括8種人體必需的氣基酸，富含鋒、I丐、憐、鐵等多種礦物質，有促進人體智力、生長發育、提聞機體免疫能力的作用，尤其在增強機體對運動負荷的適應能力、抗疲勞、消除疲勞等方面的作用強于蘑菇、香菇、木耳等食用菌。靈芝(fefloofe/ma含有多糖、三職類化合物、多肽等十多種有效成分。靈芝不同于一般藥物對某種疾病而起治療作用，亦不同于一般營養保健食品只對某一方面營養素的不足進行補充和強化，而是在整體上雙向調節人體機能平衡，調節人體新陳代謝機能，提高自身免疫能力和耐缺氧能力，促使內臟或器官機能正常化。人工栽培金針菇、靈芝由于子實體生長周期長，受季節和原材料的限制，產量低，不能滿足需要，目前研究主要集中在分別對金針菇、靈芝進行深層發酵工藝及活性物質功能上，但在發酵過程中普遍使用一些生化物質作為其發酵的培養基組分，這不僅造成培養基價格較貴，同時發酵后產物利用方面還存在安全性問題。混菌發酵是指采用兩種或多種微生物的協同作用共同完成某發酵過程的一種新型發酵技術，是純種發酵技術的新發展，也是一種不需要進行復雜的DNA體外重組卻可取得類似效果的新型發酵技術，可提高發酵效率甚至可形成新產品。上海師范大學王淑珍曾用靈芝、松茸混菌發酵，發現混菌發酵后，由于活性物質間的協同、增效、互補，及新產生的活性物質，其生理功能效果優于原來的單菌發酵產物。目前真菌混菌發酵技術及其相關產品尚有待于進一步研究。
發明內容
本發明的目的是要提供一種能促進、提高和改變發酵液中活性產物質量的金針燕、靈芝混菌發酵方法。本發明的目的是這樣實現的該混菌發酵方法為混菌發酵培養基由雙糖、多糖、淀粉類糧食、蛋白質類糧食組成，所述的混菌發酵培養基包括l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、l 10g/L黃豆；采用液體深層發酵技術，混菌培養金針菇和靈芝；以金針菇和靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體發酵培養制備單菌發酵種子液，混合接種金針菇、靈芝于混菌發酵培養基，接種比例I:廣3:1，溫度22^26°C,pH 4. 5^5. 5，培養時間是12(T240h，混菌發酵后的菌絲和發酵液可用于發酵產物生物量、多糖及三萜類化合物的提取與測定。具體步驟如下
(I)配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基按照GB4789. 15-2010《食品衛生微生物學檢驗霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存；(2)菌種活化取金針菇No.5. 65菌株和靈芝No. 5. 786菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化廣2次；
(3)分別制備單菌發酵種子液取金針菇、靈芝活化后的菌塊分別接種于液體培養基中，22 26 °C發酵培養168 288h ；
(4)配制混菌發酵培養基馬鈴薯去皮后切成約Icm3小塊，玉米、黃豆粉碎至顆粒大小為100 μ m,培養基組成為l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、riOg/L黃豆，加水配制；先將馬鈴薯、玉米、黃豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，加水定容后滅菌；
(5)制備混菌發酵種子液取金針菇、靈芝單菌發酵種子液,接種于混菌發酵培養基中，培養液酸堿度pH 4. 5 5. 5，接種量配比為I: Γ3: 1，共計5%，22 26°C發酵培養144 240h ；
(6)分離生物量發酵液過濾收集菌絲，60°C烘干至質量恒定并稱質量；
(7)胞外粗多糖提取與測定發酵液過濾后離心取上清液，8(T90°C水浴濃縮成原體積的O. 2^0. 25倍，加入4飛倍體積95%乙醇，4°C靜置，濃縮液離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞外粗多糖；
(8)胞內三萜類化合物的提取取Ig菌絲加50 mL甲醇靜置過夜后過濾，蒸干后加4mL 95%乙醇溶解；
(9)胞外三萜類化合物的提取取發酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。有益效果，由于采用上述方案，使用的混菌發酵培養基組成均為糧食作物，培養基包括馬鈴薯、玉米、黃豆粉、淀粉和蔗糖，現有技術中的混菌發酵培養基均使用化學試劑，糧食培養基較化學試劑培養基的營養成分更全面，更有利于獲得綠色、天然、安全的活性產物及功能性產品；促進、提高和改變了發酵液中活性產物質量，達到了本發明的目的。優點
(1)本發明首次實現了金針菇、靈芝菌絲體的混菌發酵培養；
(2)培養基配方天然，使用方便在本發明的混菌發酵培養基中，使用的均為天然糧食作物，無化學試劑，配制方便、簡單，而且通常在發酵過程中，不必對PH值進行調節；
(3)通過金針菇、靈芝混菌發酵，與金針菇、靈芝單菌發酵相比，胞外多糖、三萜類化合物產量均得以8% 35%的提高。通過混菌發酵，與較單菌發酵相比，促進、提高和改變了發酵液中活性產物質量。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明
實施例I:
I、菌種
金針燕iFlanmiulina veIutipes):購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號
為 5. 65 ;
艮HGanoderma購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號為5. 786,經
誘變選育后，產多糖能力得以一定程度的提高。2、培養基混菌發酵培養基所需原料包括蔗糖、淀粉、馬鈴薯、玉米、黃豆，購自超市，馬鈴薯去皮后切成約Icm3小塊，玉米、黃豆粉碎至顆粒大小為100 μ m。組成為l(T20g/L蔗糖、l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T30g/L玉米、flOg/L黃豆，回水配制；先將馬鈴薯、玉米、黃豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，用水定容后滅菌。金針菇、靈芝混菌發酵培養和發酵產物的提取與測定
混菌發酵方法為混菌發酵培養基由雙糖、多糖、淀粉類糧食、蛋白質類糧食組成，采用液體深層發酵技術，混菌培養金針菇和靈芝；以金針菇和靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體發酵培養制備單菌發酵種子液，混合接種金針菇、靈芝于混菌發酵培養基，接種比例1:1 3:1，溫度22 261，pH 4. 5 5. 5，培養時間是120 240h，混菌發酵后的菌絲和發酵液可用于發酵產物生物量、多糖及三萜類化合物的提取與測定。所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基為在實驗室中被廣泛采用的培養基，所述的混菌發酵培養基即糧食培養基。 I、發酵工藝(培養瓶培養)
將金針菇No. 5. 65菌株和靈芝No. 5. 786菌株在24 28°C下保溫培養活化菌種6 9天，取活化后的菌塊接種于液體培養基中，25°C搖床培養7天，制備得金針菇、靈芝單菌發酵種子液，所述的液體培養基是實驗室中用于培養金針菇、靈芝的普通液體培養基；按照接種量I: f 3:1接種于320mL混菌發酵培養基500mL搖瓶中，25°C搖床培養192h，發酵液過濾后，菌絲烘干至恒重得生物量，結果如下。生物積累量(干g/100mL):金針燕4 6 ;靈芝3 5 ;混菌4 6。結果表明，采用上述含有不同濃度的玉米、黃豆混菌發酵培養基均能成功的進行金針菇、靈芝混菌發酵。2、發酵工藝(IOL發酵罐培養)
取金針菇、靈芝單菌發酵種子液，分別接種于含有混菌發酵培養基的IOL發酵罐中進行發酵，混菌接種時接種量配比為1:廣3:1，共計5%，pH 4. 5 5.5 ;溫度24 °C ;時間14ri68h0發酵液過濾后，菌絲烘干至恒重得生物量，結果如下。生物積累量(干g/100mL):金針菇5· 5 6. 5 ;靈芝4 5 ;混菌5 6。結果表明，在上述混菌發酵培養基條件下，均能進行金針菇、靈芝單菌和混菌發酵罐培養，且培養時間較培養瓶培養有所縮短。3、胞外多糖的提取
發酵液過濾后4000r/min離心取上清液，80°C水浴濃縮成原體積的O. 2倍，加入5倍體積95%乙醇，4°C靜置12h，濃縮液4000r/min離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，70°C烘干至恒重，得胞外粗多糖。4、胞內三萜類化合物的提取
取I g菌絲加50 mL甲醇靜置12h后過濾，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解。5、胞外三萜類化合物的提取
取發酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，力口4mL 95%乙醇溶解。6、活性成分積累
(I)胞外多糖的積累胞外多糖(g/L):金針菇37 39 ;靈芝:27 29 ;混菌:41 43。結果表明，混菌發酵胞外多糖含量比金針菇、靈芝單菌發酵均得以提高。(2)三萜類化合物的積累
胞內三萜產量(X10-2 mg/g):金針菇64 68 ;靈芝:72 78 ;混菌:86 90。胞外三萜產量(X 10_2 g/L):金針菇66 70 ;靈芝71 74 ;混菌80 84。 結果表明，混菌發酵后胞內、胞外三萜產量比金針菇、靈芝單菌發酵均得以提高。上述結果表明，采用混菌發酵培養基進行金針菇、靈芝混菌發酵后，胞外多糖、三萜類化合物均得以8% 35%的提高。
權利要求
1.一種金針菇、靈芝混菌發酵的方法，其特征是該混菌發酵方法為混菌發酵培養基由雙糖、多糖、淀粉類糧食、蛋白質類糧食組成，所述的混菌發酵培養基包括l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、l 10g/L黃豆；采用液體深層發酵技術，混菌培養金針菇和靈芝；以金針菇和靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體發酵培養制備單菌發酵種子液，混合接種金針菇、靈芝于混菌發酵培養基，接種比例I: I 3:1，溫度22 26°C，pH 4. 5 5. 5，培養時間是120 240h，混菌發酵后的菌絲和發酵液可用于發酵產物生物量、多糖及三萜類化合物的提取與測定； 具體步驟如下 (1)配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基按照GB4789.15-2010《食品衛生微生物學檢驗霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存； (2)菌種活化取金針菇No.5. 65菌株和靈芝No. 5. 786菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化廣2次； (3)分別制備單菌發酵種子液取金針菇、靈芝活化后的菌塊分別接種于液體培養基中，22 26 °C發酵培養168 288h ； (4)配制混菌發酵培養基馬鈴薯去皮后切成約Icm3小塊，玉米、黃豆粉碎至顆粒大小為100 μ m,培養基組成為l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、riOg/L黃豆，加水配制；先將馬鈴薯、玉米、黃豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，加水定容后滅菌； (5)制備混菌發酵種子液取金針菇、靈芝單菌發酵種子液,接種于混菌發酵培養基中，共酵培養液酸堿度PH 4. 5 5. 5，接種量配比為I: f 3:1，共計5%，22 26 °C發酵培養144 240h ； (6)分離生物量發酵液過濾收集菌絲，60°C烘干至質量恒定并稱質量； (7)胞外粗多糖提取與測定發酵液過濾后離心取上清液，8(T90°C水浴濃縮成原體積的O. 2^0. 25倍，加入4飛倍體積95%乙醇，4°C靜置，濃縮液離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞外粗多糖； (8)胞內三萜類化合物的提取取Ig菌絲加50 mL甲醇靜置過夜后過濾，蒸干后加4mL 95%乙醇溶解； (9)胞外三萜類化合物的提取取發酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。
全文摘要
本發明涉及一種金針菇、靈芝混菌發酵的方法，方法步驟(1)分別制備金針菇、靈芝的發酵種子液；(2)制備混菌發酵培養基，該培養基由蔗糖、淀粉、馬鈴薯、玉米、黃豆組成；(3)將步驟(1)中制得的金針菇、靈芝發酵種子液共同接種于混菌發酵培養基中進行混菌深層培養，進而獲得多糖、三萜類化合物等活性產物。優點(1)實現了金針菇、靈芝菌絲體的混菌發酵培養；(2)培養基配方天然，使用方便在混菌發酵培養基中，使用的均為天然糧食作物，無化學試劑，配制方便、簡單，而且通常在發酵過程中，不必對pH值進行調節；(3)通過金針菇、靈芝混菌發酵，與金針菇、靈芝單菌發酵相比，胞外多糖、三萜類化合物產量均得以8%~35%的提高。
文檔編號C12P39/00GK102925527SQ20121045581
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者董玉瑋, 劉全德, 苗敬芝, 李勇, 劉輝, 張靜 申請人:徐州工程學院