高產安絲菌素發酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了高效大規模生產安絲菌素的發酵工藝，該工藝顯著特征是首先進行補料分批發酵，隨后轉換為重復補料分批發酵。本發明還公開了一種生產安絲菌素的培養基以及由發酵液獲取高純度安絲菌素的精制方法。
【專利說明】高產安絲菌素發酵工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及生產安絲菌素的培養基及一種新型安絲菌素發酵工藝和精制方法，屬于生物工程和生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]1972年S.M.庫普錢等從非洲收集的卵葉美登木中(含量為千萬分之二)首先分離得到美登素，其母核為19-C的大環內酰胺或I型多聚酮類，后來發現珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)也能產生與其類似的多種產物,將之稱為美登素類抗生素，在限定的培養條件下，安絲菌素P-3 (AP-3)是其主要成分。因它對各種腫瘤，如L-1210、P-388白血病、S-180、W-256、路易斯肺癌和體外鼻咽癌均有顯著療效，從而具有巨大的應用前景，例如目前AP-3作為免疫毒素結合劑的方式治療惡性腫瘤的臨床試驗已進入最后階段。因此，未來市場對AP-3的需求將是大量的，從而高效大規模生產AP-3已成為研究熱點之一 O
[0003]高效大規模生產AP-3，主要從三個方面入手。一是獲得AP-3高產菌株，二是得到利于高產菌株生長和代謝的培養基，三是探索應用適合的發酵工藝。目前報道的AP-3高產菌株通過基因改造和誘變的手段獲得。Bandi等(J.Microbiol, biotechnol.(2006),16
(9)，1338~1346)通過將出發菌株ATCC 31565的asm2 (AP-3生成相關基因)刪除，AP-3含量由0.53 mg/L提高到5.0 mg/L，之后通過響應曲面方法優化其培養基組成，AP-3含量提高到 78.3 mg/L ο Daniel 等(J Ind Microbiol Biotechnol (2009 36:1345~1351))分別將asm2和asm39上調表達，使得AP-3含量分別提高到33 mg/L和52 mg/L。辛西亞?郭等通過將菌株ATCC31565經紫外和化學試劑兩輪誘變,獲得變異菌株Actinosynnema pretiosumPF4-4，在其限定的培養基`和補料分批發酵工藝下，900 L/1500 L發酵罐水平AP-3含量達到304mg/L (專利CN 101103120A, WO 03/064610 A2)。這也是目前報道的AP-3最高發酵水平和最大發酵規模。
【發明內容】
[0004]本發明提供了一種安絲菌素高效發酵工藝，其特征在于，首先進行補料分批發酵，隨后轉換為重復補料分批發酵。在一個實施方案中，在補料分批發酵階段，使用發酵培養基發酵一段時間后，向發酵液中加入異丁醇，繼續發酵一段時間后，向發酵液中流加葡萄糖；繼續發酵一段時間后，進入重復補料分批發酵階段，放掉發酵液的一部分，補加發酵培養基并向發酵液中加入異丁醇，一段時間后，向發酵液中流加葡萄糖。
[0005]在一個實施方案中，在所述發酵工藝的補料分批發酵階段,使用發酵培養基發酵2~3天后，向發酵液中加入0.10-0.30%(v/v)的異丁醇，發酵進行4飛天后，向發酵液中流加葡萄糖，流加速率為3~10 g/L/d ;發酵進行8~12天后，進入重復補料分批發酵階段，放掉發酵液的30~50%，補加發酵培養基并向發酵液中加入0.10-θ.30%(v/v)的異丁醇，在重復補料分批發酵階段開始2~4天后，向發酵液中流加葡萄糖，流加速率為3~10 g/L/d，重復補料分批發酵階段持續時間為7~10天。
[0006]在一個實施方案中，所述發酵工藝參數為，接種量為發酵培養基的0.3%~10.0%(v/V)，溫度 25~30。。，pH 6.8~7.6，DO (溶氧)20%~60%，壓力 0.03~0.08 MPa，通氣量 0.1-θ.6VVM (air volume/culture volume/min,通氣比)，攬拌速度 100~300 rpm。
[0007]在一個優選的實施方案中，所述發酵工藝參數為，接種量為發酵培養基的6.0%(v/V)，溫度 28°C，pH 7.3，DO 40%，壓力 0.05 MPa，通氣量 0.4 VVM，攪拌速度 160 rpm。
[0008]在一個實施方案中，所述發酵工藝中pH的控制是通過自動流加NH3 *!120和30%醋酸來實現的。
[0009]在一個實施方案中，所述發酵工藝使用的菌種為珍貴橙色束絲放線菌ATCC31565。發酵種子為利用發酵培養基，從珍貴橙色束絲放線菌的平板上挑取單菌落，在28 0C 260 rpm搖床培養4~6天獲得的。
[0010]在一個實施方案中，所述發酵工藝使用的發酵培養基，其碳源為乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、糊精、果糖及葡萄糖中的一種或其混合，其氮源為花生餅粉、大豆粉、酵母粉、蛋白胨、玉米漿、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸中的一種或其混合。其中，碳源比例為0.2%~6.0%，氮源比例為0.1%~3.0%。
[0011]在一個優選的實施方案中，所述發酵培養基的碳源為0.3%~4.0%葡萄糖和
0.2%~2.0%糊精的混合；氮源為0.3%~3.0%玉米漿、0.1%~0.5%甘氨酸及0.1%~0.5%纈氨酸的混合。
[0012]在一個更優選的實施方案中，所述發酵培養基的碳源為2.6%葡萄糖和1.5%糊精的混合；氮源為1.0%玉米漿、0.2%甘氨酸及0.2%纈氨酸的混合。
[0013]在一個實施方案中，所述發酵培養基還含有0.P/ι.0%CaCl2.2H20、
0.1%~1.0%ΚΗ2Ρ04、0.1%~1.2%ΝΗ3.H2O 及 0.01%~0.3% 消泡劑。
[0014]在一個優選的實施方案中，所述發酵培養基中CaCl2.2Η20含量為0.5%，KH2PO4含量為0.2%, NH3.H2O含量為0.15%,消泡劑含量為0.05%。
[0015]本發明還涉及在發酵完成后，用水溶性提取試劑從發酵液中純化安絲菌素，具體地包括如下步驟:
[0016](I)滅活發酵液中微生物；
[0017](2)向發酵液中加入50%~80%提取試劑，實現安絲菌素的抽提及去除固形物；
[0018](3)通過離心或過濾去除菌體及固形物，得到發酵上清液，接著向上清液中加入
0.Ρ/1-θ.3% (質量比)的絮凝劑，靜置6~16 h，以去除殘留物。其中采用的絮凝劑選自硫酸鋁、氯化鐵及硫酸鋁鉀中的一種或其混合；
[0019](4)采用硅膠層析手段，實現初步分離發酵液中安絲菌素；
[0020](5)采取蒸發的方法濃縮安絲菌素；
[0021](6)采取高效液相色譜的方法精制安絲菌素。
[0022]在一個實施方案中，通過加熱和/或調節發酵液pH的方法滅活發酵液中微生物。
[0023]在一個優選的實施方案中，通過將發酵液加熱至60_70°C并維持1.0-2.0 h (攪拌或不攪拌)以滅活發酵液中微生物。
[0024]在一個優選的實施方案中，通過調節發酵液pH為3.0-4.0或pH為10.0-11.0并維持1.0-2.0 h (攪拌或不攪拌)以滅活發酵液中微生物。[0025]在一個實施方案中，所采用的提取試劑是醇類及酸酯類中的一種或其混合，其中醇類選自甲醇、乙醇、丙醇的一種或其混合，酸酯類選自乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯的一種或其混合。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為使用Design-Expert軟件探索不同培養基成分對AP-3發酵影響的2 IV 8-3析因設計效應分析圖(半正態圖，Half-Normal Plot)，其中橫坐標為標準化效應(Standardized Effect),縱坐標為半正態概率(Half_Normal%ProbabiIity)。
[0027]圖2為采用HPLC檢測發酵液中AP-3濃度而建立的AP-3標準曲線。
[0028]圖3為采用葡萄糖檢測試劑盒檢測發酵液中葡萄糖而建立的葡萄糖標準曲線。
[0029]圖4為采用15L-罐發酵，AP_3、pH、PCV (細胞壓縮體積)隨時間變化的過程曲線。
[0030]圖5為采用150L-罐進行補料分批發酵，AP_3、pH、PCV、葡萄糖濃度隨時間變化的過程曲線。
[0031]圖6為采用150L-罐將補料分批發酵和重復補料分批發酵相結合，AP_3、pH、PCV、葡萄糖濃度隨時間變化的過程曲線。
[0032]圖7為使用HPLC檢測AP-3純度的數據。
【具體實施方式】
[0033]提供以下實施例，以方便本領域技術人員更好地理解本發明，所述實施例僅出于示例性目的，并非意在限制本發明的范圍。
[0034]實施例中用于菌種劃線的`平板培養基配方見表1。
[0035]表1.平板培養基配方
[0036]
【權利要求】
1.一種安絲菌素高效發酵工藝，其特征在于，首先進行補料分批發酵，隨后轉換為重復補料分批發酵。
2.如權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，在補料分批發酵階段，使用發酵培養基發酵一段時間后，向發酵液中加入異丁醇，繼續發酵一段時間后，向發酵液中流加葡萄糖；繼續發酵一段時間后，進入重復補料分批發酵階段，放掉發酵液的一部分，補加發酵培養基并向發酵液中加入異丁醇，一段時間后，向發酵液中流加葡萄糖。
3.如權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，在補料分批發酵階段，使用發酵培養基發酵2~3天后，向發酵液中加入0.10-0.30%(ν/ν)的異丁醇，發酵進行4飛天后，向發酵液中流加葡萄糖，流加速率為3~10 g/L/d ;發酵進行8~12天后，進入重復補料分批發酵階段，放掉發酵液的30~50%，補加發酵培養基并向發酵液中加入0.10-θ.30%(ν/ν)的異丁醇，在重復補料分批發酵階段開始2~4天后，向發酵液中流加葡萄糖，流加速率為3~10 g/L/d，重復補料分批發酵階段持續時間為7~10天。
4.如權利要求1所述的發酵工藝，其參數為，接種量為發酵培養基的0.39Tl0.0% (ν/V)，溫度 25~30。。，pH 6.8~7.6，DO (溶氧)20%~60%，壓力 0.03~0.08 MPa，通氣量 0.1~θ.6VVM (air volume/culture volume/min,通氣比),攬拌速度 100~300 rpm ;進一步優選為，接種量為發酵培養基的6.0% (v/v)，溫度28°C, pH 7.3，D040%，壓力0.05 MPa，通氣量0.4VVM，攪拌速度160 rpm。
5.如權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于使用的發酵菌種為珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema Pretiosum) ATCC 31565 及其衍生菌株。
6.一種用于權利要求1-5任一項所述發酵工藝的發酵培養基,其中碳源為0.3%~4.0%葡萄糖和0.2%~2.0%糊精的混合；氮源為0.3%~3.0%玉米漿、0.1%~θ.5%甘氨酸及0.1%~0.5%纈氨酸的混合。
7.如權利要求6所述的 發酵培養基，其中所述碳源為2.6%葡萄糖和1.5%糊精的混合；所述氮源為1.0%玉米漿、0.2%甘氨酸及0.2%纈氨酸的混合。
8.如權利要求6所述的發酵培養基，其還含有0.1%~1.0%CaCl2.2Η20、0.1%~?.0%ΚΗ2Ρ04、0.1%~1.2% NH3.H2O 及 0.01%~0.3% 消泡劑；其中 CaCl2.2Η20 含量優選為 0.5%,KH2PO4含量優選為0.2%，NH3.H2O含量優選為0.15%，消泡劑含量優選為0.05%。
9.如權利要求1所述的發酵工藝，其還包括在發酵完成后，用水溶性提取試劑從發酵液中純化安絲菌素，具體地包括如下步驟: (1)滅活發酵液中微生物； (2)向發酵液中加入50%~80%提取試劑，實現安絲菌素的抽提及去除固形物； (3)通過離心或過濾去除菌體及固形物，得到發酵上清液，接著向上清液中加入0.1%~0.3% (質量比)的絮凝劑，靜置6~16 h，以去除殘留物，其中采用的絮凝劑選自硫酸鋁、氯化鐵及硫酸鋁鉀中的一種或其混合； (4)采用硅膠層析手段，實現初步分離發酵液中安絲菌素； (5)采取蒸發的方法濃縮安絲菌素； (6)采取高效液相色譜的方法精制安絲菌素。
10.如權利要求9所述的發酵工藝，所述提取試劑是醇類及酸酯類中的一種或其混合，其中醇類選自甲醇、乙醇、丙醇的一種或其混合，酸酯類選自乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯的一種或其混合。
【文檔編號】C12R1/01GK103805648SQ201210453649
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月13日 優先權日:2012年11月13日
【發明者】董清風, 譚炳華 申請人:百奧泰生物科技(廣州)有限公司