專利名稱：鹵醇脫鹵酶、編碼基因、載體、菌株及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，產鹵醇脫鹵酶的新菌株，以及其在制備環氧氯丙烷和(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。背景技術：
鹵醇脫鹵酶，也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內親核取代機制催化芳香族或者脂肪族鄰鹵醇轉化為環氧化物和鹵化氫，是微生物降解有機鹵化合物的關鍵酶之一。根據其序列同源性分為HheA、HheB、HheC 3類。有機鹵化合物已成為當今重要環境污染物之一，主要是由于排廢以及人工合成鹵化物的廣泛應用造成的。在自然界中，大部分異生質鹵化物自降解能力很差，同時許多化合物被疑是致癌或高誘變物質。因此，應用微生物和脫鹵酶降解有機鹵化物已引起人們廣泛的關注，在環境污染治理，特別是手性環氧化物合成方面等具有十分重要的作用。
鹵醇脫鹵酶主要通過蛋白結構中保守的絲氨酸與底物羥基氧原子之間形成氫鍵， 穩定與底物結合，通過精氨酸降低絡氨酸的PKa值，酪氨酸從底物上的氧原子作為親核試劑，進攻鄰位鹵素取代的碳原子，進而釋放鹵離子，形成環氧化物。鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳-鹵鍵的斷裂進行脫鹵反應，可以高選擇性地催化接受除了鹵離子以外的一系列非自然親核試劑，如N3_、NO2' CN—等所介導的環氧化物開環反應，用以生成一系列光學純的 β_取代醇。因此可以用來合成一些非自然手性化合物。
鹵醇脫鹵酶可以廣泛應用于環氧化物以及取代醇。其中疊氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體；手性氨基醇在生物制藥領域是一類很重要的化合物，可用來合成多種生物活性物質。異硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在農用化學試劑、醫藥和高分子化學領域中有著廣泛應用。
近年，已從多種微生物中發現了齒醇脫齒酶，如Agrobacterium radiobacter ADl，Agrobacter sp. AD2，Corynebacterium sp. N—1074，Agrobacterium tumefaciens， Arthrobacter erithii HlOa, Alcaligenes sp. DS—K—S38 ， Pseudomonas sp. DS_k_2DI 等。部分鹵醇脫鹵酶的基因已被克隆并在大腸桿菌中表達，獲得產酶活力較高的基因工程菌，并應用于催化形成環氧化合物及β-取代醇。但是對已有鹵醇脫鹵酶進行研究的同時， 挖掘新的的微生物來源的鹵醇脫鹵酶基因仍是今后研究的熱點。
發明內容
本發明目的是提供一種源自壤霉菌(Agromyces sp.)的鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，以及其在制備環氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。
本發明采用的技術方案是
一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本發明還涉及編碼所述鹵醇脫鹵酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO :1所/Jn ο
該鹵醇脫鹵酶基因由如下方法得到利用硫酸銨沉淀和離子交換等分離純化手段從壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中分離純化得到脫鹵酶蛋白，經過N 端序列測序和肽指紋圖譜分析，發現該酶與Arthrobacter sp. AD2和Corynebacterium sp. N-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA存在同源性，以此設計引物。利用PCR 技術，在引物 I (ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC)、引物 2 (TTAGGGCAGATAGCC ACCG)的作用下以來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中的總基因組DNA為模板克隆長約O. 75kb的鹵醇脫鹵酶基因片段。將該片段連接到PMD18-T載體上獲得克隆載體 pMD18-T-Deh和轉化了 pMD18-T_Deh的重組大腸桿菌。對重組質粒測序，并利用軟件對測序結果進行分析，該序列含有一個長為735bp的開放閱讀框。該基因核苷酸序列為(SEQ ID NO. I)
IATGCGCATCGCCCTCGTGACTCATGCACGGCATTTTGCAGGCCCCGCCGCCGTCGAGGCG
61CTTACGCGGGATGGCTATACCGTGGTTTGCCACGACGCGAGCTTCGCTGATGCAGCTGM
121CGACAGCGTTTCGAGTCGGAGMCCCGGGCACCATCGCGCTCGCCGAGCAGMGCCCGAG
181CGTCTGGTCGACGCCACGCTGCAGTACGGGGMGCGATCGACACGATCGTCTCGMCGAT
241TACATTCCGCGCCCGATGMTCGGCTCCCGATCGAGGGMCGAGCGAGGCCGACATCCGA
301CAGATGTTCGAGGCGCTCAGCATCTTCCCGATCCTGCTCCTGCAGTCGGCCATCGCGCCG
361CTACGGGCTGCAGGCGGCGCCTCCGTTATCTTCATCACGTCCTCGGTTGGCMGMGCCG
421CTCGCCTACAACCCTCTCTATGGGCCCGCGCGCGCCGCTACCGTCGCGCTTGTCGMTCG
481GCAGCGMGACGCTGTCCCGTGACGGMTCTTGCTCTATGCGATCGGTCCGMCTTCTTC
541MCMCCCGACGTACTTCCCGACGTCGGATTGGGAGMCGACCCCGAGCTCCGGGATCGT
601GTCGAGCGGGACGTGCCGCTCGGTCGCCTCGGCCGTCCGGACGAGATGGGTGCGCTGATC
661 721ACCTTCCTCG GGCTATCTGCCTTCGCGTCG CCTAATGCAGCGCCCATCGTGGGGCAGTTCTTCGCTTTCACCGGT
利用軟件對該基因序列進行分析，推知所述鹵醇脫鹵酶基因編碼SEQ 示的氨基酸序列ID NO. 2 所
IMRIALVTHARHFAGPMVEALTRDGYTVVCHDASFADMERQRFESENPGTIALAEQKPE
61RLVDATLQYGEAIDTIVSNDYIPRPMNRLPIEGTSEADIRQMFEALSIFPILLLQSAIAP
121LRMGGASVIFITSSVGKKPLAYNPLYGPARMTVALVESMKTLSRDGILLYAIGPNFF
181 241NNPTYFPTSD GYLPWENDPELRDRVERDVPLGRLGRPDEMGALITFLASRRMPIVGQFFAFTG
本發明所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCC No M 2012299。
本發明還涉及一株產鹵醇脫鹵酶的新菌株-壤霉菌(Agromyces sp.)ZJB120203，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。
本發明還涉及一種含有所述鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，以及利用該重組載體轉化獲得的基因工程菌。
本發明還涉及所述的基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應用。
本申請發明人根據測序結果設計胞內表達引物3 (CGCCATATGCGC ATCGCCCTCGTGACT C)和弓丨物 4 (CCGCTCGAGTTAGGGCAGATA GCCACCG),以克隆載體PMDlS-T-Deh為模板，通過PCR擴增得到了用于表達的鹵醇脫鹵酶基因。將鹵醇脫鹵酶基因同表達載體pET28b連接，構建了含有齒醇脫齒酶基因的表達重組質粒pET28b-Deh。
將胞內表達重組質粒pET28b_Deh轉化至大腸桿菌BL21菌株中，獲得含有重組質粒pET28b-Deh的重組大腸桿菌BL21/pET28b_Deh，以重組菌為酶源可進行生物催化與轉化。
具體的，所述的應用為構建含有SEQ ID NO 1所示鹵醇脫鹵酶基因的重組載體， 將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細胞。
本發明還涉及所述鹵醇脫鹵酶在微生物轉化1，3- 二氯丙二醇制備環氧氯丙烷中的應用。
本發明還涉及所述鹵醇脫鹵酶(SEQ ID NO 2)在微生物轉化(S) _4_氯_3_羥基丁酸乙酯制備(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。
本發明的有益效果主要體現在提供了一種來源于壤霉菌(Agromyces sp. )CCTCC No M 2012299的鹵醇脫鹵酶及其編碼基因；該鹵醇脫鹵酶基因可與表達載體連接構建得到含該基因的表達重組質粒pET28b-Deh，再轉化至大腸桿菌BL21中，獲得再分別對應轉化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有齒醇脫齒酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源進行生物轉化與催化。本發明鹵醇脫鹵酶作為轉化用酶，以1，3-二氯丙二醇、(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯等為底物，可以進行轉化反應制備環氧氯丙烷、(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯等。
圖I為克隆載體pMD18-T_Deh物理圖譜；
圖2為pET28b_Deh重組質粒物理圖譜；
圖3為鹵醇脫鹵酶基因PCR擴增argrose電泳圖；其中，2飛為利用引物I和引物2擴增得到的鹵醇脫鹵酶基因片段；1為DL2000 DNA Marker ；
圖4陽性重組質粒pET28b_Deh的酶切結構圖；其中，I為λ DNA/Hind III DNA Marker ；2 為 pET28b_Deh/NdeI 樣品；3 為 pET28b_Deh/Xho I 樣品；4 為 pET28b_Deh/Nde I and XhoI 樣品；5 為 DL 2000 DNA Marker 片段。
圖5 為鹵醇脫鹵酶 SDS-PAGE 圖；I :IPTG 誘導的 E.coli BL21/pET28b_Deh ;2 : 未誘導的 E. coli BL21/pET28b-Deh ；3 E. coli BL21, 4 :蛋白質分子量 Marker。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此
實施例I :
用核酸快速提取儀提取壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC No M 2012299菌體的總基因組DNA，以該基因組DNA為模板，在引物I (ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC )和引物2 (TTAGGGCAGATAGCC ACCG)的作用下進行 PCR 擴增。
PCR 反應體系各組分加入量(總體積 100 μ L) :10XPfu DNA Polymerase Buffer10 μ L (Mg2+)，IOmM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM)0. 5 μ L，濃度為 50 μ M 的克隆引物I、引物2各0.5 μ L，基因組DNA IyL7Pfu Taq DNA Polymerase I μ L，無核酸水 86. 5 μ L0
采用Biorad的PCR儀，PCR反應條件為預變性94°C 3min,然后進入溫度循環 940C 30s, 600C 30 s，72°C I. 5min，共 30 個循環，最后 72°C延伸 lOmin，終止溫度為 8°C。
取10 μ L PCR反應液用O. 9%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3在750bp左右出現明顯條帶。切膠回收該片段并純化，直接同T載體進行連接，得到克隆重組質粒pMD18-T-Deh (質粒圖譜參見圖I)。將該重組質粒電轉化至大腸桿菌JM109中，利用籃白斑統進行篩選， 隨機挑取白色克隆測序，利用軟件分析測序結果，結果表明經引物I和引物2擴增到的核苷酸序列長度為735bp (SEQ ID NO :1)，該序列編碼一個完整的開放閱讀框。
實施例2:
根據實施例I分析結果設計引物3 (CGCCATATGCGCATCGCCCTC GTGACTC)和引物4 (CCGCTCGAG TTAGGGCAGATAGCCACCG)，并分別在引物3和引物4中引入了 Nde I和XhoI限制性酶切位點。在引物4和引物4的引發下,利用高保真Pfu DNA聚合酶(fermentas)進行擴增，獲得長為735bp的鹵醇脫鹵酶基因片段(SEQ ID NO :I)，測序后利用Nde I和XhoI限制性內切酶(fermentas)對擴增片段進行處理，并利用T4 DNA連接酶(TaKaRa)將該片段同用相同的限制性內切酶處理的商業化載體pET28b進行連接，構建表達載體pET28b-Deh。 將構建的胞內表達載體pET28b-Deh電轉化至大腸桿菌BL21 (Invitrogen)中，涂平板37°C 下培養過夜，隨機挑取克隆抽提質粒進行酶切鑒定，鑒定結果見圖4。
實施例3
將實施例2、驗證后的含有胞內表達重組質粒pET28b_Deh的重組大腸桿菌BL21/ pET28b-Deh分別用含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養基培養12h，再以1%接種量(v/v)接種到新鮮的含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養基中，培養至菌體濃度 OD600約O. 6左右，再向LB液體培養基加入終濃度為O. 5mM的IPTG，誘導培養IOh后，4°C、 IOOOOrpm離心lOmin，收集含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細胞。
實施例4
以實施例3中獲得的含有胞內表達重組質粒的重組大腸桿菌BL21/pET28b_Deh 濕菌體作為轉化用酶，以1，3-二氯丙二醇為底物，進行轉化反應制備環氧氯丙烷。轉化體系組成及轉化操作如下IOmL磷酸鹽緩沖液(pH 8)中加入O. 2g濕菌體和O. 5% (v/ v)的 I, 3- 二氯丙二醇,30°C搖床150r/min條件下反應60 min,加入丙酮中止反應。
采用氣相檢測環氧氯丙烷的濃度，采用氣相色譜Agilent 6890N測定，色譜柱類型BGB-175毛細管柱；色譜條件柱溫90°C，進樣室溫度220°C，FID檢測器220°C，氦氣流量為1.6mL/min ;分流比為40:1。酶活單位(U)定義為在30°C、pH 8. O條件下，在Imin 內催化1，3-二氯丙二醇生成IMfflol環氧氯丙烷所需要的酶量定義為IU。根據體系中環氧氯丙烷的生成量推知重組菌酶活。測定結果見表I。
表I :以重組大腸桿菌BL21/pET28b_Deh為酶源測定的鹵醇脫鹵酶活力測定結果
權利要求
1.一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.編碼權利要求I所述鹵醇脫鹵酶的基因。
3.如權利要求2所述的基因，特征在于所述基因的核苷酸如SEQID NO. I所示。
4.如權利要求2所述的基因，特征在于所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCCNo M 2012299。
5.壤霉菌(Agromycessp. ) ZJB120203，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。
6.一種含有權利要求2所述鹵醇脫鹵酶基因的重組載體。
7.權利要求2所述的基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述的應用為構建含有SEQID NO. I所示鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細胞。
9.權利要求I所述鹵醇脫鹵酶在微生物轉化1，3-二氯丙二醇制備環氧氯丙烷中的應用。
10.權利要求I所述鹵醇脫鹵酶在微生物轉化(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯制備(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種源自壤霉菌(Agromyces sp.)的鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，以及其在制備環氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。該鹵醇脫鹵酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼基因序列如如SEQ ID NO.1所示。本發明的有益效果主要體現在提供了一種來源于壤霉菌(Agromyces sp.)CCTCC NoM 2012299的鹵醇脫鹵酶及其編碼基因；該鹵醇脫鹵酶基因可與表達載體連接構建得到含該基因的表達重組質粒pET28b-Deh，再轉化至大腸桿菌BL21中，獲得再分別對應轉化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有鹵醇脫鹵酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源進行生物轉化與催化。
文檔編號C12N15/63GK102978193SQ20121045531
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者鄭裕國, 薛鋒, 柳志強, 萬南微, 高愛存, 沈寅初 申請人:浙江工業大學