專利名稱：微生物菌群結構的快速定性與定量方法及其在中國白酒生產中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于微生物在特殊鑒別培養基上的特殊菌落形態來對微生物菌群結構的快速定性與定量方法，以及利用該方法在各種釀造食品中分析微生物菌群結構及其演變規律的應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
白酒行業是我國優勢民族傳統的制造業，是食品工業的重要組成部分。2011年白酒制造業產量達1025. 55萬千升，工業產值3831. 27億元，比2010年同比增長41. 40%。因此白酒行業的發展對于我國食品行業甚至國民經濟的發展都具有重要的意義。然而，我國白酒制造業由于釀造機理缺乏，在釀造工業技術水平上卻與國際蒸餾酒和釀造酒工業存在著明顯的差距。因此，只有科學地認識白酒釀造的生物學過程，才能對其進行現代化改造，提高我國白酒生產技術水平。白酒釀造微生物是白酒釀造的關鍵因素。因此，認識白酒釀造微生物的發酵過程是認識白酒釀造機制的重要基礎。但是中國白酒屬于復雜的多微生物自然釀造過程，是多種微生物共同作用的結果，包括酵母、細菌和霉菌等。因此，認識釀造微生物菌群結構是解析白酒釀造機制的關鍵。目前，對于微生物菌群結構的研究，已經從以前的傳統分離技術轉向未培養技術分析，并取得了一定的進展。但是我國白酒釀造微生物的研究發展比較緩慢，上述兩種分離技術仍存在著自身的缺陷對于傳統分離培養技術，只能對微生物總量進行分析，無法明確各類微生物的數量及其變化；對于未培養手段，也存在一定的問題，例如較難區分活菌和死菌，無法同時對微生物種屬進行定性與定量，而且該技術儀器要求高，且費時、費力、費資。由于上述固有的缺陷，對釀造微生物菌群結構的認識仍然較為片面，無法系統、全面的認識整個微生物菌群的發酵特征。本發明公開了一種針對中國白酒群體微生物發酵特征的微生物菌群快速同時定性與定量方法，該技術基于微生物菌落形態特征與種屬的對應關系，能夠經濟、快速的對白酒釀造過程中各種細菌、酵母及霉菌的發酵特征進行同時定性與定量分析。基于該技術，可對白酒釀造過程微生物菌群結構及其演變規律進行系統的解析，為進一步對醬香型白酒功能微生物的開發與應用，以及提升白酒的品質奠定了基礎。
發明內容
要解決的技術問題
本發明要解決的一個技術問題建立了復雜的微生物群體發酵系統中微生物群體演變規律解析的快速定性與定量分析技術。本發明要解決的一個技術問題是提供了白酒釀造過程中復雜微生物菌群結構及其演變規律分析的方法。本發明的技術方案微生物菌群結構的快速定性與定量方法及其在中國白酒生產中的應用，其對混合微生物發酵系統中酵母、細菌、霉菌的菌群結構及其演變規律進行定性與定量的分析。分析微生物菌群結構的方法
所述分析的微生物菌群結構為多微生物發酵系統的菌落結構，將樣品與無菌水混合后，樣品為大曲、小曲、酒醅、環境或其它發酵原料。稀釋涂布鑒別培養基培養
Ca)酵母鑒別培養基(g/L):葡萄糖20 80 ;酵母膏5 10 ;蛋白胨5 10 ;氯化鉀0. I O. 5 ;氯化錳0. 001 O. 01 ;氯化鈣0. I O. 5 ;硫酸鎂0. I O. 5 ;硫酸鐵O. 001 O. 01 ;硫酸銅0· 02 O. 05 ;百里酚藍0.01 I ;溴甲酚綠0.01 I ;瓊脂15 20 ；4 30°C培養2 6天；
(b)細菌鑒別培養基(g/L):牛肉膏5 10;酵母膏10 20 ;蛋白胨10 30 ;氯化鈉5 10 ;硫酸鐵0. 001 O. 01 ;氯化錳0. 001 O. 01 ;瓊脂15 20 ;溴甲酚紫O. 01 O. 5 ；25 37°C培養I 3天；
(c)霉菌鑒別培養基(g/L):牛肉膏5 10;蛋白胨5 10 ;葡萄糖10 50 ;硫酸鎂
O.5 I. O ;硫酸錳0. 001 O. 01 ;孟加拉紅0. 01 O. 5 ;溴酚紅0. 01 O. 5 ;氯霉素
O.01 O. 5 ;瓊脂15 20 ；25 35°C培養2 5天。分析微生物菌群結構的方法，包括如下鑒別步驟
(I)建立酵母、細菌、霉菌三類微生物的種屬與其在鑒別培養基上的特殊菌落形態之間的對應關系。微生物種屬鑒別方法如下對鑒別培養基上具有不同菌落形態的微生物，采用分子方法對酵母、細菌、霉菌三類微生物進行種屬鑒定，其中，對酵母26srDNA序列，細菌16srDNA序列，霉菌18srDNA序列進行測序并與數據庫比對，建立鑒定微生物的種屬的對應關系。(2)通過微生物在鑒別培養基上的形態來鑒別微生物的種屬；
細菌類.,Bacillus Iicheniformis 如圖 I 中 BI 形態，
Bacillus amyloli quefaci ens 如圖 I 中 B2 形態，
Bacillus subtil is 如圖 I 中 B3 形態，
Staphylococcus saprophyti cus 如圖 I 中 B4 形態，
Bacillus cereus 如圖 I 中 B5 形態，
PaenibadIlus Iactis 如圖 I 中 B6 形態，
PaenibadIlus cineris 如圖 I 中 B7 形態，
BreVibadIlus borstelensis 如圖 I 中 B8 形態；
Bacillus tequilensis 如圖 I 中 B9 形態，
Staphylococcus Ientus 如圖 I 中 BlO 形態，
Bacillus marisflavi 如圖 I 中 Bll 形態，
Bacillus oIeronius 如圖 I 中 Β12 形態；
酵母類 ',SBcchaTomyces cerevisiae 如圖 2 中 Yl 形態，
Pichia membranifaciens 如圖 2 中 Y2 形態，
Zygosaccharomyces bailii 如圖 2 中 Y3 形態，
Rhodotorula muciIaginosa 如圖 2 中 Y4 形態，Schizosaccharomyces pombe 如圖 2 中 Y5 形態，
Issatchenkia oriental is 如圖 2 中 Y6 形態；
Geotrichum candidum 如圖 2 中 Y7 形態，
Pichia anomala 如圖 2 中 Y8 形態，
Pichia manshurica 如圖 2 中 Y9 形態；
霉菌類..Rhizopus microsporus 如圖 3 中 Fl 形態，
Aspergillus fumigatus 如圖 3 中 F2 形態， paecilomyces varioti 如圖 3 中 F3 形態，
Aspergillus fIavus 如圖 3 中 F4 形態；
Aspergillus oryzae 如圖 3 中 F5 形態，
Aspergillus niger 如圖 3 中 F6 形態；
(3)并通過對特定菌落形態微生物的計數來對不同類微生物進行定量分析。分析微生物菌群結構的方法中微生物菌群結構為多微生物發酵系統的菌落結構，多微生物發酵系統優選為釀造食品的發酵系統。釀造食品選自白酒、黃酒、醬油、醋，或除白酒、黃酒、醬油、醋以外的其它發酵生產的調味料。分析微生物菌群結構的方法在獲得發酵過程中不同類微生物菌群結構的演變規律的應用，為分析多微生物發酵系統發酵過程中不同時間點微生物菌群結構，從而獲得發酵過程中不同類微生物菌群結構的演變規律。本發明的有益效果本發明公開了一種針對中國白酒群體微生物發酵特征的微生物菌群快速同時定性與定量方法，該技術基于微生物菌落形態特征與種屬的對應關系，能夠經濟、快速、準確的對白酒釀造過程中各種細菌、酵母及霉菌的發酵特征進行定性與定量分析。基于該技術，可對白酒釀造過程微生物菌群結構及其演變規律進行了系統的解析，為進一步白酒釀造機制的解析，以及提升白酒的品質奠定了基礎。
圖I醬香型白酒發酵初期酒醅中不同細菌的菌落形態，BacillusIicheniformis ；Β2Λ Bacillus amyIoliquefaciens ；Β3Λ Bacillus subtilis ;B4、Staphylococcus saprophyti cus ；Β5Λ Bacillus cereus ；Β6Λ Paenibacillus lactis ;B7、PaenibadIlus cineris ；Β8Λ Brevibacillus borstelensis ；Β9Λ Bacillus tequilensis ；B10 λ Staphylococcus lentus .》\\、Bacillus marisflavi ；^12 ^Baci 11 us oleronius。圖2濃香型白酒大曲中不同酵母的菌落形態，Yl、Saccharomyces cerevisiae ；Υ2λ Pichia membrani faci ens ；Υ3Λ Zygosaccharomyces bailii 'W、Rhodotorulamucilaginosa ;Υ5、Schizosaccharomyces pombe ;Υ6、Issatchenkia orientails ;Υ7、Geotrichum candidum ；Υ8^PicAia anomala {HPichia manshurica。
圖3清香型白酒發酵初期酒醅中不同霉菌的菌落形態，Fl、Rhizopusmicrosporus 次2、Aspergillus fumigatus ；F3Λ paecilomyces varioti ；Ρ4Λ AspergillusfIavus ；F5λAspergiIlus oryzae ；F6ΛAspergiIlus niger。圖4醬香型白酒堆積過程細菌菌群結構的演變規律。IBacillus subtilis ；□ PaenibadIlus lactis ； Pseudomonas stutzeri ； Bacillus oleronius ；Staphylococcus saprophyti cus ； Bacillus marisflavi ； Bacillus licheniformis ；☆細菌總數。
具體實施例方式實施例I :醬香型白酒發酵初期酒醅中細菌的菌群結構
對醬香型白酒發酵初期酒醅中的細菌菌群結構進行分析，將酒醅與無菌水混合后，稀釋涂布至細菌鑒別培養基培養。細菌鑒別培養基(g/L):牛肉膏5 ;酵母膏20 ;蛋白胨10 ；氯化鈉5 ;硫酸鐵0. 001 ;氯化錳0. 01 ;瓊脂20 ;溴甲酚紫0. 5。25°C培養3天。對獲得的不同形態細菌進行菌種分類鑒定，建立細菌菌落形態與菌種的對應關系。細菌菌落形態如附圖I所示，菌群結構如表I所示。表I醬香型白酒發酵初期酒醅中細菌菌群結構
權利要求
1.一種分析微生物菌群結構的方法，其特征在于，所述分析的微生物菌群結構為多微生物發酵系統的菌落結構，將樣品與無菌水混合后，稀釋涂布鑒別培養基培養 (a)酵母鑒別培養基中含以g/L計葡萄糖20 80;酵母膏5 10 ;蛋白胨5 10 ;氯化鉀0. I O. 5 ;氯化錳0. 001 O. 01 ;氯化鈣0. I O. 5 ;硫酸鎂0. I O. 5 ;硫酸鐵0. 001 O. 01 ;硫酸銅0. 02 O. 05 ;百里酚藍0. 01 I ;溴甲酚綠0. 01 I ;瓊脂·15 20 ;4 3(TC培養2 6天； (b)細菌鑒別培養基中含以g/L計牛肉膏5 10;酵母膏10 20 ;蛋白胨10 ·30 ;氯化鈉5 10 ;硫酸鐵0. 001 O. 01 ;氯化錳0. 001 O. 01 ;瓊脂15 20 ;溴甲酚紫0. 01 O. 5 ；25 37°C培養I 3天； (c)霉菌鑒別培養基中含以g/L計牛肉膏5 10;蛋白胨5 10 ;葡萄糖10 50 ;硫酸鎂0. 5 I. O ;硫酸錳0. 001 O. 01 ;孟加拉紅0. 01 O. 5 ;溴酚紅0. 01 O. 5 ;氯霉素o. 01 O. 5 ;瓊脂15 20 ；25 35°C培養2 5天； 包括如下鑒別步驟 (1)釆用分子方法對酵母、細菌、霉菌三類微生物進行種屬鑒定，其中，對酵母26srDNA序列，細菌16sri)NA序列，霉菌ISsrDNA序列進行測序并與數據庫比對，建立鑒定微生物的種屬的對應關系； (2)通過微生物在鑒別培養基上的形態來鑒別微生物的種屬； 細菌類 ',Bacillus Iicheniformis 如圖 I 中 BI 形態， Bacillus amyloliquefaciens 如圖 I 中 B2 形態，Bacillus subtil is 如圖 I 中 B3 形態， Staphylococcus saprophyticus 如圖 I 中 B4 形態， Bacillus cereus 如圖 I 中 B5 形態， PaenibadIlus 7況如圖 I 中 B6 形態， PaenibadIlus如圖 I 中 B7 形態， BreVibadIlus如圖 I 中 B8 形態； Bacillus tequilensis 如圖 I 中 B9 形態， Staphylococcus Ientus 如圖 I 中 BlO 形態， Bacillus marisflavi 如圖 I 中 Bll 形態， Bacillus oIeronius 如圖 I 中 Β12 形態； 酵母類·,Sacclmromyces are如圖 2 中 Yl 形態，Pichia meinbranifaciens%\\^ 2 中 Y2 形態， Zygosaccharomyces bailii 如圖 2 中 Y3 形態， Rhodotorula muciIaginosa^A風 2 中 Y4 形態， Schizosaccharomyces夕傭知如圖2中Y5形態， Issatchenkia如圖 2 中 Y6 形態； Geotrichum應如圖 2 中 Y7 形態， Pichia 艦7a如圖2中Y8形態， Pichia manshurica 如圖 2 中 Y9 形態； 霉菌類 ',Rhizopus如圖 3 中 Fl 形態，Aspergillus fumigatus 如圖 3 中 F2 形態， paecilomyces varioti 如圖 3 中 F3 形態， Aspergillus fIavus 如圖 3 中 F4 形態； Aspergillus oryzae 如圖 3 中 F5 形態， Aspergillus niger 如圖 3 中 F6 形態； (3 )并通過對特定菌落形態微生物的計數來對不同類微生物進行定量分析。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述多微生物發酵系統優選為釀造食品的發酵系統。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于釀造食品選自白酒、黃酒、醬油、醋，或除·白酒、黃酒、醬油、醋以外的其它發酵生產的調味料。·
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的樣品為大曲、小曲、酒醅、環境或其它發酵原料。
5.權利要求1-4任一項所述的方法的應用，其特征在于獲得發酵過程中不同類微生物菌群結構的演變規律。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于分析多微生物發酵系統發酵過程中不同時間點微生物菌群結構，從而獲得發酵過程中不同類微生物菌群結構的演變規律。
全文摘要
本發明涉及一種微生物菌群結構的快速定性與定量方法及其在中國白酒生產中的應用，屬于生物工程技術領域。本發明公開了針對于酵母、細菌、霉菌的分離鑒別培養基，并通過酵母、細菌、霉菌在鑒別培養基上的特殊菌落形態來對微生物進行定性分析，通過對特定菌落形態微生物的計數來對不同類微生物進行定量分析，本微生物菌群結構的快速定性與定量方法可分析混合微生物發酵系統中酵母、細菌、霉菌這三類微生物的群落結構及其演變規律。本發明可用于各種食品釀造微生物的混合發酵系統中微生物菌群結構的分析。
文檔編號C12Q1/68GK102911998SQ20121045554
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者徐巖, 吳群 申請人:江南大學