專利名稱：重組耐熱短鏈脫氫酶基因、編碼酶、載體、工程菌及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組耐熱短鏈脫氫酶基因、基因編碼酶、重組載體、工程菌及基因編碼酶在制備光學手性醇中的應用。
背景技術：
短鏈脫氫酶屬于羰基還原酶(EC1. I. I. 184)。在生物體中，羰基還原酶既可將酮底物還原為相應的醇，也可催反向反應，將醇氧化為相應的酮或醛；這些反應需要輔助因子的存在，如NADH、NADPH、NAD或NADP。其中NADH、NADPH作為電子供體，NAD、NADP作為電子受體。在工業上，羰基還原酶已被越來越多的用于還原各類酮產生相應的手性醇；催化形式既可以是全細胞，也可以是純化過的酶。從實際成本的角度考慮，羰基還原酶在應用于酮還原反應時，往往會涉及到一個輔酶再生系統，如利用葡萄糖脫氫酶(GDH)或甲酸脫氫酶(FDH)進行輔助因子(NADH或NADPH)的再生，從而顯著減少輔助因子的用量。 根據底物特異性和酶的動力學參數，羰基還原酶主要分為醛酮還原酶家族、短鏈脫氫酶家族和中鏈脫氫酶家族。鑒于有機合成反應中化合物的多樣性及反應環境的復雜性，有必要找到更多熱穩定較好的羰基還原酶。
發明內容
本發明目的是提供一種重組耐熱短鏈脫氫酶基因、基因編碼酶、重組載體、工程菌及基因編碼酶在制備光學手性醇中的應用。本發明采用的技術方案是一種重組耐熱短鏈脫氫酶基因，所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因具有與SEQ IDNo. I所示核苷酸序列90%以上同源性，優選所述基因核苷酸序列為SEQ ID No. I所示，所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因還包括SEQ ID No. I所示核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸序列取代、缺失或添加獲得的核苷酸序列。進一步，SEQ ID No. I所示核苷酸序列全長為747bp，其編碼序列從第一個堿基起至第744堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，該序列無內含子。所述SEQ ID No. I所示核苷酸序列為atgggcttca aagataaagt ggttgtggtt accggctctg gtcgtggcat tggtcgcagt 60atcgccaaaa tgtatgcaga acatggtgcg aaagtggtta tcgcggatcg taactttcag 120gaagccctgg aaacggaacg cctgatttct gaagaaggcg gtgaagccat ggcagtgctg 180gcggatgtta gtaaaccgga agatgtgatc aacctgatgg aaaaaatcga aaaaagctat 240ggccgtctgg atattctgat caacaatgcc ggctttggtt gctggaaaag cccgtacgat 300ctgaccgtgg aagaatggga ttctgttatc aacaccaatc tgcgtggcac gttcctgtgt 360agccgcgaag cggccaaaat tatgaaaaaa ggcggtggcg gtgcaattgt gaacatcgcc 420agtacccgcg caatcatgag cgaaccgaat agcgaatctt atgcagcgtc taaaggtggt 480atcctggcac tgacgcacgc actggcaatt agtctgggtc cggatcgtat tcgcgttaac 540
gcaatcagcc cgggctggat tgaaaccggt gaatacgaaa aactgcgtga aatcgatcat 600ctgcagcacc cggcaggtcg tgtgggtaaa ccggaagtaa ttgcacgcgc gtgcctgttt 660ctgaccgcag aagaaaacag cttcatcacg ggtgcgaatc tggttattga tggcggtatg 720acccggaaga tgatttatga accatag747本發明提供一種由所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶。進一步，所述重組耐熱短鏈脫氫酶具有與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，優選所述重組耐熱短鏈脫氫酶的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示。由于密碼子的兼并性，編碼SEQ ID No. 2的氨基酸序列的堿基序列不僅僅局限于SEQ IDNo. 1，如不同于SEQ ID No. 1，但編碼的氨基酸序列與SEQ ID No. I所編碼的氨基·酸序列相同的核苷酸序列；或者是在保持由該重組耐熱短鏈脫氫酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO :2所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。所述氨基酸序列SEQ. ID NO :2為Met Gly Phe Lys Asp Lys Val Val Val Val Thr Gly SerI5 10Gly Arg Gly lie Gly Arg Ser lie Ala Lys Met Tyr Ala1520 25Glu His Gly Ala Lys Val Val lie Ala Asp Arg Asn Phe3035Gln Glu Ala Leu Glu Thr Glu Arg Leu lie Ser Glu Glu4045 50Gly Gly Glu Ala Met Ala Val Leu Ala Asp Val Ser Lys5560 65Pro Glu Asp Val lie Asn Leu Met Glu Lys lie Glu Lys7075Ser Tyr Gly Arg Leu Asp lie Leu lie Asn Asn Ala Gly8085 90Phe Gly Cys Trp Lys Ser Pro Tyr Asp Leu Thr Val Glu95100Glu Trp Asp Ser Val lie Asn Thr Asn Leu Arg Gly Thr105110 115Phe Leu Cys Ser Arg Glu Ala Ala Lys lie Met Lys Lys120125 130Gly Gly Gly Gly Ala lie Val Asn lie Ala Ser Thr Arg135140Ala lie Met Ser Glu Pro Asn Ser Glu Ser Tyr Ala Ala145150 155Ser Lys Gly Gly lie Leu Ala Leu Thr His Ala Leu Ala160165
He Ser Leu Gly Pro Asp Arg He Arg Val Asn Ala He170175180Ser Pro Gly Trp He Glu Thr Gly Glu Tyr Glu Lys Leu185190195Arg Glu He Asp His Leu Gln His Pro Ala Gly Arg Val200205Gly Lys Pro Glu Asp He Ala Arg Ala Cys Leu Phe Leu 210215220Thr Ala Glu Glu Asn Ser Phe He Thr Gly Ala Asn Leu225230Val He Asp Gly Gly Met Thr Arg Lys Met He Tyr Glu235240245Pro248本發明提供一種含有所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因的重組載體。所述重組載體可通過本領域常規方法將本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，如市售的質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優選質粒為pET28a。較佳的，可通過下述方法制得本發明的重組表達載體將重組耐熱短鏈脫氫酶基因產物和表達載體pET28a均分別用限制性內切酶EcoRI和XhoI雙酶切，形成互補的粘性末端，經T4 DNA連接酶連接，形成含有本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶基因的重組表達質粒pET28a-SDR3。本發明還提供一種含有所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因或所述重組載體的重組基因工程菌。進一步，所述重組基因工程菌可通過將本發明的重組表達載體轉化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領域常規的各種宿主微生物，只要能滿足重組質粒可穩定地自行復制，且所攜帶的本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶基因可被有效表達即可。較佳的，宿主菌是大腸桿菌，更佳的為重組大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。本發明的重組表達轉化體(即重組基因工程菌)可以按照本領域的常規方法制備而得，一般將前述重組載體pET28a-SDR3轉化至E. coli BL21 (DE3)中，即可得本發明優選的重組基因工程菌株，SPE.coli BL21(DE3)/pET28a-SDR3。本發明所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因在制備重組耐熱短鏈脫氫酶中的應用為構建含重組耐熱短鏈脫氫酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至所述宿主體內，將獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離純化得到含重組耐熱短鏈脫氫酶的菌體細胞。此外，本發明還提供一種由所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用是在PH值為6. (Γ8. O的緩沖溶液中，以前手性羰基化合物為底物，以重組耐熱短鏈脫氫酶為酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶NADP+或輔酶NAD+構成反應體系進行生物轉化反應，反應完全后，將反應液后處理獲得所述光學活性手性醇；所述前手性羰基化合物為α-酮酯或脂肪酮。
進一步，所述反應液后處理方法為反應完全后，將反應液用正己烷萃取，取上層有機相，用氮氣吹掃除去正己烷，獲得所述光學活性手性醇。進一步，所述重組耐熱短鏈脫氫酶是以含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞或菌體細胞破碎后的上清液作為酶源，以含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞為酶源時，所述酶源的質量用量以菌體細胞的干重計為1 10 g/L (即酶源的用量為I 20U/L反應體系)，優選5 g/L。進一步，本發明所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用優選按如下方法進行在PH值為6. (Γ8. O的緩沖溶液中，以前手性羰基化合物為底物，以含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞或菌體細胞經細胞破碎后的上清液凍干作為酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶NADP+或輔酶NAD+構成反應體系，在20 40°C進行生物轉化反應，反應完全后，將反應液用正己烷萃取，取上層有機相，用氮氣吹掃除去正己烷，獲得所述光學活性手性醇；所述底物為α-酮酯、β_酮酯、芳香酮或脂肪酮，優選α-酮酯或脂肪酮，最優選為α-酮酯。 所述的不對稱還原反應的各條件可按本領域此類反應的常規條件進行選擇，所述底物優選如下α -酮酯、脂肪族酮及其他含酮基化合物或醛類化合物，更優選為苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或丙酮酸乙酯等。本發明所述含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞制備方法為將含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌株(E.coli BL21(DE3)/pET28a-SDR3)接種至含50 μ g/ml卡那霉素的LB培養基中培養，在37°C、180r/min下震蕩培養12h，然后將培養液以體積比1:100接種至新鮮的含50 μ g/ml卡那霉素的LB培養基中，在37°C、180r/min下震蕩培養至培養液的光密度0D_達到O. 5 O. 7 (優選O. 6)時，力口入終濃度為O. flmmol/L (優選O. 5mmol/L)的異丙基_ β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37°C、100r/min下繼續誘導8 24小時(優選15h)，將誘導培養液離心，獲得菌體細胞。將菌體細胞重新懸浮于預冷的Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl濃度為10 lOOmM，pH6. 0 8. 0，優選20Mm，pH8. O)后進行細胞超聲破碎，離心收集上清液，再凍干(_80°C干燥48h)就能得到本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶的酶粉，即酶源。本發明由所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用中所述反應液的PH為6 8，通過使用磷酸鹽緩沖液進行控制。所述的磷酸鹽緩沖液較佳的如磷酸-磷酸鉀或磷酸-磷酸鈉緩沖液。磷酸鹽緩沖液的濃度較佳的為O. 05-0. 2mol/L，所述的濃度是指緩沖溶液中共軛酸堿的總濃度。反應過程中也可以滴加堿液，如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水等的水溶液以維持反應液pH恒定在pH 6-8的范圍。更進一步，所述的應用推薦按如下步驟進行將含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞或菌體細胞經細胞破碎后的上清液凍干獲得的酶粉作為酶源，懸浮于PH值6. (Γ8. O的緩沖溶液中，分別加入底物、葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶NADP+或輔酶NAD+構成反應體系，在20 40°C下磁力攪拌5 36h，反應結束后，反應液用正己烷萃取，取上層有機相，用氮氣吹掃除去正己烷(或用其它方法蒸干正己烷即可)，獲得所述光學活性手性醇；所述底物為4-甲氧基苯丙酮、環庚酮、3-甲基-2-戊酮、乙酰乙酸乙酯、環戊酮、3-庚酮、2-戊酮、苯乙酮、芐基丙酮、2-己酮、丙酰基乙酸乙酯、4-甲基-2-戊酮、苯甲酰乙酸乙酯、環已酮、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯，優選為丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯；所述底物的初始濃度為I 100g/L反應體系(優選5 10g/L)，所述酶源的用量為I 20U/L反應體系(優選20U/L)，所述葡萄糖與底物的質量比為廣2:1 (優選2:1)，所述葡萄糖脫氫酶的用量為I 20U/L反應體系(優選20U/L)，所述輔酶NADP+或輔酶NAD+的終濃度為O. Γ1. OmmoI/L反應體系(優選O. 25^1 mmol/L反應體系)。本發明中，優選重組耐熱短鏈脫氫酶的酶粉為反應催化劑，需要加入輔酶NADP+或NAD+的用量較佳的不超過I. Ommol/L，能達到極其優良的效果。如果用靜息細胞作催化劑則不需要加入輔酶，只需要利用細胞內所含的輔酶即可。本發明所述重組耐熱短鏈脫氫酶的酶活力單位的定義為每分鐘消耗Immol底物所需要的酶量為一個酶活單位(1U)。 本發明中，所述的生物轉化反應的溫度較佳的為20 40°C。所述的生物轉化反應的時間以反應完全為準，一般為5 36小時。不對稱還原反應結束后,可按本領域常規方法從反應液中提取手性醇。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在(1)本發明所涉及的重組耐熱短鏈脫氫酶具有高活性、熱穩定性好，70°C處理15min后仍較為穩定，殘余相對酶活達95%以上；(2)本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶高效高選擇性地制備手性醇類化合物，可以在葡萄糖脫氫酶GDH或甲酸脫氫酶條件下構建輔酶NADPH或NADH循環再生系統，能大大降低反應過程中輔酶的消耗；(3)由于本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶具有較高的熱穩定性，可以回收利用，并且反應體系中只需要額外添加少量的輔酶(輔酶的質量用量為底物質量的1/1000，輔酶在反應體系中的濃度不超過IMm)，極大地降低了生產的成本，且反應條件溫和，對環境友好，操作簡便，在合成藥物手性中間體方面具有很好的工業應用前景。
圖I、為pET28a—SDR3質粒經限制性內切酶EcoR I和Xoh I酶切后產物電泳結果圖，泳道M為Marker DL2000,泳道I為pET28a_SDR3質粒酶切產物。圖2、目的基因表達產物的SDS-PAGE電泳圖，泳道M為蛋白Marker，泳道I為誘導組沉淀，泳道2為誘導組上清，泳道3為對照組沉淀，泳道4為對照組上清。圖3、重組質粒pET28a—SDR3的構建示意圖。圖4、重組耐熱短鏈脫氫酶催化苯甲酰甲酸乙酯制備S-扁桃酸乙酯的液相色譜圖，a為扁桃酸乙酯標準品，b為產物S-扁桃酸乙酯。圖5、EOPB反應后液相色譜圖12. 655分鐘的峰為R-EHPB，峰面積為295743，13. 910分鐘的峰為S-EHPB，峰面積為208899。圖6、丙酮酸乙酯反應后液相色譜圖9. 635分鐘的峰為R-乳酸乙酯，峰面積為93256 ；10. 786分鐘的峰為S-乳酸乙酯，峰面積為28313。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此下列實施例中材料的來源為表達質粒pET28a購自Novagen公司。E.coli DH5a 和 E.coli BL21 (DE3)感受態細胞，2 X Taq PCR MasterMix，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。Clone EZ重組克隆試劑盒購自GenScript公司。LB培養基終濃度組成為100ml蒸懼水中，加入Ig氯化鈉、Ig蛋白胨和O. 5g酵母提取物，自然PH值。 實施例I重組耐熱短鏈脫氫酶基因的高效表達基因和表達載體的人工構建通過對genebank的檢索與分析確定本發明的重組耐熱短鏈脫氫酶基因(SDR3)DNA序列。在保證重組耐熱短鏈脫氫酶的氨基酸序列不變的情況下，將編碼重組耐熱短鏈脫氫酶基因的密碼子，全部換成在大腸桿菌中使用頻率最高的密碼子，改建的由重組耐熱短鏈脫氫酶基因序列推斷出的DNA序列如序列表SEQ ID NO : I所示，在金斯瑞生物科技基因合成序列為SEQ ID NO: I所示的SDR3 DNA。然后將合成的SDR3 DNA克隆到大腸桿菌高效表達載體pET28a中，并經IPTG誘導在E. coli BL21 (DE3)基因工程菌中高效表達。將上述人工合成的重組耐熱短鏈脫氫酶DNA序列(SDR3)用限制性內切酶EcoR I和Xho I進行雙酶切，用割膠回收的方法，回收約750bp大小的DNA片段；用同樣的限制性內切酶酶切pET28a質粒載體，酶切產物用AxyPr印PCR純化試劑盒回收；將回收的750bp目的DNA片段與pET28a載體片段進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。從E.coli DH5a受體菌中提取pGEM_T_SDR3質粒，進行雙酶切檢測鑒定，陽性克隆轉化E.coli BL21(DE3)表達菌株中。重組載體的構建過程見圖3所示，具體實驗方法如下按照超純水，人工合成PGEM-T-SDR3質粒和pET28a質粒、酶切緩沖液、限制性內切酶EcoR I和Xho I的順序加到PCR管中，用槍頭吸打幾次，充分混勻后，用小型離心機離心(3000rpm, I min)將管壁上的液體集中于管底，37°C水浴4h后，95°C水浴10分鐘終止酶切。切取含目的條帶的膠塊后以AxyPr印DNA膠回收試劑盒純化回收750bp目的DNA片段。由于經EcoR I和Xho I酶切的pET28a載體，切掉的片段只有34bp，AxyPr印PCR純化試劑盒只能回收長度大于75bp的DNA片段，所以同樣可以使用該試劑盒選擇性地回收酶切后的線性載體。酶切體系(50μ L):
權利要求
1.一種重組耐熱短鏈脫氫酶基因，其特征在于所述基因具有與SEQ ID No. I所示核苷酸序列90%以上同源性。
2.如權利要求I所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列為SEQ ID No. I 所示。
3.一種由權利要求I或2所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶。
4.如權利要求3所述重組耐熱短鏈脫氫酶的氨基酸序列為SEQID No. 2所示。
5.一種含有權利要求I所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因的重組載體。
6.一種含有權利要求I或5所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因或重組載體的重組基因工程菌。
7.一種由權利要求I所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用，其特征在于所述的應用為在PH值為6. (T8. 0的緩沖溶液中，以前手性羰基化合物為底物，以重組耐熱短鏈脫氫酶為酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶NADP+或輔酶NAD+構成反應體系進行生物轉化反應,反應完全后,將反應液后處理獲得所述光學活性手性醇；所述前手性羰基化合物為a-酮酯或脂肪酮。
8.如權利要求7所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用，其特征在于所述重組耐熱短鏈脫氫酶是以含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞或菌體細胞破碎后的上清液作為酶源。
9.如權利要求8所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用，其特征在于所述的應用為將含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞或將菌體細胞經細胞破碎后的上清液凍干獲得的酶粉作為酶源懸浮于PH值6. (T8. 0的緩沖溶液中，分別加入底物、葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶NADP+或輔酶NAD+構成反應體系，在20 40°C下磁力攪拌5 36h，反應結束后，反應液用正己烷萃取，取上層有機相，氮氣吹掃除去正己烷，獲得所述光學活性手性醇；所述底物為4-甲氧基苯丙酮、環庚酮、3-甲基-2-戊酮、乙酰乙酸乙酯、環戊酮、3-庚酮、2-戊酮、苯乙酮、芐基丙酮、2-己酮、丙酰基乙酸乙酯、4-甲基-2-戊酮、苯甲酰乙酸乙酯、環已酮、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯；所述底物的初始濃度為I 100g/L反應體系,所述酶源的用量為I 20U/L反應體系,所述葡萄糖與底物的質量比為1 2:1，所述葡萄糖脫氫酶的用量為I 20U/L反應體系，所述還原型輔酶NADPH或輔酶NAD+的終濃度為0. ri. OmmoI/L反應體系。
10.如權利要求8、之一所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因編碼的重組耐熱短鏈脫氫酶在制備光學活性手性醇中的應用，其特征在于所述的所述含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞按如下方法制備將含重組耐熱短鏈脫氫酶的重組基因工程菌接種至含50 ii g/ml卡那霉素的LB培養基中培養，37°C、180r/min震蕩培養12h，將培養液以體積比1:100接種至新鮮的含50 ii g/ml卡那霉素的LB培養基中，37°C、180r/min震蕩培養至培養液的0D_達到0. 5 0. 7時，向培養液中加入終濃度為0. f lmmol/L的IPTG，37°C、100r/min繼續誘導培養8 24小時，將誘導培養液離心，取菌體細胞，即為酶源。
全文摘要
本發明公開了一種重組耐熱短鏈脫氫酶基因、編碼酶、載體、工程菌及應用，所述重組耐熱短鏈脫氫酶基因具有與SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性；本發明所涉及的重組耐熱短鏈脫氫酶具有高活性、熱穩定性好，能高效高選擇性地制備手性醇類化合物，可以在葡萄糖脫氫酶GDH或甲酸脫氫酶條件下構建輔酶NADPH或NADH循環再生系統，能大大降低反應過程中輔酶的消耗；本發明方法極大地降低了生產的成本，且反應條件溫和，對環境友好，操作簡便，在合成藥物手性中間體方面具有很好的工業應用前景。
文檔編號C12N1/21GK102952814SQ20121045530
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者陳振明, 賴敦岳, 周碩 申請人:杭州師范大學