專利名稱：一種大白菜eIF(iso)4E.c位點轉座子插入突變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因的突變體及其相關位點特異性分子標記的開發與應用，尤其涉及一種大白菜真核生物翻譯起始因子eIF(iso)4E. c的轉座子插入突變體及該位點特異性分子標記的開發和應用。本發明的突變體能夠為選育含該突變位點的抗病毒大白菜種質提供變異源，位點特異分子標記能夠直接應用于分子標記輔助育種來選擇含有該突變位點的大白菜材料，提高eIF4E突變體的選擇效率，屬于生物技術領域。
背景技術：
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原產于中國，目前在世界各地均有種植。尤其在我國蔬菜的常年供應和淡季蔬菜調劑中已經成為蔬菜產品供給的重要組成部分，因而對人們生活具有重要影響。在大白菜生產過程中，常遭病毒病、霜霉病和軟腐病等病害的威脅。就整體而言病毒病的危害最為嚴重，且沒有普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術。培育抗病毒大白菜新品種是應對病毒病危害的首選途徑[王雪，劉玉梅，李漢霞，張揚勇，方智遠.蕓薹屬作物抗蕪菁花葉病毒育種研究進展.園藝學報.2005,32(5): 939-946]。苗立強等[苗立強，張耀偉，崔崇士 .我國白菜抗病育種研究進展.東北農業大學學報.2008, 37 (4) : 52 9-533]研究發現，我國大白菜病毒病的病原分離物中70%是蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、還有少量黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我國大白菜抗病毒病育種的主攻目標是抗TuMV。
培育抗TuMV大白菜新品種的兩個關鍵要素是擁有豐富的抗TuMV種質資源和高效的育種效率。我國是大白菜原產地，種質資源非常豐富，其中不乏抗TuMV的優良資源，同時也有更多品質優良但不抗病毒的資源。在常規育種實踐中，常通過回交轉育的手段獲得更多遺傳背景豐富的抗性材料。隨著分子標記技術的興起及研究的深入，標記輔助選擇在常規育種操作中已經成為提高選擇效率、縮短育種年限的主要手段。一些跨國的育種集團更是不惜重金把創新資源和開發與重要農藝性狀緊密連鎖的分子標記作為育種攻關的主要內容。
一般而言，要尋找與某農藝性狀緊密連鎖的分子標記，往往需要先選擇在目標性狀方面存在顯著差異的親本，并構建分離群體$2，1 1，8(1，0!1等)，采用混合分群(BSA) 和傳統的分子標記(如RAPD, SRAP, AFLP, SSR等)技術進行分析,用相應的軟件分析所得標記與性狀的連鎖距離，最終得到與目標性狀連鎖的分子標記。目前報道的與大白菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)位點連鎖的分子標記正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所選擇的標記類型不同，所得到的與抗病毒特性連鎖的標記距離亦不同，介于 3. 8-15. 36cM。由于這些標記與性狀的連鎖程度不夠緊密，因而其用于大白菜抗TuMV輔助育種尚有一定的距離。
另一方面，由于擬南芥與大白菜同屬十字花科，其抗病毒相關功能基因已有較深入的研究；同時大白菜的全基因組序列已經公布[Wang et al. , 2011, the genome of themesopoIyploidcrop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-1039]。所以可以將擬南芥功能基因研究的結果和大白菜基因組序列信息結合，直接從抗病毒相關功能基因的角度入手，通過對大白菜自然群體在某一個重要功能基因位點的自然變異入手，尋找抗病毒相關功能基因的突變體；針對突變位點開發位點特異性分子標記(Allelespecific marker, ASM)，則這種標記本身與性狀直接相關，這無疑會使標記輔助選擇更加精準。在抗病毒功能基因研究方面近年來發現，由隱性單基因控制的抗病毒性狀多與真核生物翻譯起始因子4E及其異構體的突變有關。Wittmann等[WittmannS，Chatel H，Fortin MG，Laliberte JF.1nteraction of the viral protein genomelinked of Turnip mosaic virus with thetranslational eukaryotic initiationfactor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybridsystem.Virology.1997,234:84-92]和 L6onard 等[L6onard S，Plante D，WittmannS,DaigneaultNj Fortin MG，LaliberteJF. Complex formation between potyvirusVPg and translation eukaryoticinitiation factor 4E correlates with virusinfectivity. J. Virol. 2000，74:7730-7737]分別證明擬南芥 eIF4E 和 eIF (iso) 4E 可以同TuMV的病毒基因組結合蛋白(VPg)相互作用。這種相互作用的關鍵氨基酸與真核生物自身mRNA翻譯所需的關鍵氨基酸位點不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些氨基酸突變不影響植物自身的生長發育、卻導致病毒與寄主不能發生互作，從而使寄主表現出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜[Ryder EJ. 1970.1nheritance of resistancetocommon lettuce mosaic. Am Soc Horticult Sc1. 95:378 - 379]、Ruffel 在辣椒[RuffelS, DussaultMHj Palloix A,Moury B，Bendahmane A, Robaglia C,Caranta C.2002.A natural recessiveresistance gene against potato virus Y in peper correspondsto the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E) Plant J. 2002Dec;32(6) :1067-75]、Nieto 在舌甘瓜[Nieto C，Piron F，Dalmais M，Marco CF，Moriones E, Gomez-GuillamonML, Truniger V, Gomez P, Garcia-Mas J，Aranda MAj Bendahmane A. 2007. EcoTILLING forthe identification of allelic variants of melon eIF4E，afactor that controlsvirus susceptibility. BMC Plant Biology. 7，34-42]等重要蔬菜作用中已經發現了不少這樣的突變體資源，Yeam 等[Yeam I，Kang BCj Lindeman W，Frantz JDj Faber N，andjahnMM. 2005. Allele-specific CAPS markers based on point mutations in resistancealleles at thepvrI locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NNOj 178-186]在辣椒中針對突變位點開發了相應的位點特異性CAPs標記并用于抗病毒材料轉育時的輔助選擇。從其他作物的eIF4E和eIF (iso) 4E突變及其在抗病毒中的作用推測，大白菜自然群體中也可能存在eIF4E和eIF(is0)4E的突變體，且這種突變可能與大白菜的抗病毒特性有關。我國大白菜種質資源十分豐富，但目前，國內外有關大白菜抗病毒特性與eIF4E和eIF(iso)4E關系的研究很少，涉及的材料極為有限。Rusholme等[Rusholme RL,Higgins EE, Walsh JA, Lydiate DJ. Genetic control of broad-spectrum resistanceto turnip mosaic virus in Brassica rapa (Chinese cabbage). Journal of GeneralVirology. 2007,88:3177 - 3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-0-18為親本，構建BClFl群體，進行抗TuMV (⑶N I和CZEl株系)遺傳研究。結果發現了一個大白菜抗病毒隱性遺傳位點retrOl和一個顯性位點ConTROl, RFLP標記關聯分析分別發現了與retrO I連鎖的標記pN202e I和與ConTRO I連鎖的標記p085e I。進一步采用southern 雜交的手段發現，在A基因組中分別有3個拷貝的eIF4E (分別位于染色體N1、N3和NS)和 3個拷貝的eIF(is0)4E (分別位于染色體N4、N5和NS)。作者根據雜交結果，推測位于第8 染色體上的eIF4E和eIF (iso) 4E可能與ConTROl有關，而位于第4染色體上的eIF (iso) 4E 可能與retrOl有關。文中沒有關于兩個基因的序列信息報道。Jenner等[Jenner CE, Nellist C F，Barker GC, Walsh JA. Turnip mosaic virus (TuMV)isable to usealleles of both eIF4E and eIF (iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa. Mol PlantMicrobe Interact. 2010, 3(11): 1498-1505]從病毒敏感材料 R-0-18 中克隆得到了 eIF4E 和 eIF(iso)4E 各三個拷貝，分別命名為 BraA. eIF(iso)4E. C、BraA. eIF4E. b、 BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4Ε· a>BraA. eIF(iso)4E. b、BraA. eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b和BraA. eIF (iso) 4E. b以外，其余4個基因分別轉化擬南芥At. eIF (iso) 4E功能缺失突變體[Duprat A, Caranta C, ReversF, Menand B, Browning KS, Robaglia C. 2002. The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. The PlantJournal, 32:927 - 934], 然后對所有轉基因株系接種TuMV加拿大株系CDNl，進行病毒敏感性互補實驗。根據病情指數及ELISA結果，發現所轉的四個基因均能使突變體完全或部分恢復對TuMV侵染的敏感性。這表明，在TuMV侵染白菜類蔬菜作物時，eIF4E和eIF (iso) 4E都可能參與病毒與寄主的相互作用。同時作者指出，要想在大白菜中獲得與eIF4E和eIF(iso)4E有關的抗病毒材料，則這幾個基因需同時喪失功能。截止目前，大白菜在上述兩個基因位點的突變及相關突變體檢測的標記開發國內外未見報道。
鑒于此，有必要對我國豐富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各個位點的多態性進行廣泛篩查，以發現各位點可能存在的突變類型；同時針對突變位點與野生型的序列差異，開發與突變體檢測有關的位點特異性分子標記。有以下幾個方面的潛在益處① 可以將該標記用于篩查大白菜種群，提供高效的大白菜突變體檢測手段；②當其他位點發現突變類型時，可以采用同樣的方法開發標記；③當多個位點的突變位于不同的材料中時，可以通過標記輔助選擇手段將多位點的突變聚合在一起，創造廣譜抗TuMV大白菜新種質在培育廣譜抗TuMV大白菜新品種時，可以實現標記輔助選擇，提高育種效率。 由于這種標記直接位于功能基因內部，因此選擇的準確率達100%。發明內容
針對上述現有技術，針對目前大白菜在eIF4E和eIF (iso) 4E基因位點突變體鑒定方面的空白，本發明首先獲一個eIF (iso) 4E. c位點的轉座子插入突變體，其次根據突變位點的序列特點，設計引物，開發了鑒定野生型和突變體的ASM共顯性標記并用于標記輔助選擇。
本發明是通過以下技術方案實現的
一種與大白菜eIF(is0)4E. c野生型和轉座子插入突變體鑒定直接相關的位點特異性顯性ASM標記與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E. c_W，片段大小1216bp，如SEQ IDNo.1所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e. c_I，片段大小4419bp，如 SEQ IDNo. 2 所示。用于鑒別上述特異性顯性分子標記的引物是正向引物PFl :5’ -CGAAGAAGAATATGGCGA-3’ ；反向引物PRl :5’ - AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’ ；如 SEQ ID NO. 3、4 所示。本發明采用同源克隆技術從一份大白菜抗TuMV和一份大白菜感TuMV自交系材料中分別克隆到了 eIF(iso)4E. c基因全序列，將2個序列與GenBank中已經報道的B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E. c比較后，發現來自敏感材料的eIF(iso)4E. c與已經報道的完全一致，而來自病毒抗性材料的eIF(iso)4E. c則在第三內含子區插入了一個3195bp的片段，在NCBI比對時，沒有發現與該插入片段完全同源的序列，但發現部分序列與擬南芥hAT轉座子超家族有部分同源性。因此推斷該突變體是一個轉座子插入突變體。用小寫字 母即eIF(iS0)4e. c2表示，以區別于本課題組之前鑒定的一個eIF (iso) 4E. c堿基缺失突變體 eIF (iso) 4e. cl。由于大白菜有三個eIF(is0)4E基因，且三者之間同源性較高，我們分析了該基因野生型序列的保守序列，在轉座子兩側設計引物，進行一次PCR擴增，野生型只得到較小的條帶，而突變體由于有轉座子插入，得到較大的條帶，一次PCR擴增即可將野生型和突變體同時鑒別出來。該標記為共顯性標記。故雜合型得到兩條帶。所述ASM標記的篩選過程如下(I)以大白菜抗TuMV自交系DaQinBai和TuMV敏感自交系06-247為材料，采用CTAB法，提取兩者的基因組DNA。(2)依據GenBank中已經報道的B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E. c序列，在編碼區上下游設計引物。采用同源克隆技術，從兩份材料中分別克隆得到了其eIF(is0)4E.c并進行測序。(3)將所得eIF(iso)4E. c與R-0-18的eIF(iso)4E. c序列分別進行比較，發現了一處大片段插入突變。(4)將插入部分的序列在NCBI進行BLAST分析，發現插入區域與擬南芥hAT轉座子超家族同源關系最近，據此我們認為該突變體為轉座子插入突變體。(5)用于擴增該基因的引物就是位點特異標記篩選的引物，據此我們認為該引物能夠同時從抗/感材料中將野生型位點和突變位點擴增出來，此即為共顯性位點特異性標記(ASM)。所述標記可以作為分子標記應用于大白菜種質資源鑒定和育種輔助選育，選擇含有DaQinBai中eIF (iso) 4E. c突變類型的種質材料或轉育后代。具體應用方式為利用ASM標記的一套引物對待測個體的基因組DNA進行PCR擴增，檢測擴增片段大小，如果擴增出1216bp的條帶，則為野生型；擴出4419bp的條帶則為突變型；如果同時擴出兩條帶，則為雜合型。本發明的有益效果是由于大白菜eIF4E位點上受多個基因的控制，在同一份材料中多基因同時突變的頻率較低。如果能夠分別在各個位點鑒定出各自的突變體，開發針對各個突變體檢測的位點特異性分子標記，則可以通過聚合雜交并結合分子標記輔助選擇，將多個突變位點聚合在同一份材料中。本發明利用同源克隆技術發現了 eIF(iS0)4E.C位點的一個轉座子插入突變體并開發了鑒定該位點的分子標記。利用該標記可以對回交轉育后代的基因型進行準確選擇，以尋創造遺傳背景更加豐富的突變體材料。其優點具體如下
1.本發明獲得的了一個eIF(is0)4E. c位點大片段插入的突變體，該突變體有可能是導致材料抗病的主要原因，可以為通過回交手段轉育遺傳背景更豐富的突變體提供變異源。在大白菜eIF4E基因序列及突變型研究方面，僅Jenner等(2010)報道了 B. rapa的一個自交系R-0-18的序列，其它突變體未見報道。
2.針對該突變位點大片段插入，在插入位點兩側保守區設計引物，獲得了與野生型和突變體檢測直接相關的位點特異性共顯性標記，該標記的開發可以為種質資源鑒定、 通過回交轉育等手段篩選和培育不同遺傳背景的突變體材料提供輔助選擇工具。本發明的應用可大大簡化篩選手段、縮短轉育年限，避免了常規育種方法中選擇的盲目性。
圖1 :兩份大白菜材料eIF(is0)4E. c基因的擴增(瓊脂糖凝膠電泳)，W為野生型材料06-247的擴增結果，m為突變體材料DaQinBai的擴增結果，DL5000是DNA分子量標準。
圖2 :轉座子插入突變示意圖，圖中雙向箭頭表示轉座子序列插入在野生型 eIF (iso) 4E. c基因的692bp之后，插入片段大小3195bp。
圖3 :插入片段BLAST比對部分結果(第三條示hAT 二聚化功能)。
圖4 :特異引物在回交群體中對部分單株的擴增情況(M =DMA分子量標準DL5000. 從結果可以清楚地確定1-5是突變體單株，6-10是野生型單株)。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例中的實驗方法，如無特別說明， 均為常規方法。
實施例1、不同大白菜自交系材料中eIF(is0)4E. c的克隆
1.1大白菜基因組DNA提取
(I)將大白菜幼苗葉片放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮揮發干，立即轉移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入O. 6ml預熱至65°C的CTAB提取液，融化后，劇烈振蕩混勻樣品，65°C水浴放置40-60分鐘使細胞裂解；
(3)裂解結束后，取出樣品使其完全冷卻至室溫。加入等體積的氯仿 (chloroform),輕輕顛倒使混勻，室溫放置10分鐘；
(4)室溫，12000rpm 離心 15 分鐘；
(5)用移液器小心吸出上層水相，加入新的1. 5ml的離心管中，加入500 μ I的異丙醇(1:1體積)，充分混勻，室溫沉淀IOmin ；
(6) 4°C, 12000rpm 離心 IOmin,小心棄去上清液；
(7) DNA沉淀用lml75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；
(8)重復用75%乙醇洗滌一次DNA沉淀；
(9)去上清，DNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10_15分鐘，DNA略顯透明，加入適當體積(30-50 μ I)的IOmM的Tris. HCl (ρΗ8. O)使沉淀溶解(可放于4°C冰箱溶解過夜)；
(10)紫外分光光度計及l%Agr0Se凝膠電泳檢測DNA濃度及質量。1. 2eIF(iso)4E. c的克隆及序列分析(I)檢索B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E.c基因全序列(GenBank:HM131211.1)，在編碼區上游和下游分別設計正反向引物，PFl:5’-CGAAGAAGAATATGGCGA-3’PRl :5’ -AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’，如 SEQ ID NO. 3,4 所示。(2) PCR擴增在20iil反應體系中，包含IXLA taq buffer ；20ng的基因組DNA ；0. 4iiM正反向引物；0. 25mM dNTPmix; I個單位的LA taq。PCR循環條件95°C預變性5分鐘；接著是95 °C變性30秒，57. 5 °C退火30秒，72 °C延伸5分鐘，35-38個循環，最后72 °C延
伸10分鐘。(3) PCR產物的電泳檢測PCR結束后，取IOiilPCR擴增產物加入IiU IOXloading buffer，在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結束后EB染色，自動凝膠成像系統觀察拍照。結果見圖1。(4) PCR產物的克隆測序電泳確認目的條帶被擴增后，取I Ul PCR擴增產物加I U I pEasy-T3載體室溫連接10分鐘,轉化大腸桿菌感受態細胞Transl-Tl (TransGen :0)501),轉化菌在含50 u g/ml卡那霉素的LB固體平板上37°C倒置培養16小時左右。菌落PCR檢測后挑取陽性克隆委托北京華大基因有限公司進行DNA序列的測定。(5)所克隆的大白菜eIF(iso)4E. c序列分析將來自TuMV抗性材料DaQinBai和感病材料06-247的fcA. eIF(iso)4E. c基因組序列分別于已知的來自R-0-18的BrA.eIF(iso)4E.c進行比較，發現來自TuMV敏感材料06-247的BrA. eIF (iso) 4E. c基因組序列與R-0-18的完全同源，將其命名為BrA.eIF(iso)4E. c，稱為野生型；而來自TuMV抗性材料DaQinBai的BrA. eIF(iso)4E. c有大片段插入，我們將其命名為BrA. eIF(iso)4e. c2，稱為轉座子插入突變體。其序列如SEQID NO. 2所示,插入部位示意圖如圖2所示，即從基因組序列(從起始密碼算起)的第692bp(從起始密碼算起)之后插入，且685-692是插入位點的靶序列(TGTTTGAC，即8_bp hostduplication，簡稱HD)，因為該序列在轉座子序列的下游又重復了一次。同時轉座子區域兩側有 17bp 的末端反向重復(CTGTG (T/G) TTAMATAGCG, Terminal Inverted R印eat 或Inverted Terminal Repeat,簡稱TIR或ITR)。上述兩點是hAT轉座子超家族的典型特征(Rubin E, Lithwick G, Levy AA. Structure and evolution of the hATtransposonsuperfamily. Genetics, 2001, 158(3):949-57)。(6)插入片段功能預測將插入部分的3195bp在NCBI數據庫進行BLAST比對，發現與擬南芥第一染色部分序列同源性較高，其中插入部分第1570bp-2630bp與擬南芥hAT轉座子超家族同源性最高，檢索結果見圖3。由此推斷，我們得到的這個大片段插入的BrA.eIF(iS0)4E.C突變體是個轉座子插入突變體。實施例2共顯性ASM標記的開發及驗證由于BrA. eIF(iso)4E. c和BrA. eIF(iso)4e. c2的基因組序列存在三千多個堿基的插入突變，用于擴增該基因的一對引物保守性較高，可以用于開發標記。我們用擴增該基因的引物在(DaQinBaiX06-247)XDaQinBai的回交群體進行了驗證。具體實施細則如下
(I)回交群體各單株基因組DNA提取如1.1所述。
(2) PCR擴增PCR反應液的配制及擴增條件如1. 2第⑵條所述。
(3)PCR產物的檢測如實施例2所述。檢測結果如圖4所示，M是分子量標準 DL5000,1-10是回交群體的10個單株。從擴增結果可以看出這對引物能夠100%鑒定純合野生型、純合突變體，完 全可以用于種質資源的篩選和育種輔助選擇。
權利要求
1.一種大白菜eIF(iso)4E. c位點轉座子插入突變體,其特征在于與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E. c-W，片段大小1216bp，如SEQ ID No.1所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e. c-1，片段大小4419bp，如SEQ ID No. 2所示。
2.權利要求1所述的大白菜eIF(iso)4E.c位點轉座子插入突變體的引物,其特征在于引物序列如下正向引物 PFl :5’-CGAAGAAGAATATGGCGA-3’ ；反向引物 PRl :5’ - AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’ ；如 SEQ ID Ν0·3、4 所示。
3.權利要求1所述的大白菜eIF(is0)4E.c位點轉座子插入突變體作為特異性分子標記在鑒別大白菜eIF(iso)4E. c位點的基因型中的應用。
4.權利要求2所述的引物在鑒別大白菜eIF(is0)4E.c位點的基因型中的應用。
5.根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于具體應用方式為利用引物對待測個體的基因組DNA進行PCR擴增，檢測擴增片段大小，如果擴增出1216bp的條帶，則為野生型；擴出4419bp的條帶則為突變型；如果同時擴出兩條帶，則為雜合型。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述PCR擴增具體為在20μ I反應體系中，包含 IXLA taq buffer ;20ng 的基因組DNA ;0. 4 μ M正反向引物；O. 25mM dNTPmix;l 個單位的LAtaq ；PCR循環條件95°C預變性5分鐘；接著是95°C變性30秒，57. 5°C退火30秒，72°C延伸5分鐘，35-38個循環，最后72°C延伸10分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種與大白菜eIF(iso)4E.c野生型和轉座子插入突變體鑒定直接相關的位點特異性顯性ASM標記與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E.c-W，片段大小1216bp，如SEQ ID No.1所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e.c-I，片段大小4419bp，SEQ ID No.2所示。本發明利用同源克隆技術發現了eIF(iso)4E.c位點的一個轉座子插入突變體并開發了鑒定該位點的分子標記。利用該標記可以對回交轉育后代的基因型進行準確選擇，以尋創造遺傳背景更加豐富的突變體材料。
文檔編號C12Q1/68GK102994497SQ20121045527
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者劉栓桃, 趙智中, 張志剛, 李巧云, 盧金東 申請人:山東省農業科學院蔬菜研究所